粪便药代动力学对于优化治疗策略和评估胃肠动力至关重要。然而，使用高分辨率粪便浓度随时间变化数据进行的经验研究仍然有限，尚未充分阐明粪便药物浓度的时间分布和个体间变异的详细信息。特别是，在口服给药后准确评估粪便药物浓度对于理解药物的胃肠道药代动力学和消除机制至关重要。迄今为止，药代动力学参数已通过非参数方法从粪便药物浓度的时间序列数据中得出。
万古霉素（VCM）是一种主要用于治疗革兰氏阳性菌感染的糖肽类抗生素。当口服时，系统吸收极少，导致粪便浓度高。在疑似艰难梭菌感染的人类患者中，已测量了粪便VCM浓度和排便频率，并讨论了剂量与粪便药物浓度之间的关系。尽管其临床重要性，但具有高时间分辨率的定量研究尚未广泛进行。此外，传统的非参数分析往往无法解释导致药物转运和排泄变异性的潜在动力学机制。因此，为了加深我们对药物在胃肠道中行为的理解，有必要开发生理上可解释的药代动力学模型。
在这项研究中，我们通过高频粪便采样和并行量化粪便药物浓度，表征了C57BL/6N小鼠口服VCM后的粪便药代动力学。我们的目标是建立一个生理上可解释的框架，通过构建一个捕捉稳健观察到的数据特征的最小药代动力学模型来准确描述药物转运动力学。
万古霉素的粪便药代动力学
为了评估粪便VCM浓度的详细时间变化，我们进行了高频粪便采样和抗生素浓度的并行量化。我们使用了两种万古霉素剂量：1 mg/mL，这对应于小鼠研究中用于口服治疗的典型浓度；和20 mg/mL，选择该剂量是为了评估潜在的非线性药代动力学和剂量依赖性对胃肠动力的影响。在初始时间点（第0天，12:00），低剂量组（1 mg/mL，L1–L3）和高剂量组（20 mg/mL，H1–H3）的小鼠分别接受了0.5 mL VCM的口服给药。粪便样本以最少4小时的间隔收集。经过固相萃取柱纯化后，通过将LC-MS/MS测量的质量归一化到粪便质量来计算粪便中的VCM浓度。
结果显示，两组小鼠的粪便VCM浓度在给药后逐渐增加，达到峰值后呈指数衰减。从这些数据中得出的药代动力学参数总结在表1中。使用梯形法在抗生素检测期间（图2中的阴影区域）计算曲线下面积（AUC）。通过从峰值时间（t_max）到消除时间（t_elim）的对数浓度线性回归估计消除速率常数（k_e）。与低剂量组相比，高剂量组始终显示出更高的C_max和AUC，以及更长的t_elim。由于在AUC/剂量和C_max/剂量之间未观察到显著差异（t检验，p > 0.05），未拒绝药代动力学的剂量依赖性线性（见补充图S1）。
胃肠转运模型
基于观察到的药代动力学特性，我们构建了一个药代动力学模型来描述抗生素通过胃肠道的转运。图3(a)显示了为描述观察到的药代动力学而开发的肠道转运模型示意图。VCM的粪便浓度在给药后逐渐增加，表明抗生素最初在到达形成粪便的腔室之前被保留。鉴于小鼠的胃和盲肠具有袋状结构，我们开发了一个数学模型，将胃指定为吸收腔室，盲肠指定为排泄腔室。该模型假设VCM在时间t=0时瞬间分布在胃中，然后以恒定速率移动到盲肠，并随后按照一级动力学从盲肠中排出。各腔室之间的过渡过程使用速率方程描述。时间t时VCM的粪便浓度表示为C(t)，由以下方程给出：
[ C(t)= \left{ \begin{array}{ll}
0, & t-t_{\text {tot}}\le 0\
\frac{q}{t_{\text {in}}Ak_e}\left{ 1-\exp (-ke(t-t{\text {tot}}))\right} , & 0< t-t{\text {tot}}\le t{\text {in}}\
\frac{q}{t_{\text {in}}Ak_e}\left{ \exp (-ke(t-t{\text {tot}}-t_{\text {in}}))-\exp (-ke(t-t{\text {tot}}))\right} , & t-t{\text {tot}}>t{\text {in}}
\end{array}\right. ]
其中，(t{\text {tot}}) 表示抗生素通过胃肠道的总转运时间，(t{\text {in}}) 是抗生素以恒定速率输注到盲肠的持续时间，(k_e) 是盲肠的消除速率常数，A表示盲肠内容物的质量。
使用SciPy库中的basinhopping函数对每个小鼠单独进行模型拟合，并使用此函数估计参数 (t_{\text {in}})、(k_e) 和 A。低剂量组的给药剂量设为 q=0.5，高剂量组为 q=10。图3(b)显示了使用估计参数模拟的每个小鼠的浓度曲线，证明该模型能够准确捕捉个体药代动力学趋势。估计的参数总结在表2中。
抗生素从胃到盲肠的转运时间（(t_{\text {in}})）在低剂量组（L1–L3）中估计为4.1至7.8小时，而在高剂量组（H1–H3）中通常更长，范围为7.1至25小时，表现出相当大的个体间变异性。H1和H2显示出特别长的转运时间，为23至25小时。盲肠的消除速率常数（(k_e)）在各组之间也有所不同：低剂量组范围为0.35至0.66，但在高剂量组较低（0.16–0.58），H1和H2显示出特别低的值。盲肠内容物的质量（A）在H3中特别高（0.76 g），但在其他个体之间未观察到显著差异。图3(c)和3(d)显示了使用低剂量和高剂量组的汇总数据进行参数估计的结果。使用100次重采样迭代，每次使用80%的数据构建置信区间。高剂量组表现出更大的个体间变异性，导致模型预测的置信区间更宽。
此外，我们在零级和一级动力学下检查了胃排空，并发现这两种模型表现出定性相似的行为和与数据相当的拟合优度。在人类中，液体摄入后胃排空遵循一级动力学，而固体食物则观察到线性阶段。此外，连续进食往往导致指数型胃排空，而较长的进餐间隔则有利于零级排空。因此，胃排空取决于食物的物理特性和进食模式，实际上可能涉及零级和一级动力学的混合。然而，仅根据粪便药代动力学区分这些机制仍然具有挑战性。
讨论
在这项研究中，我们通过频繁的粪便采样和并行抗生素量化捕获了短时间尺度的粪便药代动力学。粪便药代动力学分析显示，所有小鼠在给药后浓度逐渐增加，然后呈指数下降。此外，粪便VCM浓度呈剂量依赖性，这与在人类和小鼠中报告的发现一致。基于这些特性，我们构建了以胃为滞留腔室、盲肠为分布腔室的肠道转运模型。该模型是最小框架，可以重现延迟浓度增加和指数衰减。将模型拟合到每个小鼠的粪便浓度时间数据，得到了高精度的生理上可解释的参数。
估计参数的有效性可以根据先前报道的实验数据进行评估。据报道，小鼠的总胃肠道转运时间为6-7小时，C57BL/6小鼠的盲肠内容物质量因饮食而异，通常在100至450毫克之间。每个小鼠的(t_{\text {tot}})和A的估计值与这些报告一致，支持参数估计的生理有效性。
虽然盲肠消除速率常数(ke)和胃抗生素转运时间(t{\text {in}})难以通过实验测量，但估计值可以提供关于胃肠道动力学的见解。在我们的模型中，盲肠清除率（CL）表示每单位时间排出的内容物体积，可以计算为CL [g/hr] = (A \cdot ke)。类似地，胃清除率与(t{\text {in}})的倒数成正比。计算的清除率值表明，除了H3之外，高剂量组的清除率往往低于低剂量组，这表明胃肠道动力学减少。虽然先前的研究表明抗生素可能通过微生物群介导的途径影响动力学，但尚不清楚这些效应是否具有剂量依赖性。此外，高剂量条件可能会放大基线个体间清除能力的差异，从而导致变异性的增加。这些因素也可能解释高剂量组中AUC/剂量的变异性。需要进一步研究以澄清这些可能性。
方法
试剂
盐酸万古霉素（VCM）购自富士胶片和光纯化学公司（生化级，大阪，日本）。用作固相萃取（SPE）的Oasis HLB 96孔板（60 mg）购自沃特世公司（米尔福德，马萨诸塞州，美国）。蒸馏水来自密理博Milli-Q水净化系统（MSD株式会社，东京，日本）。甲酸（> 98 %，LC/MS级）购自MSD株式会社（东京，日本）。乙腈（LC/MS级）购自关东化学有限公司（东京，日本）。EDTA-Na2溶液（0.5 M）购自默克公司（达姆施塔特，德国）。EDTA提取液通过将pH 4.0柠檬酸缓冲液和乙腈按55:45 [v/v]混合，并添加0.5 M EDTA-Na2溶液至最终浓度为0.2 % [v/v]制备。
小鼠和粪便样本收集
所有实验均使用8周龄的C57BL/6N雄性常规小鼠，购自CLEA日本公司。所有小鼠都放在隔离笼中，并在夜间用塑料片遮暗，位于庆应义塾大学医学院的实验室动物中心。小鼠自由进食（CL-2，CLEA日本公司）和饮水。小鼠实验包括三组处理组，每组三只小鼠，具体取决于第0天12:00（实验开始设定为第-3天）口服给药的VCM浓度。第一组是对照实验组（C1、C2和C3），这些小鼠在第0天仅口服水。其他两组是低浓度组（L1、L2和L3）和高浓度组（H1、H2和H3），这些小鼠在第0天12:00分别口服0.5 mL溶解在水中的1和20 mg/mL VCM。粪便样本每天-3至3天的12:00、16:00、20:00、0:00、4:00、8:00，第4天的12:00、16:00，此后每1至7天的12:00直至第36天收集。样品在液氮中快速冷冻，然后储存在-80°C。
动物研究获得了庆应义塾大学机构动物护理和使用委员会（15072）的批准，所有实验均按照相关机构和国家指南和规定进行。在进行这些实验时遵循了ARRIVE指南。
抗生素的量化
预处理
预处理和固相萃取（SPE）的实验条件遵循Opris等人的研究。称量的粪便样本浸入0.5 mL的EDTA提取液中，并用研磨器在微量管中研磨。然后在45°C、40 kHz下进行超声提取10分钟，接着以15,000 rpm离心3分钟。收集上清液并用pH 4.0甲酸缓冲液稀释至4 mL。
固相萃取
HLB柱通过依次通过2 mL甲醇和2 mL蒸馏水进行预处理。此后，每个样品的4 mL以1 mL加载到柱中，并用2 mL pH 4.0甲酸缓冲液冲洗。然后将柱真空干燥10分钟，并用1 mL 60 % [v/v]甲醇/水溶液洗脱。最后，将洗脱液通过0.22 μm注射器过滤器（PVDF膜，默克）过滤。
为了确定使用SPE方法的VCM回收率，对照实验组的10、20、30、40和50 mg粪便样本分别加标2、4、6、8和10 μg的VCM进行提取。VCM回收率为91.5–138 %。
质谱
每个溶液通过液相色谱/串联质谱（LC/MS-MS）使用Xevo TQD MS（沃特世公司）结合Acquity UPLC H-class（沃特世公司）进行分析。色谱分析使用ACQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm长度 × 3.0 mm内径，1.8 μm粒径，沃特世公司）。柱温维持在40°C，流速和进样体积分别为0.3 mL/min和5 μL。乙腈（流动相A）、蒸馏水（流动相B）和含有1 % [v/v]甲酸的蒸馏水（流动相C）用作流动相溶液。流动相A、B和C的初始组成分别为10、89和1 % [v/v/v]，并在注射后保持2分钟。随后，流动相A的组成在3分钟内增加到90 %并保持5分钟。此后，它减少到1 %并保持5分钟以实现平衡。流动相C在整个梯度周期中保持在10 %。分析在正电喷雾电离模式下进行。MS离子源参数如下：源温度，120°C；去溶剂化温度，500°C；毛细管电压，2.0 kV；去溶剂化气流，1,000 L/h；锥孔气流，50 L/h。数据采集在选定反应监测（SRM）模式下进行。分析物的质量转换离子对、锥孔电压（CV）和碰撞能量（CE）分别为m/z 725.00 > 144.10、30 V和30 eV。VCM量化使用外标法进行。校准标准品在分析前立即制备。校准曲线在0.01–1.0 μg/mL的标准浓度范围内表现出良好的线性，r²值超过0.995。校准曲线的最低浓度定义为定量限。每个样品进行三次进样分析以确保技术重现性。
粪便浓度计算
粪便样品中的抗生素浓度通过将使用LC-MS/MS质谱获得的测量值除以每个粪便样品的湿重来计算。
数学模型
肠道转运模型旨在解释粪便中的抗生素浓度。在小鼠的消化活动中，内容物汇集在胃和盲肠中。胃进入盲肠的流入速率和盲肠的排出速率使用每个器官中的抗生素质量描述，粪便中的抗生素浓度通过给定初始条件求解微分方程来描述。
令(M_a(t)) 和 (Mb(t)) 分别为胃和盲肠中的抗生素质量。假设q [mg]抗生素在t = 0时瞬间到达胃部，并且胃内容物完全排空的时间是恒定的，表示为(t{\text {in}})，胃中抗生素质量的动力学可以建模如下：
[ Ma(t)=q\left( 1-\frac{t}{t{\text {in}}}\right). ]
令(\Delta t{S\rightarrow C}) 为内容物离开胃到通过小肠到达盲肠的时间。当(\Delta t{S\rightarrow C} < t\le \Delta t{S\rightarrow C}+t{\text {in}}) 时，抗生素在盲肠中同时注入和排出，当(t>t{S\rightarrow C}+t{\text {in}}) 时，仅发生排出。因此，盲肠中的抗生素质量(M_b(t)) 如下：
[\frac{\text {d}v{M_b(t)}}{\text {d}t}= {\left{ \begin{array}{ll}
\frac{q}{t_{\text {in}}}-k_eMb(t), & 0<t-\Delta t{S\rightarrow C}\le t_{\text {in}}\
- k_eMb(t), & t-\Delta t{S\rightarrow C}>t_{\text {in}}
\end{array}\right. }. ]
其中(k_e) 是消除速率常数。由于(Mb(t{S\rightarrow C})=0)，微分方程求解如下：
[ M_b(t)= {\left{ \begin{array}{ll}
0, & t-\Delta t_{S\rightarrow C}\le 0\
\frac{q}{t_{\text {in}}k_e}\left{ 1-\exp (-ke(t-\Delta t{S\rightarrow C}))\right} , & 0< t-\Delta t{S\rightarrow C}\le t{\text {in}}\
\frac{q}{t_{\text {in}}k_e}\left{ \exp (-ke((t-\Delta t{S\rightarrow C})-t_{\text {in}}))-\exp (-ke(t-\Delta t{S\rightarrow C}))\right} , & t-\Delta t{S\rightarrow C}>t{\text {in}}
\end{array}\right. }. ]
通过实验获得的值是抗生素相对于粪便的浓度。因此，为了考虑消化道内容物中的抗生素浓度，我们引入一个常数A，并考虑盲肠中以下抗生素浓度(C_b(t))。
[ C_b(t)=\frac{1}{A}M_b(t). ]
此参数A可以解释为盲肠内容物的质量。令(\Delta t{C\rightarrow F}) 为离开盲肠到作为粪便排出之间的时间。粪便中的抗生素浓度，C(t)，可以用盲肠中时间(\Delta t{C\rightarrow F}) 前的抗生素浓度表示，
[ C(t)=Cb(t-\Delta t{C\rightarrow F}). ]
口服剂量作为粪便排出的时间(t{\text {tot}}) 可以表示为(t{\text {tot}}=\Delta t{S\rightarrow C}+\Delta t{C\rightarrow F})。最后，可以使用参数(t{\text {tot}})、(t{\text {in}})、(k_e) 和A计算粪便中的抗生素浓度如下：
[ C(t)= {\left{ \begin{array}{ll}
0, & t-t_{\text {tot}}\le 0\
\frac{q}{t_{\text {in}}Ak_e}\left{ 1-\exp (-ke(t-t{\text {tot}}))\right} , & 0< t-t{\text {tot}}\le t{\text {in}}\
\frac{q}{t_{\text {in}}Ak_e}\left{ \exp (-ke(t-t{\text {tot}}-t_{\text {in}}))-\exp (-ke(t-t{\text {tot}}))\right} , & t-t{\text {tot}}>t{\text {in}}
\end{array}\right. }. ]
我们还测试了一个假设胃内容物被胃液连续稀释，导致胃内容物从胃中一级排空的模型。方程和结果在补充信息中提供。
参数估计
对每个小鼠的粪便浓度时间数据进行参数估计。这种个体水平的拟合使我们能够考虑个体间差异，并避免因高剂量下的非线性药代动力学而导致的潜在偏差。此外，为了评估每剂量组内模型预测的稳健性，我们进行了自助重采样：随机采样80 %的时间点用于估计参数，并重复100次。为了估计参数，我们最小化以下损失函数(L(\theta ))，该函数由数据的平方误差和导数误差的惩罚项组成，以控制过拟合。
[ L(\theta )=\lambda \sum ^{M}_{i=1}\left( y(t_i)-\hat{y}^{\theta }(ti)\right) ^2+(1-\lambda ) \sum ^{M-1}{i}\left( \frac{y(t_{i+1})-y(ti)}{t{i+1}-ti}-\left. \frac{d\hat{y}^{\theta }(t)}{dt}\right| {t=(ti+t{i+1})/2}\right) ^2. ]
其中(y(t_i)) 是采样时间(t_i) 的测量抗生素浓度，(\hat{y}^{\theta }(t_i)) 是使用参数集(\theta) 在时间(t_i) 估计的抗生素浓度，(\lambda) 是惩罚系数。对于本研究中执行的所有估计，(\lambda) 设置为0.9。使用SciPy库中的basinhopping函数执行损失函数的最小化。
数据可用性
所有数据和脚本均可在Github上获取（https://github.com/rie-maskawa/Fecal-pharmacokinetics）。
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