通过适配体蛋白质组学鉴定系统性硬化症伴间质性肺病患者血清外泌体蛋白

Identification of serum exosome proteins in systemic sclerosis with interstitial lung disease by aptamer proteomics

美国英文医学研究

新闻源：Arthritis Research & Therapy

2025-07-16 23:06:21阅读时长15分钟7320字

内容摘要

本研究通过适配体蛋白质组学技术分析系统性硬化症（SSc）患者血清中的外泌体蛋白，成功识别出与间质性肺病（ILD）相关的多种潜在生物标志物，为区分不同临床亚型提供了重要参考，有助于早期诊断和治疗干预。

摘要

目标

目前，系统性硬化症（SSc）临床管理中缺乏有效的生物标志物用于早期诊断SSc相关间质性肺病（SSc-ILD）。本研究旨在利用适配体蛋白质组学技术，鉴定血清外泌体中可能作为潜在生物标志物的蛋白，以区分无SSc-ILD的弥漫性SSc患者与伴有SSc-ILD的弥漫性SSc患者。

方法

从两个患者队列中分离血清外泌体。第一队列包括15名无SSc-ILD的弥漫性SSc患者和14名伴有SSc-ILD的弥漫性SSc患者；第二队列包括12名无SSc-ILD的弥漫性SSc患者和12名伴有SSc-ILD的弥漫性SSc患者。使用SOMAscan适配体蛋白质组学技术对第一队列进行分析，量化了1305种蛋白的浓度水平。评估显著差异表达蛋白（p < 0.05 |FC|>1.2）在两组SSc临床亚型之间的关联性。第二队列用于验证第一队列的蛋白质组学结果。

结果

适配体蛋白质组学分析发现，在伴有SSc-ILD的SSc患者中，有29种蛋白增加，9种蛋白减少。主成分分析（PCA）使用20种最显著差异表达的蛋白成功实现了两种SSc临床亚型的良好分离。大多数差异增加的蛋白集中在增强炎症反应、免疫细胞活化、细胞死亡和异常血管功能等方面，其中几种蛋白与一氧化碳弥散能力水平高度相关。

结论

通过对弥漫性SSc患者循环外泌体的适配体蛋白质组学分析，鉴定出多种生物学上合理的生物标志物，这些标志物可能有助于区分两种SSc临床亚型。

背景

系统性硬化症（SSc）是一种全身性自身免疫性疾病，其特征为皮肤和内脏纤维化、纤维增殖性血管病变以及广泛的体液和细胞免疫改变。SSc的病因尚不清楚，但显然涉及多种遗传和环境因素。尽管对SSc的众多复杂机制进行了广泛研究，但其发病机制仍未完全理解，目前在理解这一复杂过程方面仍存在许多空白。此外，该疾病尚无有效疗法，病情常进展导致多器官结构和功能损害，并常导致致命后果。肺部受累伴有进行性纤维化发生在25%至95%的SSc患者中，是SSc死亡的主要原因。目前尚无经过验证的生物标志物可用于早期评估SSc器官受累的程度和严重程度。特别是缺乏能够识别可能发展为SSc相关间质性肺病（SSc-ILD）的SSc患者的生物标志物。鉴于SSc-ILD是导致高SSc死亡率的原因，这代表了一个重大的未满足需求。

近年来，应用蛋白质组学识别SSc生物标志物取得了显著进展。引入新型基于适配体的亲和蛋白质组学技术，可以识别和量化大量具有极高灵敏度和特异性的蛋白，从而提高了蛋白质组学平台的诊断价值。最近对外泌体和其他微泡中所含蛋白的特性研究兴趣增加，因为它们有可能成为各种疾病的潜在生物标志物。外泌体是从所有人体细胞释放到周围细胞间隙和循环中的离散且特征明确的微泡亚型，其独特的分子内容反映了其来源细胞及其功能或病理状态。因此，对外泌体内容的研究，特别是miRNA、蛋白、细胞因子和炎症介质作为诊断、疾病程度和严重程度评估或治疗干预反应监测的潜在生物标志物引起了极大的兴趣。此外，对循环外泌体的大分子含量的研究为研究包括SSc在内的多种纤维化疾病的发病机制提供了新的方向。

由于适配体蛋白质组学应用的极高灵敏度和特异性，它已被广泛接受为个体化医学领域快速发展的重要诊断工具。应用SSc患者分离血清外泌体的适配体蛋白质组学可能会识别出用于SSc诊断、SSc疾病修饰疗法临床反应评估和SSc患者预后评估的敏感和特异的非侵入性蛋白生物标志物。

在此，我们应用适配体蛋白质组学分析分离血清外泌体，以识别新的非侵入性生物标志物，可能区分无SSc-ILD的弥漫性SSc与伴有SSc-ILD的弥漫性SSc，后者临床亚型以显著增加的死亡率为特征。

材料与方法

患者群体

纳入研究的患者均来自托马斯·杰斐逊大学的硬皮病中心（费城，宾夕法尼亚州，美国）。所有患者均已签署知情同意书，允许采集血液样本并进行测试，并允许将获得的结果用于任何科学出版物。所有纳入患者的诊断均为2013年SSc分类标准定义的弥漫性皮肤SSc。通过肺部的放射学和计算机断层扫描确认这些患者的ILD诊断。研究了两个患者队列。第一个队列包括15名无SSc-ILD的弥漫性SSc患者和14名伴有SSc-ILD的弥漫性SSc患者。第二个队列包括24名患者，每种SSc临床亚型各12名，用于验证第一个队列的蛋白质组学结果。SSc-ILD的诊断是在SSc确诊时确认的，血样也是在确诊时收集的。诊断依据Herzog等人描述的定义。研究时这些患者未接受任何免疫抑制剂治疗。

外泌体分离

血清样本分装后储存于-80°C直至检测。使用Systems Biosciences（帕洛阿尔托，加利福尼亚州）的SmartSEC HT EV分离系统按照制造商协议从0.5 ml血清中分离外泌体。分离的外泌体重悬于1.0 ml外泌体缓冲液（Thermo Fisher Scientific）中，并从0.5 ml外泌体样品中使用MPER提取缓冲液提取蛋白，得到足够的蛋白进行蛋白质组学分析。

蛋白质组学分析

使用基于适配体的多重SOMAscan测定法进行外泌体的蛋白质组学分析，该实验在贝丝以色列女执事医疗中心（BIDMC）基因组学、蛋白质组学、生物信息学和系统生物学中心进行。SOMAscan®分析按照SomaLogic的标准协议进行。根据制造商推荐的协议，每个外泌体蛋白裂解样品7.2 µg在外泌体裂解物1.3 K测定试剂盒上运行，该试剂盒使用高度选择性的单链修饰慢速解离修饰DNA适配体（SOMAmer）测量1,305种人类蛋白质的浓度水平。每个单独蛋白的浓度以相对荧光单位（RFU）量化，如前所述。平行检测三个混合正常血清外泌体对照和一个无蛋白缓冲对照。数据质量控制、校准和标准化由SomaLogic进行，所有样品均通过SomaLogic手动1.3 K测定的标准质量控制和标准化标准。

统计分析

使用非参数Wilcoxon秩和检验确定两组SSc患者之间各种蛋白质浓度水平的统计显著差异，比较SOMAscan®相对荧光单位。如前所述，若绝对中位数倍数变化（log2表示）>|1.2|且p值<0.05，则认为该蛋白质显著差异表达。使用XLSTAT（Addinsoft，长岛市，纽约州）进行主成分分析（PCA），输入前20个显著升高或降低的蛋白质（p < 0.05 FC>|1.2|），以评估其区分两组SSc临床亚型的能力。使用XLSTAT创建六个代表性目标蛋白的箱须图，显示其具有ILDSs潜在生物学相关性的SOMAscan®相对荧光单位（RFU）表达水平。

系统生物学分析

使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）软件工具（QIAGEN，红木城，加州）对从SOMAscan列表中的1,305个人类蛋白中获得的171个失调蛋白进行通路分析，进一步表征与两种弥漫性SSc队列相关的外泌体蛋白签名的潜在病理生理通路和生物学功能，并更精确地理解差异升高或降低的蛋白与候选上游调节因子之间的复杂相互作用。这些研究包括对所有失调蛋白（p值<0.05）的功能类别、经典通路、交互网络、上游调节因子和调节因子效应分析。使用STRING数据库版本11.5进行蛋白-蛋白功能和物理相互作用的进一步蛋白相互作用分析，结果显示为功能网络。相互作用考虑了所有类别的最高STRING置信度评分0.9或更高。去除网络中与其他蛋白没有关联的蛋白。执行k-means聚类算法以选择连接蛋白（k-means = 7）。根据KEGG通路、基因本体（GO）、Reactome、STRING本地网络集群术语和PubMed文献搜索的手动策划评估，分配聚类的功能描述。

验证

使用第二个患者队列的血清外泌体蛋白进行适配体蛋白质组学结果的验证（表1中的队列2）。使用两种蛋白，elafin和血小板反应蛋白4进行蛋白质组学结果的验证。选择这些蛋白是因为它们在研究组的比较中最显著差异表达。通过ELISA分析使用abcam的人Elafin ELISA试剂盒（ab240679）验证elafin的蛋白质组学结果，按照制造商的方案稀释53倍的外泌体溶液。总蛋白浓度用作归一化的方法。

表1 研究的弥漫性SSc患者的统计和临床特征

全尺寸表格

通过Western blot分析使用特异性抗血小板反应蛋白4抗体（R&D Systems）验证血小板反应蛋白4的结果。为此，将20 µg的蛋白溶液加热至95°C持续5分钟，然后在NUPAGE 12% Tris-Glycine凝胶（Novex Life Technologies，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）上解析。将蛋白转移到硝酸纤维素iBlot凝胶转移堆栈中，并在封闭缓冲液（Li-Cor Biosciences，林肯，内布拉斯加州，美国）中封闭1小时。将抗血小板反应蛋白4抗体加入缓冲液中，并在4°C下孵育过夜。使用IDRye IDRye 680RD抗小鼠抗体（Li-Cor）检测血小板反应蛋白4。使用Odissey IR读取器测量条带强度，数值以任意单位呈现，归一化为考马斯亮蓝染色凝胶中通过ImageJ软件计算的总蛋白浓度。

结果

患者队列特征

第一队列中的所有个体均为中年女性，对于SSc患者，其SSc病程从几个月到长达二十年不等。第二队列中的个体包括一些男性。表1总结了人口统计学和相关的临床特征，包括肺功能测试结果和胸部X光片中ILD的存在及其病程。

血清外泌体的SOMAscan蛋白质组学

对血清外泌体进行SOMAscan蛋白质组学分析，共鉴定了171种显著差异表达的蛋白（105种上调，66种下调）（p < 0.05）（补充表1）。表2显示了38种最显著上调和下调的蛋白（29种上调，9种下调），其绝对倍数变化大于|1.2|，可区分伴有SSc-ILD的弥漫性SSc与无ILD的弥漫性SSc。使用前20种显著升高或降低的蛋白（p < 0.05 FC>|1.2|）进行主成分分析（PCA），结果表明两种临床SSc表型得到了极好的分离，证明了分离血清外泌体的SOMAscan蛋白质组学确实能够识别出区分无SSc-ILD的弥漫性SSc与伴有SSc-ILD的弥漫性SSc的外泌体蛋白，如图1A所示。第一主成分解释了41.31%的方差，第二主成分解释了12.90%的方差。在这次分析之后，只有1名伴有SSc-ILD的弥漫性SSc患者和1名无ILD的弥漫性SSc患者被误分类，表明SOMAscan数据提供了区分两种SSc临床亚型的信息，使用前两个主成分。

表2 弥漫性SSc伴有SSc-ILD与无ILD的弥漫性SSc相比，升高（>1.2倍）和降低（<-1.2倍）的蛋白

全尺寸表格

带有SSc-ILD的弥漫性SSc患者和无ILD的弥漫性SSc患者的箱须图展示了六个具有ILD相关生物意义的代表性靶标的SOMAscan®相对荧光单位（RFU）表达水平的差异程度：五个在弥漫性SSc伴有SSc-ILD中升高的蛋白是PI3、TNFRSF4、CCL11、FCN2和HMGB1；而在弥漫性SSc伴有SSc-ILD中降低的一个蛋白是THBS4（图1B）。

失调通路的系统生物学分析

使用Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 软件工具（QIAGEN，Redwood City，CA）对从SOMAscan列表中的1,305个人类蛋白中获得的171个失调蛋白进行系统生物学分析，结果显示多个不同的生物通路和功能类别中富集了蛋白。IPA富集的生物功能集中在与细胞死亡（坏死、凋亡、免疫细胞死亡、白细胞凋亡）、免疫细胞迁移（白细胞迁移、骨髓细胞运动、吞噬细胞运动、粒细胞运动、单核白细胞运动）、炎症过程（器官炎症、炎症反应、慢性炎症性疾病、绝对解剖区域炎症、体腔炎症）、免疫细胞功能和白细胞生成（血液细胞结合、白细胞结合、白细胞生成、白细胞激活、白细胞数量、单核白细胞发育、淋巴细胞生成、单核白细胞造血、免疫细胞粘附、单核白细胞稳态、抗原呈递细胞激活）、血管功能（血管生成、血管发育、血管生成）和纤维化相关的蛋白（图2A）。图2B详细突出了与炎症反应相关的49种ILD相关蛋白中的预测增强的炎症。图2C描绘了55种与弥漫性SSc伴ILD中增强的血管生成相关的蛋白，清楚地显示了这些蛋白之间的生物关系。

基于它们与上游调控蛋白的已建立联系建模差异表达蛋白之间的联系是非常有启发性的（图2D）。上游调控因子分析预测了多个蛋白作为这些差异升高或降低的外泌体蛋白的潜在调控因子。结果表明，涉及炎症过程的细胞因子和下游转录因子，如TNFα（图2E）和NFκB（图2F），以及参与纤维化的蛋白，如TGFβ1（图2G）是SSc-ILD的重要预测调控因子，具有高度统计学意义。171个ILD相关蛋白中有48个被预测由TGFβ1调控，TGFβ1是一种关键的促纤维生成生长因子，预测其活性增强（图2G）。NFκB作为各种趋化因子（包括CCL11）的直接调控因子，是SSc-ILD患者血清外泌体中171个蛋白中的32个其他蛋白的上游调控因子，其中包括本身在SSc-ILD中升高的TGFβ1。促炎细胞因子TNFα是一个预测的上游调控因子，调控63个SSc-ILD血清外泌体蛋白（图2E）。另外三个重要的转录因子SP1、WT1和RELA似乎在血清外泌体中发现的众多SSc-ILD相关蛋白的调控中起作用（补充图1）。

接下来，我们使用STRING数据库进行了网络和聚类分析，该数据库整合了主要数据存储库中策划的功能和物理蛋白关联，如前所述。我们发现，在应用严格相互作用分数（置信度得分>0.9）时，171个差异表达蛋白中有68个在弥漫性SSc伴SSc-ILD与无SSc-ILD的弥漫性SSc之间形成了明显的相互作用蛋白簇（图3）。这些蛋白相互作用簇富含与炎症、免疫细胞功能、TGFβ信号传导、血管病变、补体凝集素途径、胰岛素分泌、金属蛋白酶和细胞外基质以及核苷酸代谢相关的通路（图3）。TGFβ1和JUN被发现是连接这些簇的几个主要焦点枢纽。

讨论

SSc是一种全身性自身免疫性疾病，具有显著的纤维化成分，影响皮肤和包括肺在内的多个器官系统。SSc相关的肺纤维化，也称为SSc-ILD，是SSc纤维化过程中的常见表现。欧洲硬皮病试验和研究小组（EUSTAR）的一项大型研究表明，约50%的弥漫性皮肤SSc患者存在ILD。SSc-ILD是SSc最严重的并发症之一，也是SSc死亡的主要原因之一。因此，在非常早期阶段确立SSc-ILD的存在对于启动可能挽救生命的治疗至关重要。正在进行大量研究，以识别能够在早期阶段确立SSc-ILD存在的新诊断方法。

基因组和蛋白质组学技术的显著进步使得对大量疾病发病机制中涉及的分子改变进行综合和精确分析成为可能。特别相关的是开发潜在生物标志物以改善SSc的诊断并建立最佳治疗干预措施，采用适配体蛋白质组学技术。适配体具有涵盖飞摩尔到微摩尔浓度的动态检测范围，因此能够在广泛的动态范围内同时筛选生物液体中的大量蛋白，具有极高的灵敏度。虽然已有几项研究描述了从SSc患者中分离的细胞、血清和受影响组织的蛋白质组学分析，但很少有研究利用基于适配体的蛋白质组学分析。Sanges等人对伴有和不伴有SSc相关肺动脉高压的患者的血清蛋白进行了SOMAscan分析。SOMAscan评估了1129种蛋白的血清表达水平。研究人员发现两组之间有53种蛋白水平升高，但最显著的相关性是与chemerin水平的相关性。因此，他们将研究重点放在chemerin作为SSc患者肺动脉高压的潜在血清生物标志物上。他们研究的其他结果显示，与对照SSc队列相比，伴有肺动脉高压的SSc患者血清ApoA1水平降低。这些观察结果与我们在患者中获得的ApoA1结果非常相似，如表2所示。

这里报道的研究描述了适配体蛋白质组学在从伴有SSc-ILD的弥漫性SSc患者和不伴有ILD的弥漫性SSc患者中分离的血清外泌体提取物中识别差异升高或降低的蛋白的应用。外泌体分析的一个优势在于它可以揭示在患病组织中富集的蛋白，正如本研究中对肺部的展示，因此可能有助于识别更具体的生物标志物。我们鉴定了171种蛋白（p值<0.05），其表达水平在伴有SSc-ILD的弥漫性SSc与不伴有SSc-ILD的弥漫性SSc之间一致改变。其中39种最为显著差异表达的蛋白（>1.3倍）。这些蛋白包括几种对SSc-ILD特别感兴趣的蛋白，如PI3、TNFRSF4、FCN2、CCL11和HMGB1水平升高，而THBS4水平降低，我们通过Western blot验证了SSc-ILD患者分离的外泌体中THBS4表达的降低。

PI3/Elafin是一种与先天免疫反应相关的蛋白酶抑制剂，先前已被证明在SSc患者中较健康对照或类风湿关节炎患者升高，并且与DLCO呈负相关，我们在本研究中证实了这一观察结果。此外，通过ELISA验证适配体结果表明，在从ILD患者中分离的血清外泌体中Elafin浓度增加。因此，我们现在建议这种蛋白可能与SSc-ILD特别相关。

HMGB1是一种损伤相关分子模式（DAMP）蛋白，由单核细胞和巨噬细胞分泌，并由血小板在微粒中释放。另一项研究表明，与SSc相比，SSc-ILD中HMGB1水平升高可作为生物标志物，并与calpain表达相关。此外，冷刺激后成纤维细胞释放HMGB1以刺激雷诺现象。

我们发现的几种差异升高或降低的蛋白已知参与炎症通路，如IL3、CCL5、CCL11和TNF受体，显示了外泌体货物在SSc已知的初始病理反应中的重要性。我们还发现了其他参与该疾病中血管增殖性改变的蛋白，如OSM和MET。

需要强烈强调的是，这里描述的结果需要在更大规模的SSc患者人群中进行验证，以确认并证明它们作为有用疾病亚型生物标志物的临床实用性。因此，这里展示的结果存在一些局限性，也没有进行多重比较的调整。新生物标志物的全面验证对SSc患者的最佳管理将具有重大价值，因为目前缺乏在SSc-ILD发展的最早阶段识别SSc患者的验证生物标志物。因此，我们认为当前研究报道的结果可能对解决SSc中这一重要未满足的临床需求具有实质性价值，考虑到SSc-ILD带来的严重影响、不良预后和高死亡率。

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