eEF2K是一种真核延伸因子-2激酶，在胰腺导管腺癌（PDAC）中表达上调并与患者生存期缩短相关。研究表明，eEF2K信号通路对PDAC肿瘤生长至关重要并受肿瘤微环境（TME）调控。体内实验表明，针对eEF2K的基因抑制显著抑制了两种PDAC小鼠模型中的肿瘤生长，减少了肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），并在肿瘤组织中诱导了显著的细胞凋亡且未出现毒性。数据表明，eEF2K敲低降低了AXL受体酪氨酸激酶的活性及TAM衍生因子如单核细胞趋化蛋白-1（MCP1）的表达，同时影响PDAC细胞中的Gas6/AXL信号通路。此外，TCGA数据库分析显示，eEF2K在存在TAM标志物的情况下表达与更短的患者生存期相关。TAM释放的因子如MCP1、Gas6和外泌体能够诱导PDAC细胞中eEF2K的表达及AXL、SRC、VEGF、Snail和MMP2的活性，从而促进上皮-间质转化（EMT）、侵袭、转移和血管生成。总之，研究首次揭示了eEF2K是PDAC肿瘤生长的关键致癌驱动因子，因此靶向eEF2K代表了一种有前景的新治疗策略。
【方法】
细胞系和培养条件
人胰腺癌细胞系（PANC-1和MiaPaCa-2）以及人急性单核细胞白血病细胞系（THP-1）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。人胰腺星状细胞（PSCs）由Rosa Hwank博士提供（MD Anderson癌症中心）。PANC-1、MiaPaCa-2和PSC细胞在补充了10%胎牛血清（FBS）和100 U/ml青霉素-链霉素（P/S）溶液的DMEM/F12培养基中培养。THP-1细胞则在补充了10% FBS和100 U/ml P/S溶液的RPMI-1640培养基中维持。所有细胞均在37°C、含5% CO2的湿润环境中培养，并定期检测支原体污染情况。
siRNA转染
将PANC-1或MiaPaCa-2细胞以2.5 × 10^5和3.5 × 10^5个细胞/孔的密度接种于6孔板中。培养24小时后，使用Hiperfect转染试剂（Qiagen）在Opti-MEM减血清培养基（Life Technologies）中用50或100 nM浓度的对照siRNA或eEF2K siRNA（Sigma-Aldrich）进行瞬时转染，按照制造商的协议操作。转染6小时后，将Opti-MEM替换为含有10% FBS的培养基，继续孵育48小时后进行进一步实验。
使用慢病毒载体过表达eEF2K
为了实现eEF2K的稳定过表达，我们采用慢病毒质粒系统，将携带eEF2K编码序列（NM_013302.3）的CMV启动子（LPP-U0633-Lv105）或模拟载体（LPP-NEG-Lv103）感染PANC-1细胞。初始步骤是将PANC-1细胞接种于96孔板（1 × 10^3个细胞/孔）并培养过夜以使细胞贴壁。次日，将慢病毒颗粒稀释在含5% FBS和1% P/S的细胞培养基中，补充终浓度为8 μg/ml的聚凝胺（EMD Millipore Corporation），并加入孔中。48小时后，用含10 μg/ml嘌呤霉素的培养基筛选三周（Invitrogen/Life Technologies）。过表达eEF2K通过Western blot分析确认。
单核细胞分化为巨噬细胞
将THP-1单核细胞接种于75 cm²培养瓶中，密度为每瓶2–2.5 × 10^6个细胞。为诱导分化为成熟巨噬细胞（M0型），细胞用10 ng/ml佛波酯12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）处理24小时。随后，轻轻吸去含PMA的培养基，加入新鲜培养基（不含PMA）。对于M2型巨噬细胞极化，加入终浓度为25 ng/ml的IL-4和IL-13，并继续孵育24小时。通过Western blot评估CD68、CD163和CD206的水平来确认极化状态。
间接共培养实验
将PANC-1、MiaPaCa-2和PSC细胞接种于6孔板中，密度为每孔3 × 10^5个细胞。然后使用Corning公司生产的24 mm直径、0.4 µm孔径的Transwell插入系统与THP-1单核细胞或M1/M2巨噬细胞共培养48小时。共培养结束后移除插入物，并对细胞进行进一步分析。
条件培养基收集
THP-1细胞在75 cm²培养瓶中培养并极化为巨噬细胞。随后将培养基替换为含1% FBS的培养基，继续孵育24小时。收集培养基，以1000 rpm离心5分钟，经0.22 μm注射器过滤器过滤后立即使用。PANC-1、MiaPaCa-2和PSC细胞用条件培养基与新鲜培养基按1:1比例混合处理48小时。
外泌体分离
THP-1细胞接种于75 cm²培养瓶中，每种细胞类型使用两个培养瓶（THP-1细胞、M0巨噬细胞和M2巨噬细胞；总计六个培养瓶）。细胞按照前述方法进行分化，并将培养基替换为含10%去外泌体FBS（System Biosciences）的RPMI-1640培养基。在去外泌体培养基中孵育24小时后，收集上清液，以+4°C、1000 x g离心5分钟去除细胞碎片，再以+4°C、2000 x g离心30分钟。使用Beckman Coulter公司的超速离心机，将上清液以+4°C、60,000 x g离心45分钟，然后以240,000 x g离心90分钟。外泌体沉淀用滤过磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，使用NanoSight（Malvern）定量后立即使用。
MCP-1分泌水平测定
在PANC-1细胞与THP-1细胞/巨噬细胞间接共培养48小时后，从6孔板的每个孔中收集培养基。还收集单独培养的THP-1细胞、M0和M2巨噬细胞以及PANC-1细胞的培养基作为对照。根据人特异性MCP-1 ELISA试剂盒（R&D Systems）的说明测量MCP-1浓度。
重组MCP-1和Gas6处理
重组人MCP-1/CCL2蛋白（R&D Systems）溶解于无菌PBS（含0.1%牛血清白蛋白）中，浓度为100 μg/ml作为储存液。重组人Gas6蛋白（R&D Systems）溶解于无菌水中，储存浓度为500 μg/ml。将PANC-1细胞接种于6孔板中，密度为每孔1.5 × 10^5个细胞，并孵育过夜使其附着。对于Gas6处理，将培养基替换为无FBS的培养基并孵育过夜。随后，用不同浓度的Gas6（200、400、600 ng/ml）处理30分钟。对于MCP-1处理，细胞在无FBS培养基中暴露于不同浓度的MCP-1（10、25、50 ng/ml）24小时。随后，按照上述方法刺激细胞，并用于进一步实验。
增殖和集落形成实验
通过克隆形成实验评估PANC-1细胞的集落形成能力。将PANC-1细胞接种于6孔板中，每孔5 × 10^2个细胞。培养过夜后，细胞用外泌体（1.5 × 10^8个外泌体/孔）或siRNA（对照和eEF2K，25 nM）处理24小时。随后替换为新鲜培养基，连续培养10–14天直至可见集落形成。用结晶紫（0.5% w/v）染色集落，并使用ImageJ软件（National Institutes of Health）计数。
细胞运动/迁移实验
使用划痕愈合实验测量细胞迁移能力。将PANC-1细胞接种于6孔板中，密度为每孔3 × 10^5个细胞，培养24小时。使用200 μl无菌移液枪头制造划痕，并用培养基轻轻洗涤去除细胞碎片。然后用外泌体（1.5 × 10^8）、siRNA（对照和eEF2K，50 nM）或与单核细胞/巨噬细胞共培养48小时。划痕后立即使用倒置显微镜（Nikon Eclipse TE-200-U）拍摄图像以测量0小时的划痕宽度。在划痕后24小时和48小时再次拍摄照片。每孔至少捕获三个随机非重叠图像。
细胞侵袭实验
将PANC-1细胞接种于6孔板中，并施加与先前描述相同的处理（外泌体、siRNA或共培养）。24小时后，收集细胞，用无血清培养基洗涤，并重新悬浮于200 µl无血清培养基（5 × 10^4个细胞）中，加入涂有Matrigel基底膜（0.7 mg/mL；BD Biosciences）的24孔板Transwell插入物（8-μm孔径；Fisher Scientific）。下腔填充含10% FBS的500 µl培养基作为化学引诱剂。24小时后，固定侵入细胞，用Hema 3染色试剂盒（Thermo Scientific）染色，并用棉签擦去上腔细胞。随后拍照并使用ImageJ软件统计侵入到滤膜下侧的细胞数量，结果表示为三次重复测量的平均细胞数。
Western blot分析
在上述处理后，细胞用冰冷PBS洗两次，并在含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的1X RIPA缓冲液（Thermo Scientific）中裂解30分钟（+4°C）。裂解液在+4°C、13,000 x g离心10分钟，收集上清液。总蛋白浓度使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Thermo-Fisher Scientific）测量。然后将裂解液重悬于Laemmli上样缓冲液（Bio-Rad）中并在95°C加热5分钟。将等量蛋白（每泳道30–40 µg蛋白）进行SDS-PAGE分离，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜用含5%脱脂牛奶的TBS-T封闭，并用以下一抗探针：eEF2K、p-eEF2（Thr56）、Src、p-Src（Tyr416）、MMP-2、Snail、CCR2（Cell Signaling Technology）、CD68、CD163、CD206（Abcam）、MCP-1、Axl、p-Axl（Tyr702）（R&D Systems）、Gas6（Abcam）。随后用辣根过氧化物酶偶联的抗兔、抗鼠或抗山羊二抗（Cell Signaling Technology）标记。化学发光检测使用HyGLO Chemiluminescent HRP抗体检测试剂（Denville Scientific）。每张膜在暗室中曝光胶片（Kodak）0.5–10分钟。对于后续不同抗体检测，膜用Restore™ PLUS Western Blot剥离缓冲液（Thermo Scientific）处理15分钟。β-actin（Sigma-Aldrich）和GAPDH（Cell Signaling Technology）用作加载对照。
【结果】
eEF2K在PDAC细胞中高表达并与不良患者生存相关
为了研究eEF2K表达在PDAC患者中的临床意义和预后价值，我们首先分析了癌症基因组图谱（TCGA）数据库。Kaplan-Meier生存分析显示，eEF2K高表达患者的总体生存率（OS）较短（P = 0.02；图1A）（低表达n = 131，高表达n = 46）。我们进一步通过Western blot和免疫组化评估了胰腺癌细胞系、正常胰腺上皮细胞和患者组织样本中的eEF2K蛋白表达。结果显示，胰腺癌细胞系中eEF2K表达较高，而正常人胰腺导管上皮（HPDE）细胞中表达较弱（图1B）。PDAC患者肿瘤组织中也观察到更高的eEF2K表达（图1C）。
eEF2K诱导PDAC细胞增殖、迁移和侵袭
鉴于eEF2K在PDAC细胞中显著上调，且与患者生存期短相关，我们通过在PDAC细胞中使用特定siRNA敲低eEF2K来研究其在细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。敲低eEF2K导致PANC-1（P < 0.0001；图1D）和MiaPaCa-2细胞（P < 0.0001；图1E）的细胞增殖和集落形成显著减少。此外，eEF2K抑制显著降低PANC-1（图S1A）和MiaPaCa-2细胞的细胞运动性和迁移能力（P < 0.05；P < 0.0001；图S1B）。同样，敲低eEF2K显著降低了PANC-1（P < 0.001）和MiaPaCa-2细胞（P < 0.0001；图1F）的侵袭能力。
eEF2K表达促进体内PDAC肿瘤生长及其抑制增强化疗效果
为了确定eEF2K表达在PDAC中的体内影响，我们使用慢病毒载体系统在PANC-1细胞中过表达eEF2K。将转导了慢病毒对照载体或慢病毒eEF2K载体的PANC-1细胞注射到裸鼠侧腹并每周监测。eEF2K过表达导致小鼠肿瘤显著增大（P < 0.05；图1G）。Western blot分析证实了这些小鼠肿瘤异种移植中eEF2K的过表达（图1G）。一致地，eEF2K过表达增强了细胞迁移（图S1C）。
我们还评估了eEF2K表达对化疗反应的影响。PDAC细胞先用对照或eEF2K siRNA处理24小时，随后用吉西他滨（0.2–12.5 µM）处理72小时。eEF2K抑制显著提高了吉西他滨在PDAC细胞中的疗效（图S2A和S2B）。
体内抑制eEF2K抑制PDAC肿瘤异种移植的生长
为了评估eEF2K抑制在PDAC中的治疗潜力及其在肿瘤发生中的作用，我们将携带eEF2K siRNA或对照siRNA的纳米脂质体（NL）颗粒给予携带PANC-1或MiaPaCa-2肿瘤异种移植的无胸腺裸鼠。大约两周后，通过尾静脉注射给予NL颗粒，每次剂量为0.3 mg/kg（n = 5），每周一次，持续四周。eEF2K siRNA治疗后，PANC-1和MiaPaCa-2肿瘤体积显著小于对照siRNA组（P < 0.05；图2A、B）。此外，体内NL-eEF2K siRNA治疗耐受性良好，血液化学毒性指标显示无毒性迹象（图2C）。
肿瘤样本用特异性抗体染色以检测Ki-67（瘤内增殖标志物）、CD31（血管生成标志物）和F4/80（M2型巨噬细胞浸润标志物）。TUNEL染色用于检测凋亡细胞。结果显示，NL-eEF2K siRNA治疗后，肿瘤组织中Ki-67和CD31阳性细胞数量显著减少（P < 0.01，P < 0.001；图2D）。此外，TUNEL阳性凋亡细胞数量显著增加（P < 0.01；图2D）。
体内靶向eEF2K减少MCP-1表达和M2-TAM积累
我们还评估了体内抑制eEF2K是否减少M2型促肿瘤TAM在肿瘤中的募集和密度。值得注意的是，NL-eEF2K siRNA处理的肿瘤中，eEF2K和MCP-1表达显著降低，MCP-1是单核细胞募集和巨噬细胞分化的标志物（图2E）。eEF2K沉默也降低了M2-TAM的浸润，这由M2-TAM（小鼠）标志物F4/80指示（P < 0.01），表明eEF2K调控PDAC肿瘤中M2-TAM的积累（图2D）。
TAM与PDAC患者较差的整体生存率相关
为了评估TAM的临床意义，我们分析了TCGA数据中的M2巨噬细胞特异性标志物（CD204、CD163和CD206）。Kaplan-Meier生存分析表明，CD206、CD163和CD204高表达水平（图S3A-C）与较差预后相关。此外，eEF2K和巨噬细胞标志物的共表达与PDAC患者的较短OS显著相关（n = 54 vs. n = 25，分别）（P = 0.00004；图S3D）。
TAM通过eEF2K诱导PDAC细胞迁移和侵袭
鉴于巨噬细胞浸润和eEF2K表达与较差预后的关联，我们研究了巨噬细胞对eEF2K表达和PDAC细胞行为的旁分泌效应。为此，我们将THP-1细胞诱导分化为M0和M2巨噬细胞，并通过评估标志物CD68、CD163和CD206的表达以及观察形态变化来确认其极化（图3A-C）。
然后，我们通过功能性实验评估了巨噬细胞条件培养基（CM）和巨噬细胞与PDAC细胞共培养对eEF2K表达的影响，如图3D所示。M0和M2巨噬细胞的CM显著诱导了PANC-1和MiaPaCa-2细胞中的eEF2K表达（图3E），但未在PSCs中观察到（图S4A）。
间接共培养实验表明，巨噬细胞增加了PANC-1细胞中的eEF2K表达（图3F）和PSCs（图S4A），表明TAM释放的因子上调了eEF2K。PANC-1和MiaPaCa-2细胞对巨噬细胞相互作用的不同反应可能与其分子差异有关。一项比较PANC-1和MiaPaCa-2细胞的研究表明，它们具有不同的蛋白表达或突变模式。例如，MiaPaCa-2细胞表达E-cadherin，而PANC-1细胞不表达，这使得这些细胞更具转移性。另一项研究表明，PANC-1和MiaPaCa-2细胞有不同的miRNA表达，这也可能影响它们与其他细胞类型的相互作用，如巨噬细胞。
接下来，我们评估了与巨噬细胞共培养对PDAC细胞迁移、侵袭和相关致癌途径的影响。与eEF2K诱导一致，巨噬细胞诱导了胰腺癌细胞的间质样形态变化，表明由于这些细胞之间的双向相互作用引发了上皮-间质转化（EMT）（图3G）。此外，与巨噬细胞共培养显著增加了PANC-1细胞的迁移（P < 0.001，P < 0.0001）和在Boyden chamber Matrigel中的侵袭能力（P < 0.05，P < 0.01），在共培养24小时和48小时后（图3H和I）。一致地，当PANC-1细胞与巨噬细胞共培养时，促进细胞迁移、侵袭和EMT的蛋白如p-Src和Snail的表达被诱导（图3J）。
TAM衍生的外泌体诱导PDAC细胞中eEF2K表达、细胞迁移和侵袭
外泌体是直径为30至120 nm的纳米囊泡，在肿瘤微环境中的细胞间通讯中起重要作用，并可通过诱导细胞增殖、侵袭和转移以及重塑TME来促进肿瘤生长和进展。我们调查了巨噬细胞衍生的外泌体在eEF2K诱导和PDAC细胞侵袭性中的作用。简而言之，从THP-1细胞、M0和M2巨噬细胞的培养基中分离外泌体。然后，将PANC-1、MiaPaCa-2和PSC细胞用外泌体处理48小时，浓度为1.5 × 10^8个外泌体/ml，如图4A所示。使用Nanosight NS300对外泌体的特征、大小和浓度进行表征（图S5A-C）。
我们发现，PANC-1细胞（图4B）、PSCs（图S4A）和MiaPaCa-2细胞（图S4B）在外泌体存在下eEF2K表达水平增加。巨噬细胞衍生的外泌体还增强了集落形成（P < 0.001，图4C）、迁移（P < 0.01，图4D）和侵袭能力（P < 0.001，P < 0.0001，图4E）。类似地，巨噬细胞诱导了PSCs的侵袭能力（图S4C）。热图分析显示，用单核细胞和巨噬细胞衍生的外泌体处理的PANC-1细胞中多种蛋白的表达增加。具体而言，我们观察到MAPK（p-ERK-T202-Y204）、波形蛋白、YAP（pS127）、AMPK（pT172）、eIF4G、肌球蛋白-IIa（pS1943）、Stat3（pY705）和B-Raf（pS445）水平升高，表明M2巨噬细胞衍生的外泌体在胰腺癌细胞中诱导了各种致癌信号通路。
敲低eEF2K导致PDAC细胞中MCP-1和Gas6表达减少
由于我们发现eEF2K表达上调驱动了细胞增殖、侵袭和肿瘤生长，我们接着研究了eEF2K与TAM衍生因子如MCP-1（一种参与单核细胞募集和肿瘤浸润的关键趋化因子）以及单核细胞-巨噬细胞分化的相互作用。类似地，我们专注于另一个关键因子Gas6，它由TME中的各种细胞类型释放，包括巨噬细胞。已知癌细胞会刺激巨噬细胞产生Gas6以促进癌细胞增殖。Gas6表达增加进一步诱导了癌症的侵袭性，并释放出可以触发更多Gas6产生的因子，形成恶性循环。因此，我们探讨了eEF2K与TAM衍生因子MCP-1和Gas6之间的相互作用。PANC-1细胞中eEF2K的过表达导致MCP-1和Gas6表达增加（图5A）。主要由M2巨噬细胞释放的MCP-1在共培养条件下显著增加（P < 0.0001；图5B）。还发现PANC-1细胞在巨噬细胞存在下细胞内MCP-1水平升高（图5C）。
MCP-1和Gas6在PDAC细胞中诱导eEF2K表达
为了确认MCP-1和Gas6对eEF2K表达的直接影响，我们用Gas6和MCP-1分别处理PDAC细胞30分钟和24小时，随后分析eEF2K表达。如图5D所示，暴露于Gas6或MCP-1后，PANC-1细胞中eEF2K表达显著上调。MCP-1和Gas6处理不仅诱导了eEF2K表达，还激活了Axl和Src，表现为p-Axl（Thr702）和p-Src（Tyr416）水平升高，以及VEGF表达上调，分别是细胞增殖、迁移/侵袭和血管生成的关键介质（图5E）。此外，Gas6诱导了MMP-2和Snail的表达，分别是细胞侵袭和上皮-间质转化（EMT）的介质（图5F）。MCP-1也略微增强了PANC-1细胞的集落形成能力（P < 0.05；图S4D）。
为了研究eEF2K介导的双向信号机制，我们在PANC-1和MiaPaca-2细胞中敲低了eEF2K。敲低eEF2K导致PANC-1（图5G）和MiaPaCa-2细胞中Gas6、p-Axl和MCP-1蛋白水平降低（图5H）。一致地，沉默Axl（Gas6的受体）降低了MiaPaCa-2细胞的集落形成、迁移和侵袭能力（图S6A-C）。
接下来，我们评估了eEF2K是否能调节TAM细胞中的MCP-1。我们的体外研究表明，MCP-1暴露诱导了M0巨噬细胞分化为M2-TAM，表现为人类M2-TAM标志物CD206表达增加（图S7A）。有趣的是，我们还发现MCP-1处理显著诱导了巨噬细胞中eEF2K的表达，而在M0巨噬细胞或白介素刺激的M2巨噬细胞中没有eEF2K表达（图S7A）。一致地，eEF2K沉默降低了M2巨噬细胞中MCP-1受体CCR2的表达，进一步证明了eEF2K与MCP-1/CCR2轴之间存在正反馈循环（图S7B）。此外，M2-TAM中eEF2K抑制减少了Gas6的表达（图S7B），表明Gas6与eEF2K之间可能存在串扰。
结果表明，我们在PDAC肿瘤中揭示了一个新的调节反馈回路，涉及eEF2K、MCP-1和Gas6，该回路促进了M2-TAMs的积累并增强了肿瘤侵袭性（图6）。因此，靶向eEF2K/MCP-1/Gas6轴代表了一种有希望的治疗策略，可以破坏这一循环并抑制PDAC的进展。
【讨论】
本研究展示了eEF2K表达与PDAC患者不良预后和较短生存期相关的新发现。eEF2K促进肿瘤生长和进展，更重要的是，体内抑制eEF2K在多个PDAC肿瘤小鼠模型中显著抑制了肿瘤生长且未观察到毒性，表明eEF2K是PDAC的一个可操作的新靶点。此外，我们的研究结果强调了eEF2K在介导PDAC细胞与巨噬细胞之间复杂串扰中的关键作用，从而重新编程肿瘤微环境并诱导TAMs的募集和积累，这也与患者生存期短相关。
我们首次证明了胰腺癌细胞与巨噬细胞之间的双向相互作用导致了eEF2K信号轴的上调，进而促进了PDAC细胞的增殖、迁移、侵袭和M2型TAMs的积累。我们的研究结果表明，PDAC细胞中的eEF2K表达是通过与M2-TAMs的通信通过分泌MCP-1、Gas6和外泌体诱导的。此外，PDAC细胞中eEF2K的异位表达导致了单核细胞趋化因子如MCP-1和Gas6表达的增加，表明PDAC细胞与TAMs之间存在一个新的正反馈回路。此回路持续积累M2-TAMs，进一步诱导eEF2K并促进胰腺癌的生长和进展。值得注意的是，在PDAC小鼠肿瘤异种移植模型中体内沉默eEF2K抑制了肿瘤生长，减少了MCP-1的表达并降低了促肿瘤M2-TAM的积累。因此，eEF2K成为胰腺癌的一个有前途的治疗靶点，有可能调节TME内的相互作用并改善患者预后。
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