摘要
纳米医学和纳米技术的最新进展扩大了多功能纳米结构的应用范围，由此催生了用于肿瘤学和核医学的新型靶向给药系统。木瓜蛋白酶（番木瓜蛋白酶）凭借其药用特性，包括抗癌效果，成为绿色纳米技术的可行选择。本研究考察了木瓜蛋白酶负载的硒纳米颗粒(PaSe NPs)对HepG2肝细胞癌细胞的作用。PaSe NPs通过化学合成制备，并采用紫外-可见光谱、傅里叶变换红外光谱和透射电子显微镜(TEM)对其结构、光学及形态特性进行表征。通过细胞毒性检测和吖啶橙/溴化乙啶(Ao/EB)染色评估了硒纳米颗粒、木瓜蛋白酶及PaSe NPs的抗癌活性。结果显示，PaSe NPs的细胞毒性率显著高于单独的硒纳米颗粒。在HepG2细胞的三维(3D)模型中，PaSe NPs有效抑制了球体生长。分子对接分析确定了PaSe NPs对肝细胞癌细胞中7ZA2受体的最佳结合构象。Se-Pap纳米制剂展现出强大的体外活性，有望作为抗癌剂进一步开发用于临床应用。
引言
肝癌包含多种恶性肿瘤，具有不同的组织学特征和不良预后。肝母细胞瘤、肝细胞癌(HCC)、肝细胞腺瘤、肝内胆管癌(iCCA)和儿童肝肿瘤是主要的肝脏肿瘤类型。值得注意的是，HCC和iCCA的发病率持续上升[3]，使癌症控制成为重大挑战[4]。HCC的全球患病率位居前列，是癌症相关死亡的第二大主因[1]。HCC年发病率估计为60万-80万例（占所有人类癌症的5.6%），预计到2030年将增至近100万例[2]。
当前癌症治疗方法包括放疗、化疗和激素替代疗法[5]。除对癌细胞的靶向选择性外，治疗的安全性和有效性也是基本要求。然而，药物靶向和分布缺陷导致上述疗法产生不良副作用[6]，因此亟需改良现有药物并开发新型配方技术[7,8]。硒纳米颗粒(Se NPs)作为一种新型纳米材料，在电子、催化、光学、传感器和食品包装等领域应用广泛。Se NPs表现出显著的体外和体内生物活性且毒性极低[10,11]，作为递送系统具有抗氧化、抗炎、抗癌和免疫调节功能。
植物化学物质因其潜在抗癌作用正受到广泛关注。酶委员会将源自番木瓜的木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)归类为半胱氨酸内肽酶[12,13]。该酶在细胞分离操作中高效且不损伤组织[14]。研究证实木瓜蛋白酶在多种癌症中具有抗癌活性，可诱导细胞凋亡并促进程序性细胞死亡[15]。此外，它能破坏细胞粘附从而抑制癌细胞生长增殖[16]，对HT-29结肠直肠癌细胞有显著杀伤力，并能提高5-氟尿嘧啶的疗效同时降低其毒性[17]。文献还指出，作为纳米制剂的木瓜蛋白酶在生物活性测试中比天然酶形式更具优势[18,19]。基于木瓜蛋白酶与硒纳米颗粒的潜在协同效应，我们假设PaSe NPs对HepG2肝癌细胞的细胞毒性和凋亡诱导能力将优于单独的Se NPs或木瓜蛋白酶。预计这些效果不仅能在传统二维培养中观察到，更能在生理相关的三维球体模型中得到验证，从而全面评估其抗癌潜力。
材料与方法
亚硒酸钠购自美国马萨诸塞州纽伯里波特的Strem Chemicals, Inc.公司。吖啶橙、溴化乙啶、结晶紫、抗坏血酸、二甲基亚砜(DMSO D2650)和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物(MTT MAK366D)购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma Chemical Co.公司。磷酸缓冲液、生理盐水、戊二醛和乙酸来自德国默克公司。
硒纳米颗粒的制备
硒纳米颗粒(Se NPs)的化学制备法具有步骤精简、原料经济、可重复性高及易于规模化等优势。抗坏血酸(C6H8O6)作为还原剂，通过提供电子将Se(IV) (SeO32−)还原为单质硒(Se°)，同时生成脱氢抗坏血酸(C6H6O6)。残留的抗坏血酸通过静电排斥作用稳定硒纳米颗粒并防止过度聚集。
结论
本研究描述了硒纳米颗粒(Se NPs)的合成与表征，以及木瓜蛋白酶的功能化修饰过程。对HepG2细胞的抗癌功效评估表明，与未负载木瓜蛋白酶的硒纳米颗粒相比，PaSe NPs显著提升了细胞毒性活性。机制研究表明，其抗肿瘤作用与caspase-8基因表达上调密切相关，证实了外在凋亡通路的靶向激活效应。
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