细胞衰老是一种不可逆的细胞周期停滞状态，在组织修复、老化和疾病中具有复杂作用。然而，由于识别细胞衰老的不一致性，对其功能意义的结论各不相同。我们开发了一种基于机器学习的方法，通过核形态测量以单细胞分辨率识别衰老细胞。通过应用无监督聚类和降维技术，我们构建了一个强大的流程，用以区分培养系统、新鲜分离细胞群和组织切片中的衰老细胞。本文展示了该方法揭示再生骨骼肌和骨关节炎软骨中与年龄相关的衰老动态模式的能力。我们的方法提供了一种广泛适用的策略，可以在不同的生物学背景下绘制和量化衰老细胞状态，从而评估这种细胞命运如何在生命周期内对组织重塑和退化产生影响。
氧化应激诱导成肌细胞培养中的衰老
为了研究与衰老相关的核表型变化，我们设计了一种体外培养系统，使用过氧化氢（H₂O₂）刺激氧化应激和损伤，以诱导成肌细胞系（C2C12）发生衰老（图1A）。该处理导致表达增殖标志物Ki67的细胞减少、DNA损伤标志物γH2AX的表达增加以及SA-β-gal活性的增强，并呈剂量依赖性（图1B、C）。缺乏Caspase-3染色证实这些细胞并未进入凋亡（图1B）。此外，实时定量PCR（qPCR）验证了处理细胞中的衰老相关分泌表型（SASP）表达谱（图1D）。因此，我们建立了一种H₂O₂处理方案，能够诱导真实的衰老状态，从而为研究相关核形态变化提供了一个可靠的系统。
图1：衰老转化改变核形态
【A】展示了用于识别衰老的核形态测量流程（NMP）示意图（由BioRender创建。Mapkar, S. (2025) https://BioRender.com/w2xaf4w）。【B】H₂O₂处理C2C12细胞以剂量依赖的方式诱导衰老表型。MFI – 平均荧光强度。n = 3次独立实验重复。【C】Spider SA-β-Gal染色的代表性FACS直方图。图表量化了相对于未处理和未染色样本的重复实验。蓝色 – 未处理，红色 – 300 µM，橙色 – 500 µM。n = 3次独立实验重复。【D】通过qRT-PCR评估SASP。n = 4次独立实验重复，每列代表一次重复。绿色 – 表达增加，橙色 – 表达减少，白色 – 与未处理组相当。【E】不同处理组之间核形态的代表性图像和量化结果。注意，图像查找表（LUTs）和曝光时间是一致的。比例尺 – 50 μm。n = 3次独立实验重复。误差条表示平均值 ± 标准误（SEM），统计测试使用未配对双侧t检验，且未进行调整。p ≤ 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001。源数据以源数据文件形式提供。精确的p值列于补充表2。
核形态测量识别出真实的衰老细胞
我们进一步通过DAPI染色检查了与H₂O₂处理相关的核表型，以提供更清晰的核定义。随着H₂O₂浓度的增加，我们检测到核尺寸增大和致密焦点增多，同时伴随着核圆形度和DAPI强度的下降（图1E和补充图1），这些特征各自都被独立地认为与衰老相关。参数对之间的相关强度也随着H₂O₂浓度的增加而增强，表明衰老细胞共享许多这些核形态特征（补充图2A）。为了识别那些共享所有参数并最能指示衰老的细胞，我们应用了一种k-means无监督机器学习算法来划分具有明确形态相似性的群体，并确定共享所有四个参数的衰老核（图2A和补充图2C）。聚类是在包含所有四个参数的标准化特征集上进行的，以保留每个形态特征内部和之间的差异。肘部图和轮廓法被用来划分聚类数量（补充图2B）。为了生成具有单细胞分辨率的二维表示，我们使用均匀流形近似投影（UMAP）对这四个参数进行了降维（补充图2C）。进一步的降维产生了一个一维的“衰老评分”，以实现UMAP内核表型和处理条件之间的直接比较，从而确立了“衰老梯度”（图2B和补充图2D）。通过k-means算法识别的聚类，我们将具有极端形态学特征的细胞标记为真正的衰老细胞。另一类表现出较少极端表型但共享许多这些特征的细胞则被标记为“类衰老”细胞（图2C）。在最高H₂O₂处理样本中，被识别为衰老和类衰老细胞的比例最大（图2C）。处于聚类边界的细胞很可能表示过渡状态，因为它们预计会部分共享核表型特征（图2A、B和补充图2C、D）。
图2：核形态测量定义衰老并可简化为统一评分
【A】通过k-means聚类算法解析的五个组的单细胞核形态UMAP图。插图为每个聚类的代表性核。图像查找表（LUTs）和曝光时间保持一致。比例尺 – 5 μm。【B】进一步降维形成的一维衰老“评分”，与核表型和处理条件相关联。【C】橙色（衰老）和红色（类衰老）聚类表现出强烈的衰老表型，并在柱状图中量化。n = 3次独立实验重复。【D】NMP识别的聚类中衰老相关标志物的量化。MFI – 平均荧光强度；NS – 非衰老；SEN – 衰老。n = 3次独立实验重复。【E】代表性的UMAP图和折线图量化了随着衰老溶解浓度增加SnCs的减少，如NMP所检测到的。灰色 – 未处理，蓝色 – 300 µM，绿色 – 500 µM。小提琴图显示了衰老评分（y轴），表明低分、形态上衰老的核密度下降，如红框所示。比较在处理组内进行。n = 3次独立实验重复。误差条表示平均值 ± 标准误（SEM），统计测试使用未配对双侧t检验，未进行调整，仅（E）使用了双向ANOVA。p ≤ 0.05，p < 0.01，p < 0.001。源数据以源数据文件形式提供。精确的p值列于补充表2。
为了确认由核形态测量流程（NMP）聚类的细胞确实是衰老细胞，我们评估了其细胞周期状态（Ki67）、DNA损伤程度（γH2AX）和SA-β-gal活性（图2D）。NMP识别的衰老核显示出Ki67染色减少、γH2AX平均荧光强度（MFI）增加以及SA-β-gal活性增强（图2D和补充图4A–D），共同支持了衰老表型。具体而言，非衰老聚类中不到3%的核为X-Gal阳性，衰老聚类中不到2%的核为Ki67阳性，而非衰老到衰老聚类中γH2AX表达增加了两倍（图2D）。还检查了每个非衰老聚类，显示基因表达梯度与通向衰老的表型梯度一致（补充图3A、B）。此外，应用衰老溶解剂Navitoclax（ABT-263）处理后，结果显示在最高H₂O₂处理样本中，衰老聚类中的核数量呈剂量依赖性减少（图2E）。
NMP捕获来自各种诱导剂和细胞系的SnCs
为了检查该流程在不同衰老诱导机制中的有效性，我们扩展了衰老诱导剂，包括依托泊苷和阿霉素作为H₂O₂的替代品（图3和补充图4）。依托泊苷和阿霉素都作为拓扑异构酶II抑制剂，引起DNA损伤积累，从而引发DNA损伤反应（DDR）。阿霉素还有增加氧化应激的作用。因此，这两种药物在既定浓度下都是强有力的衰老诱导剂。在用这些小分子处理C2C12细胞后，我们通过验证细胞周期退出（Ki67+细胞减少）、DNA损伤增加（γH2AX染色增加）和SA-β-gal活性增加，证实了剂量响应性衰老诱导（图3A、B）。接下来，我们建立了与衰老表型一致的核形态变化，表现为核尺寸增大和致密焦点增多，核圆形度和DAPI强度降低（图3C、D）。然后部署NMP评估经依托泊苷（图3E和补充图4E–H）或阿霉素（图3F和补充图4I–L）处理的核，生成UMAP以可视化降维后的核形态梯度。标记为衰老的聚类表现出细胞周期退出（Ki67减少）、DNA损伤（γH2AX MFI增加）和溶酶体积累（SA-β-gal活性增加）的特征，证明NMP可以有效识别来自不同机制的SnCs（图3E、F）。
图3：NMP适用于各种衰老诱导机制
【A】【B】C2C12细胞经（A）依托泊苷和（B）阿霉素处理后衰老标志物的量化。n = 3次独立实验重复。【C】【D】经（C）依托泊苷 - Etop 和（D）阿霉素 - Dox 处理的C2C12细胞的代表性图像和核形态量化。注意每种小分子诱导剂的剂量响应。曝光时间和查找表（LUTs）保持不变。比例尺 – 200 μm。n = 3次独立实验重复。【E】【F】通过k-means聚类算法解析的五个组的大UMAP图，分别展示（E）依托泊苷和（F）阿霉素处理后单细胞核形态的降维结果。插图为每个聚类的代表性核。比例尺 – 20 μm。小UMAP图中的一维衰老“评分”与核表型和处理条件相关联，并在小提琴图中呈现剂量依赖性量化。橙色（衰老）和红色（类衰老）聚类表现出强烈的衰老表型，并在水平彩色条形图中量化。n = 3次独立实验重复。灰色条形图是NMP识别为衰老的聚类中衰老相关标志物的量化结果。n = 3次独立实验重复。MFI – 平均荧光强度。NS – 非衰老；SEN – 衰老。误差条表示平均值 ± 标准误（SEM），统计测试使用未配对双侧t检验，未进行调整。p ≤ 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001。源数据以源数据文件形式提供。精确的p值列于补充表2。
我们假设用于NMP的四个核形态测量值在经历衰老的细胞类型中是保守的，从而赋予NMP广泛的适用性。为了验证这一前提，我们用H₂O₂、依托泊苷和阿霉素处理了细胞系3T3-L1前脂肪细胞（补充图5）。选择3T3-L1是因为先前研究表明脂肪组织对衰老有强烈反应，因而可能具有潜在的生物学意义。所有处理均以剂量依赖方式确认了衰老诱导，SASP分析通过实时qPCR完成（补充图5A），Ki67表达减少，γH2AX表达增加（补充图3E、G和补充图5B–D）。需要注意的是，我们无法在衰老的3T3-L1细胞中获得一致的SA-β-gal染色结果，强调了开发跨细胞类型识别SnCs新方法的重要性。随着H₂O₂（补充图5E）、依托泊苷（补充图5F）和阿霉素（补充图5G）处理的增加，核形态变化与描述一致。NMP聚类显示，衰老样和衰老核的数量呈剂量依赖性增加，得分相应减少（补充图6A–C）。通过NMP确认了这些聚类为衰老细胞，其单细胞分辨率显示Ki67表达减少和γH2AX表达增加，适用于H₂O₂（补充图6D）、依托泊苷（补充图6E）和阿霉素（补充图6F）处理。
年龄和损伤塑造肌肉再生过程中的SnC动态
为了将NMP应用于体内SnC的识别，我们研究了稳态和再生中的骨骼肌（SkM），这是一种在不同年龄段均含有SnCs的组织（图4和补充图7）。为了诱导再生，将氯化钡（BaCl₂）注射到年轻（5个月）、老年（24个月）和老年晚期（30个月）小鼠的下肢肌肉中（图4A）。利用我们的NMP，我们分析了3天损伤后（DPI）从未受伤和受伤组织中通过FACS分离的肌肉干细胞（即卫星细胞 - SCs）、间充质干细胞（MSCs，即纤维脂肪祖细胞 - FAPs）、富集的内皮细胞（Enr-ECs）和免疫细胞（ICs），这是单核细胞反应最大的时候，并在21 DPI时肌肉再生基本完成，仅剩持续的重塑和肥大（图4和补充图7）。
图4：NMP识别再生骨骼肌中的衰老动态状态
【A】展示实验方法的示意图（由BioRender创建。Mapkar, S. (2025) https://BioRender.com/mxe0n7o）。【B】–【D】纤维脂肪祖细胞 - FAPs，【E】–【G】：卫星细胞 - SCs。【B】【E】代表性UMAP图减少了核表型，并给出了NMP衍生的衰老评分。相关的热图展示了指定损伤天数（DPI）下的表型差异，红色 – 增加，蓝色 – 减少。相关的小提琴图可视化了评分差异。【C】【F】代表性UMAP图定义了衰老群体中的年龄依赖性细胞表示。圆圈图量化了每种年龄在SnC聚类中的相对表示。蓝色 – 年轻，红色 – 老年，绿色 – 老年晚期。【D】【G】折线图显示了指定DPI的年龄依赖性变化，柱状图表示3 DPI的变化。显著性是相对于未处理组。n = 每个年龄段3次独立生物重复。青色 – 未受伤，紫色 – 3 DPI，橙色 – 21 DPI。【H】不同年龄组在骨骼肌损伤期间对总体衰老贡献的细胞群可视化。富集的内皮细胞 – Enr. ECs。免疫细胞 – ICs。每个条件下所有UMAP细胞数量相等。误差条表示平均值 ± 标准误（SEM），统计测试使用未配对双侧t检验，未进行调整。**p < 0.01，*p < 0.001，**p < 0.0001。源数据以源数据文件形式提供。精确的p值列于补充表2。
最终，为了测试NMP是否可以应用于与SnC负荷相关的其他年龄相关退行性疾病，我们使用该流程评估了老年小鼠原发性骨关节炎中的软骨细胞。老年小鼠的退化性关节软骨与其年轻对照组的健康软骨进行了比较。采用类似的SkM流程分析了富含软骨细胞和免疫细胞的FACS分离细胞。我们发现老年软骨中软骨细胞具有显著的衰老特征，相较于年轻组织中的软骨细胞，SnCs的数量增加了约十倍。这一结果得到了分类软骨细胞中Ki67减少和γH2AX表达增加的支持（补充图15A、B）。老年小鼠的免疫细胞也显示SnCs相较于年轻对照组增加了约三倍（补充图14D）。这些数据支持当前关于关节炎环境中软骨细胞衰老的范式，并证明我们的NMP作为一种强大手段识别初级组织中SnCs的实用性。
讨论
我们的研究建立了一种方法，量化并简化核形态测量，以可靠地识别SnCs，从而绕过目前使用的许多问题重重的检测方法（图1）。NMP的易用性和一致性为SnC识别提供了更高的标准化手段。NMP衍生的评分有助于在同一UMAP内比较核形态测量，而聚类则允许在独立UMAP之间进行比较。这将带来对SnCs在诸如再生和衰老等内源性过程中生物学特性的更好理解，最终帮助更好地针对这些细胞进行治疗。
最近关于使用核形态学的替代学习方法的报告也在特定生物背景下展示了有希望的结果，认识到独特核变化与衰老转换之间的关系。大多数这些系统使用监督学习在富含SnCs的核数据集上训练系统。虽然这些可能揭示与衰老命运选择相关的替代形态，但这些测量可能限于训练数据集。我们的方法使用无监督学习，其中选择的核测量具有广泛的适用性，能够在不同衰老机制、细胞类型和组织类型中准确识别SnCs。聚类和降维在半监督框架内进行了生物验证和解释。我们的NMP的功效通过其在培养、新鲜分选细胞和组织切片中检测SnCs的能力得到证明，这些环境对细胞及其核都有不同的机械影响。仅有极少数表达增殖标志物的核在衰老聚类中被检测到。这些数据承认了NMP中用于衰老表型的基础形态测量的保守性质。
用于NMP的核形态测量特别因其与细胞周期动力学和衰老的直接关系而被识别，这是G1或G2期永久退出的表型。事实上，核大小和DAPI强度与细胞周期阶段有关。这些特征与衰老相关，可能是由于持续的p53表达及随后mTOR失调、应激纤维形成引起的核扁平化，以及Lamin B1降解导致的核皱缩。此外，出现在SnCs中的异染色质焦点表现为高度甲基化的DNA区域，由细胞周期阻滞调节因子（如E2F）的表达增加引起。我们的研究展示了四种形态变化（核尺寸增加和致密焦点增多，核圆形度和DAPI强度降低）的最小标准，以明确识别真实的SnCs（图2）。每种形态测量都可以独立出现，当细胞开始获得损伤并启动衰老路径时，正如我们在NMP结果中可视化的“梯度”所示（图2B）。根据当前的聚类方案，我们标记为类衰老的群体可能表示前衰老核，这种形态表型指示细胞命运决定步骤或完全衰老的前体。这一衰老轨迹揭示了一个有趣的概念，可用于下一代衰老溶解剂的开发，旨在靶向早期转变中的细胞，可能改善衰老疗法的有限疗效。
将NMP应用于年轻、老年和老年晚期小鼠的骨骼肌稳态和再生，揭示了稳态组织中几乎不存在SnCs，但在所有年龄段中损伤后SnCs大幅扩展（图4）。年轻小鼠中的再生SnC扩展主要由FAPs组成，时间恰逢它们的峰值增殖扩展，支持了它们对高效再生的必要性，可能通过SASP依赖的免疫细胞反应调控。有趣的是，从老年未受伤组织中培养3天的FAPs比年轻组织中的细胞更衰老，表明老年细胞对复制性衰老敏感，而年轻细胞可能对体内再生环境的应激诱导性衰老更具响应性。然而，老年环境中的再生改变了SnCs的细胞组成，SCs和Enr-ECs成为主要成分，而FAPs则降至少数。这些数据与老年骨骼肌中SC衰老的有害作用一致，因为它限制了直接参与重建肌肉纤维的干细胞池，并且衰老的ECs不利的炎症特性可能成为老化过程中慢性炎症的潜在来源。尽管我们的数据没有显示年轻到老年晚期ICs的显著衰老转变，但免疫SnCs的存在可能对其清除SnCs的固有能力产生复合的有害影响。此外，我们能够将NMP应用于组织切片中SnCs的评估（图5和补充图9、10、11），支持其在各种细胞环境中检测具有衰老特性的细胞的广泛应用。这些数据还再现了相对于FAPs和ECs的年龄依赖性SnC群体的动态变化，最大限度地减少了组织处理和体外处理对细胞表示的影响。我们NMP在老年原发性骨关节炎中的进一步应用清楚地定义了老年关节软骨中的衰老软骨细胞。虽然软骨细胞分离的技术挑战限制了每次重复分离的细胞数量，但在这种情况下，NMP仍然能够取得可靠且显著的结果。
综上所述，这些数据表明我们的NMP可以在不同环境和年龄段中实施，并转化为多种组织以定义SnCs。NMP揭示的SnCs的引人入胜的动态表示强化了在尝试清除SnCs时考虑个体年龄的重要性，因为一种可能是有益的，另一种可能是有害的。我们研究中揭示的SnC细微差别值得进一步研究，这是我们将在未来追求的领域。
显然需要新的方法来识别衰老。虽然我们的研究旨在建立一个在不同环境中保持其敏感性和功效的形态学平台，但在各种组织，尤其是人类来源的组织中进行进一步测试将是重要的。此外，识别细胞衰老的难点在于其表型的异质性，这限制了跨条件的一致性标记使用。因此，多参数方法通过使用像我们NMP这样的平台识别衰老可以提高准确性，并识别我们和其他人旨在识别的替代标记。尽管使用潜在非特异性标记来验证新方法仍然是一个挑战，但将多个生物标记与SnC检测相关联，正如我们在这里所做的并在未来研究中将继续扩展的那样，可以增加对真正衰老状态可靠识别的信心。
方法
动物模型
动物实验符合纽约大学格罗斯曼医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC，协议编号202100001/2）批准的规定。所有小鼠均为C57BL/6J背景，购自国立卫生研究院老龄化研究所的繁殖群体。年龄范围为3-6个月为年轻，23-25个月为老年，28-31个月为老年晚期小鼠。所有小鼠均为雄性，以适应老年队列中的足够数量，并在12小时/12小时光照/黑暗条件下维持，温度控制在21.2°C，湿度为58%。
细胞培养和染色
C2C12细胞由Stefano Biressi赠送。细胞按照ATCC规定培养，生长培养基（C2GM，10%胎牛血清（Omega Scientific），1X青霉素/链霉素（Gibco, 15140122），和DMEM（Corning, MT10013CV））。C2C12细胞在第5至25代之间使用。为了诱导衰老，第1天将C2C12细胞接种在1666-5000细胞/cm²之间。第2天，细胞用300或500 µM H₂O₂（EMD Millipore, 386790-100 ML）、2或10 µM依托泊苷（Millipore Sigma, 34-120-525MG）或0.08或0.4 µM阿霉素（Cayman Chemical, NC1706390）处理2小时，移除处理后加入新鲜C2GM继续培养3天，然后用4% PFA固定。对于ABT-263处理，遵循相同方案，第5天用剂量响应的ABT-263（TargetMol, T2101）处理24小时后固定。
3T3-L1细胞购自ATCC并按要求培养，生长培养基（3TGM）含10%小牛血清（HyClone, SH30072.02）和1X青霉素/链霉素，DMEM。3T3-L1细胞在第3至25代之间使用。为了诱导衰老，第1天将3T3-L1细胞接种在833-2000细胞/cm²之间。第2天，细胞用150或300 µM H₂O₂（EMD Millipore, 386790-100 ML）处理4小时；或1或3 µM依托泊苷，或0.03或0.1 µM阿霉素过夜（16小时）；移除处理后加入新鲜3TGM继续培养2-3天，然后用4% PFA固定。
使用Cell Signaling Technology的衰老β-半乳糖苷酶检测试剂盒（9860S）检测衰老，按照制造商的协议，将pH调整为6.0。使用Keyence BZ-X810显微镜捕获明场和荧光图像。DAPI染色并与底物阳性（蓝色）叠加的细胞被量化为衰老细胞。
对于免疫染色，细胞用4%多聚甲醛（PFA）固定10分钟，用1X PBS冲洗，用0.1% TritonX（Fisher Bioscientific, BP151-100）透化30分钟，并用1% BSA（GeminiBio, 700-109 P）/10% DS（Equitech Bio Inc, NC0629457）/1X PBS/0.1% Tween（Fisher Scientific, BP337-100）封闭1.5小时。然后，细胞在稀释液（1% BSA/10% DS/1X PBS）中孵育18-20小时。抗体包括γH2A.X（Cell Signaling Technology, 9718）、Ki67（Abcam, ab15580）、裂解的Caspase-3（Cell Signaling Technology, 9661）。用1X PBS洗涤去除一抗后，细胞在稀释液和二抗中孵育2小时。二抗包括Alexa Fluor 555驴抗兔（Thermo Scientific, A-31572）。然后用1X PBS洗涤细胞，用DAPI（Invitrogen, D1306）反染，并用FluoroGel介质（Electron Microscopy Sciences, 16985-10）封片。
膝关节软骨组织学分析
样品用10%缓冲福尔马林固定72小时，用10%甲酸脱钙10天。脱钙样品包埋在石蜡中，切成垂直于软骨表面的4 μm切片。使用常规方法用番红O/快绿（Electron Microscopy Sciences, 477-73-6 / Sigma-Aldrich, 2353-45-9）染色切片。使用番红O染色检查小鼠中的软骨破坏情况。
荧光成像
荧光图像使用配备NIS-Elements高级研究采集软件（版本5.42.03）的尼康Eclipse Ti2-LAPP倒置显微镜系统获取。每孔用20倍物镜采集三个高放大倍数的代表性图像。对于冷冻切片样品，用60倍油浸物镜采集3-5个高放大倍数的代表性图像。对于EdU染色样品，整个孔被成像。Z堆叠图像以1 µm增量拍摄。每次独立实验的曝光和查找表（LUTs）保持恒定。
预处理流程
图像预处理使用NIS-Elements高级研究（AR）分析软件（尼康仪器，版本5.42.03）进行。初始预处理从Z堆叠图像中使用3D去卷积去除噪声。然后使用最大强度投影使所有荧光出现在单一平面上，便于图像分析。为了进一步优化图像，使用低通滤波器仅传递大于设定像素值的细节，去除小的不规则性。最后，使用滚动球函数进一步区分背景和荧光强度。
核表型提取
使用NIS-Elements AR分析软件进行图像分析，以实现单核分辨率。为了检测核，使用每个样本设置的阈值函数处理DAPI染色的孔图像，使图像中形成二值对象。对大小和圆形度进行限制，以去除碎片或重叠核等物体。通过创建二值图像，可以分离、计数和测量核的大小、平均强度和圆形度。为了检测焦点，使用点检测功能计数对比周围像素的明亮圆形物体。对斑点的限制包括大小、对比度和强度。然后将这些斑点聚合，仅计算存在于检测到的核二值数据中的亮点。对于C2C12细胞/3T3-L1细胞，以及原代FAPs和SCs，全图像上的分析通过软件自动化完成。对于原代内皮细胞和免疫细胞，分析在全图像上手动进行，以避免因细胞聚集而导致的错误识别。
UMAP呈现和聚类
使用R Studio（版本4.3.1），将核的四个表型测量导入并使用z-score在其各自参数内进行归一化。为了聚集视觉上相似的细胞，使用包factoextra（版本1.0.7）中的fviz_cluster函数，该函数在四个归一化的表型测量上应用k-means算法。使用Rstudio包UMAP（版本0.2.10.0），制作了四个参数的二维可视化（n_neighbors = 20，n_components = 2），以定位视觉上相似的细胞。为了形成衰老评分，前一步骤重复n_components = 1，并需要大量细胞以实现最佳动态范围。对于三维可视化，前一步骤重复n_components = 3。在较高维度完成的聚类数据然后在较低维度的UMAP上可视化。在每个UMAP中，通过输入来自每个条件的相同数量的细胞确保条件的平等表示，确保准确量化。数据导出并使用GraphPad Prism绘图。
统计和可重复性
所有报告的测量值均来自不同的实验样本。实验至少进行了三次，每次实验使用单个生物/实验（非技术）重复进行每种条件。除非另有说明，“n”数表示独立实验。统计分析使用GraphPad Prism（版本9.5.0）进行。误差条表示平均值 ± 标准误（SEM）。统计测试使用双侧t检验进行，除非另有说明。显著性表示如下：p > 0.05（n.s. – 不显著）；p ≤ 0.05 ()；p ≤ 0.01 ()；p ≤ 0.001 ()；p ≤ 0.0001 (****)。除了由于技术问题排除的一个RT-qPCR重复外，没有数据被排除在分析之外。没有使用统计方法预先确定样本量。实验随机化，研究人员在实验或免疫荧光图像分析期间对样本分配或条件不知情。
图1B包括n = 3个实验重复，每种条件的细胞计数如下：X-Gal，100-300个细胞；Ki-67，100-300个细胞；γH2A.X，150–250个细胞；裂解的caspase，100-600个细胞；图1C包括n = 3个实验重复，每种条件400-4000个SA-β-Gal细胞；图1D包括n = 4个实验重复，每个独立实验重复2-3次技术重复；图1E包括n = 3个实验重复，每次重复4000–8000个细胞；图3E、F包括n = 3个实验重复，每次重复1000–1500个细胞；图4B-E包括n = 3个生物学重复，每次重复细胞计数如下：FAPs，1.5-5.0 × 10³个细胞；SCs，1.0-1.2 × 10³个细胞；图5B、C包括n = 3个生物学重复，每种条件150-200个细胞；图5E、F包括n = 3个生物学重复，每种条件300-600个细胞；补充图4每个诱导剂n = 3个实验重复，X-Gal n = 100-600个细胞，γH2A n = 100-500个细胞，Ki-67 = 200–350个细胞每种条件；补充图7A-F包括n = 3个生物学重复，每次重复细胞计数如下：FAPs，200个细胞；SCs，200个细胞；补充图9C、5C包括n = 3个生物学重复，每种条件100-300个细胞；补充图9F、5F包括n = 3个生物学重复，每种条件200-600个细胞；补充图12B包括n = 4个生物学重复，每种条件1000–2000个细胞；补充图12C包括n = 4个生物学重复，每种条件500–1500个细胞；补充图13C，n = 8个实验重复，细胞输入来自两只5个月大的小鼠制成4个重复。这个过程进行了两次；补充图13E包括n = 7个实验重复，细胞输入来自两只小鼠制成4个重复，另外两只小鼠制成3个重复。补充图14C、D包括n = 5个生物学重复，每种条件下chondrocytes n = 82–96个细胞，免疫细胞n = 123–134个细胞。
(全文结束)