摘要
背景
衰老增加了心血管疾病、神经系统疾病和癌症等健康风险。老年人因多重用药导致并发症凸显了创新疗法的必要性。间充质干细胞(MSCs)在再生医学中前景广阔，但其数量和功能随年龄下降。这种衰退被非血红素铁积累加剧，导致细胞损伤。降低铁含量可能增强老年人MSCs功能，铁螯合剂甲磺酸去铁胺(DFO)或可缓解氧化损伤。
方法
本研究采用网络药理学与生物信息学探索DFO对衰老MSCs的作用。通过PharmMapper服务器获取DFO靶基因，从四个数据库收集MSCs衰老相关基因。进行功能富集分析、蛋白质相互作用网络构建及枢纽基因鉴定，并利用GSE35959和GSE68374微阵列数据集验证。
结果
鉴定出148个与DFO治疗MSCs衰老相关的共有基因。验证显示DFO显著影响Rap1和PI3K-Akt信号通路等关键途径。发现13个主要靶基因参与细胞周期和分裂调控，其中7个在体内外研究中呈现相似表达模式，提示其为MSCs衰老关键靶点。
结论
该发现揭示了DFO增强MSCs功能和延缓衰老的机制，为开发促进老年群体修复再生的治疗策略奠定基础。
1 引言
衰老显著影响健康，增加心血管疾病、神经系统疾病和癌症风险。老年人因多重用药易出现药物相互作用，凸显新型治疗的必要性。目前，利用MSCs的细胞疗法因其自我更新、多向分化、增殖能力和免疫调节特性受到关注。然而，衰老会降低MSCs数量和功能，损害再生能力。因此，开发重振或替代衰老MSCs的策略对提高治疗效果至关重要。
研究表明，衰老与非血红素铁在组织中的积累有关，这会加速细胞衰老。铁作为必需过渡金属参与DNA合成及细胞生长死亡调控。当铁超过转铁蛋白结合能力时，会转化为Fe2+形式，催化活性氧(ROS)生成，导致脂质过氧化和DNA断裂，促进细胞衰老和铁死亡。值得注意的是，铁积累增加的同时MSCs减少，提示过量铁对MSCs再生能力的损害可能是老年人组织修复能力下降和年龄相关疾病发生的重要因素。因此，降低铁含量可能是对抗MSCs衰老的有效治疗策略。
甲磺酸去铁胺(DFO)是一种六齿螯合剂，用于治疗铁中毒。其铁复合物去铁氧胺具有显著稳定性，可防止铁离子催化自由基反应。研究表明，DFO可显著增加HIF-1α和VEGF水平，增强MSCs再生潜力。研究显示DFO通过减少DNA损伤和增强细胞存活，有效防止人子宫内膜干细胞的氧化应激诱导衰老。值得注意的是，DFO处理的人子宫内膜干细胞保留了其特性，即使在氧化应激和重新接种后仍与对照细胞无异。这表明DFO可完全预防氧化应激诱导衰老的不利影响。另一项研究发现，尽管DFO预处理通过增加分泌组和抗氧化能力提高MSCs治疗潜力，但这些效果是短暂的。一旦去除DFO，HIF-1α水平恢复基线，相关益处减弱。在糖尿病及其并发症研究中，DFO预处理人脂肪来源MSCs导致HIF-1α水平浓度依赖性增加，同时增强促血管生成因子VEGF及神经营养和抗炎介质的mRNA表达。这些发现表明DFO效果可能取决于其浓度和应用方式。铁超载已被证明会负面影响MSCs来源的成骨细胞活性，DFO通过螯合过量铁可能上调HIF-1α表达，促进成骨分化，支持改善骨骼健康。此外，另一项研究显示，DFO预处理骨髓来源MSCs通过调节趋化因子受体和蛋白酶增强其归巢能力，提高植入效果和总体治疗效果。
网络药理学是研究化合物、蛋白质、基因和疾病间复杂相互作用的有力工具。利用该方法，研究人员可深入了解特定化合物对特定疾病的影响，揭示潜在治疗效果。本研究应用网络药理学探讨DFO对MSCs衰老的影响，旨在揭示其抗衰老作用的潜在机制。同时利用生物信息学分析确定该过程中的关键枢纽基因，全面解析DFO介导的MSCs衰老延迟相关分子通路（图1）。
图1 研究流程图。DFO：去铁胺，MSCs：间充质干细胞，GO：基因本体，KEGG：京都基因与基因组百科全书
2 材料与方法
2.1 获取去铁甲磺酸靶基因
首先从PubChem网站提取去铁甲磺酸(DFO)的结构文件，然后通过PharmMapper服务器和Uniprot网站获取其靶基因信息。
2.2 获取MSCs衰老相关基因
本研究使用的MSCs衰老相关基因来自Kang等人先前研究，通过整合DrugBank、GeneCards、OMIM和PharmGKB数据库数据鉴定出衰老相关基因。
2.3 鉴定DFO靶向的MSCs衰老相关基因
使用SRplot在线工具的维恩图鉴定DFO靶基因与MSCs衰老相关基因的交集，找出DFO和MSCs衰老共有基因。
2.4 功能富集分析
使用Gene Ontology分析和KEGG富集分析进行基因功能富集分析，通过Enrichr网络工具和DAVID完成，结果用SRplot展示。
2.5 蛋白质相互作用网络构建与枢纽基因鉴定
使用STRING数据库分析蛋白质相互作用(PPI)，将结果导入Cytoscape软件可视化。随后使用CytoHubba插件识别枢纽基因。
2.6 数据集验证共有基因
利用GEO数据库的GSE68374和GSE35959数据集评估衰老对MSCs的影响。使用R软件limma包处理数据，以|logFC|>1和p值<0.05为标准筛选差异表达基因(DEGs)。使用ggplot包生成火山图，Enrichr进行通路分析。将DEGs与148个共有基因交叉，使用pheatmap和corrplot包创建热图。
2.7 关键基因鉴定
将148个共有基因与每个数据集的DEGs再次交叉，进行通路富集和生物学功能分析。使用R软件包生成箱线图比较这些基因在各数据集中的表达模式。
3 结果
3.1 DFO与MSCs衰老共有基因
通过分析鉴定出999个PDB ID（图2A），这些PDB ID通过UniProt数据库转化为基因符号，并与数据库中的3258个MSCs衰老相关基因交叉，最终鉴定出148个共有基因（图2B），表明这些基因是DFO在MSCs衰老中的潜在靶点。
3.2 GO与KEGG富集分析
GO和KEGG富集分析揭示了148个共有基因的功能和相关通路。在GO富集分析中，DFO靶向的衰老基因主要富集于跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、蛋白质磷酸化和肽基酪氨酸磷酸化（生物学过程）。在细胞组分分析中，这些基因在细胞内膜结合细胞器、丝胶蛋白-1富集颗粒腔和丝胶蛋白-1富集颗粒中表达最高。分子功能方面，蛋白质酪氨酸激酶活性、内肽酶活性和丝氨酸型内肽酶活性是这些基因的主要分子活性（图2C）。KEGG富集分析显示，共有基因主要与Ras和MAPK信号通路相关（图2D）。
图2 148个共有基因分析。A：去铁胺分子结构。B：维恩图显示DFO靶基因与衰老MSCs基因的交集。C：148个共有基因的GO富集分析，包括(i)生物过程，(ii)细胞组分，(iii)分子功能。D：148个共有基因的KEGG富集分析。E：构建的PPI网络及三个关键模块，每个模块用不同形状和颜色表示。F：枢纽基因的PPI网络
3.3 共有基因的PPI网络分析
分析显示共有基因的PPI网络包含146个节点和1,456条边（图2E）。使用CytoHubba鉴定出20个枢纽基因：MET、ANXA5、HSP90AA1、SRC、IGF1、GSK3B、ALB、CASP3、KDR、IGF1R、JAK2、MMP9、PGR、STAT1、XIAP、PARP1、MMP2、EGFR、BRAF和MAPK8。其中EGFR、SRC、ALB、CASP3、HSP90AA1、ANXA5和MMP9显示最高网络连接性（图2F）。
3.4 差异表达基因与验证基因分析
为评估GSE35959和GSE68374数据集的表达模式，生成火山图（图3A，C）。该图显示基因表达变化程度与统计显著性关系。对DEGs进行通路富集分析，发现Rap1信号通路和PI3K-Akt信号通路与共有基因的KEGG分析一致（图3B，D）。将148个共有基因与GSE35959和GSE68374的DEGs交叉（图3E，F），分别鉴定出32个和50个基因。为评估这些基因的表达模式，生成单独的热图（图3G，H）。
图3 GSE35959和GSE68374数据集与验证基因分析。A，B：GSE35959 DEGs的火山图和通路富集分析。C，D：GSE68374 DEGs的火山图和通路富集分析。E，F：维恩图显示148个共有基因与GSE35959和GSE68374数据集DEGs的交集。G，H：32个和50个鉴定基因在各自数据集中的表达特征热图
3.5 关键基因鉴定与分析
为鉴定DFO靶向的潜在关键衰老基因，将32个和50个基因交叉，最终选择13个基因（图4A）。GO分析显示这些基因主要参与细胞周期相关机制、丝氨酸/苏氨酸激酶活性和铁相关机制（图4B）。KEGG分析显示这些基因在细胞衰老、细胞周期和P53及PI3K-Akt信号通路中发挥作用（图4C）。值得注意的是，13个最终基因与枢纽基因没有重叠。比较这些基因在每个数据集中的表达模式，发现7个基因在体内外显示相似表达水平（图4D）。
图4 关键基因分析。A：维恩图显示32个基因与50个基因的交集，突出13个关键基因。B-C：13个鉴定基因的GO和KEGG富集分析。D：比较13个关键基因在体外（GSE35959）和体内（GSE68374）样本中的表达模式箱线图
为更详细比较这7个基因，生成单个基因表达箱线图（图5A，B）。
图5 两个数据集中7个关键基因表达模式的箱线图。A：GSE35959数据集中7个基因的表达水平，比较早期和晚期传代MSCs。B：GSE68374数据集中相同7个基因的表达水平，比较胎儿和成年MSCs。p < 0.05 (*)；p < 0.01 (**)；p < 0.001 (***)；ns：无显著差异
4 讨论
衰老特征是细胞和组织损伤的逐渐积累，特别是间充质干细胞(MSCs)的衰老是重要贡献者。随着MSCs衰老，它们失去分化能力，损害组织再生和修复。此外，衰老MSCs的旁分泌活动改变，分泌过量炎性因子和蛋白酶，影响细胞功能和周围微环境。因此，理解MSCs衰老机制对制定有效对抗策略至关重要。研究表明，铁积累随年龄增长而增加，过量铁对MSCs再生能力的有害影响可能是老年人年龄相关疾病发展的重要因素。去铁胺(DFO)作为铁螯合剂具有多种生物功能，包括调节干细胞活性、免疫调节、促进血管和成骨前体细胞、通过清除ROS发挥抗氧化作用。由于其稳定和诱导HIF-1α积累的能力，DFO常被归类为缺氧模拟剂，可复制低氧环境相关的细胞益处。低氧是HIF-1α的天然生理诱导剂，已被证明具有抗衰老保护作用。例如，低氧条件（1-1.5%氧气）培养的细胞显示增殖能力增加和寿命延长，相较于正常氧条件（20-21%氧气）培养的细胞。
本研究通过生物信息学分析揭示了DFO对衰老MSCs的影响，鉴定其在这些细胞中的靶基因，并探索DFO可能发挥治疗作用的关键信号通路。分析发现148个共有基因主要参与调节酪氨酸激酶活性以及Ras和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路。酪氨酸激酶是信号级联中的关键介质，在分化、细胞分裂、生长和细胞死亡等生物过程中起重要作用。因此，酪氨酸激酶活性改变及Ras和MAPK等通路的激活可能极大影响衰老过程。Ras是小GTP酶，通过激活ERK/MAPK信号级联在细胞表面受体酪氨酸激酶(RTKs)信号转导中起重要作用。Ras蛋白协调多种细胞反应，包括增殖、分化、衰老和代谢。减少Ras/MAPK信号活动的基因干预已被证明可延长寿命和改善健康跨度，帮助延迟年龄相关功能衰退的开始和/或进展。支持这一观点，研究显示在非常小的胚胎样干细胞(VSELs)中耗竭RasGrf1可防止衰老并减轻这些细胞在成人组织中的年龄相关衰退。此外，这些结果表明大多数枢纽基因积极参与这些关键信号通路和生物功能，强调它们在调节基本细胞过程和维持整体生物稳态中的关键作用。
数据集验证结果显示，Rap1信号通路和PI3K-Akt信号通路可能是DFO调节MSCs衰老的潜在机制。Ras相关蛋白1(Rap1)是Ras样小GTP酶，通过ERK、PI3K/Akt和MAPK等信号通路调节细胞增殖、存活和凋亡。许多研究显示这些通路在预防细胞死亡中的重要性。cAMP激活的交换蛋白(Epac)作为cAMP结合蛋白，具有Rap1的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)活性。研究突出葡萄糖依赖性促胰岛素多肽的作用，其通过Epac/Rap1信号通路抑制铁死亡并维持衰老大脑稳态。此外，Erb-B2受体酪氨酸激酶4(ERBB4)在低氧条件下MSCs存活中起关键作用。研究表明，ERBB4过表达可通过PI3K/Akt通路恢复衰老MSCs并促进血管生成。另一项研究显示，miR-338-5p过表达可通过促进活性Rap1表达激活PI3K/Akt通路，增强神经元存活。已证明PI3K/Akt信号通路通过磷酸化GSK-3β的Ser9(p-GSK3βSer9)增强其失活，进而激活Nrf2，这是对抗氧化应激的关键调节因子。另一方面，GSK-3β缺失导致铁代谢相关蛋白表达减少，破坏铁稳态并降低生物可利用胞内铁水平。这些发现表明Rap1、MAPK和PI3K/Akt信号通路及其下游通路之间存在密切关联。综合数据表明，DFO可能通过激活Rap1通路积极影响衰老MSCs，进而影响MAPK和PI3K/Akt通路。此过程可能涉及HIF-1α诱导和通过降低细胞铁水平调节低氧条件。
最终鉴定的13个基因中，有7个在两个数据集中显示相似表达模式：SNRPA、BST1、MMP16、XDH、KIF11、CHEK1和AURKA。这些基因在调节细胞周期（包括细胞分裂、DNA损伤修复和细胞增殖迁移）中起关键作用。其功能紊乱会损害细胞过程，导致细胞周期阻滞，最终导致衰老或细胞死亡。以下是该领域相关研究的总结：SNRPA（小核糖核蛋白A肽，也称为U1A）促进细胞增殖和迁移。骨髓基质抗原1(BST1)作为衰老基因在老年人肝脏中表达上调。MMP16在来自老年供体的部分重编程(PR)原代人皮肤成纤维细胞中的表达显著高于衰老细胞，而在年龄相关白内障(ARC)病例中表达水平较低。关于二甲双胍对细胞应激影响的研究发现，二甲双胍处理人睑板腺上皮细胞(hMGECs)后，氧化应激标记物尤其是黄嘌呤脱氢酶(XDH)显著增加。KIF11基因（驱动蛋白家族成员11）的抑制（其在细胞分裂期间形成和维持双极有丝分裂纺锤体中起关键作用）显著降低食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞的增殖和迁移能力。检查点激酶1(CHEK1)基因（参与细胞周期检查点和DNA损伤反应的丝氨酸/苏氨酸激酶）的高活性与女性卵母细胞长寿和改善生殖寿命相关。选择性抑制Aurora激酶A（AURKA），其对中心体成熟和有丝分裂进入调节至关重要，导致中心体分离和有丝分裂纺锤体形成缺陷，引发纺锤体组装检查点(SAC)依赖的细胞周期阻滞、有丝分裂滑动和细胞凋亡。
通路分析和生物相互作用研究结果表明，这些基因主要参与细胞周期调控和细胞衰老过程。衰老细胞显著促进衰老过程和相关年龄相关损伤。细胞衰老特征是永久性增殖停滞状态，由各种生理和病理应激触发，包括氧化应激、DNA损伤和炎症。DNA损伤是细胞衰老的关键标志，激活DNA损伤反应(DDR)。此反应暂停细胞周期，允许修复受损DNA。如果修复失败，细胞可能经历凋亡或进入衰老。该过程的关键调节因子包括p53、p21和p16等蛋白，它们在激活DDR中起关键作用。暴露于DNA损伤或氧化应激增强p53活性，使其结合p21启动子区域的特定响应元件并激活p21。此作用抑制细胞周期进展。值得注意的是，细胞内过量铁也可激活p53，进一步损害DNA修复机制，诱导铁死亡，加速衰老并促进神经退行性疾病。有趣的是，尽管存在DNA断裂和ROS增加，衰老细胞通常不会经历凋亡。相反，它们激活促生存通路，包括PI3K-Akt通路、HIF-1和热休克蛋白(HSP)90。研究表明，达沙替尼（酪氨酸激酶抑制剂）与槲皮素（抑制PI3K-Akt信号）的组合可缓解衰老并改善年龄相关表型。
值得注意的是，尽管这些生物信息学分析结果提供了DFO对MSCs衰老潜在影响的宝贵见解，但需通过更严格的实验验证DFO对MSCs衰老的影响并确认这些初步发现。未来研究应包括使用各种细胞实验的详细体外实验，评估衰老标志物、增殖率和MSCs功能能力。此外，使用动物模型的体内研究对于评估药物在复杂生物系统中的功效和安全性至关重要。这些多学科方法将有助于验证生物信息学预测，并推动DFO作为再生医学中潜在治疗剂的发展。
5 结论
本生物信息学研究尝试调查DFO在MSCs衰老中的作用并改善其状况。根据研究结果，Rap1/PI3K-AKT信号通路是DFO重振衰老MSCs的有效通路。此外，另一个潜在通路是PI3K-AKT/HIF-1α轴，DFO通过降低胞内铁水平、促进HIF-1α激活，可能减少铁死亡（衰老过程的重要因素），从而减轻衰老。因此，针对和调节这些信号通路的策略，包括DFO，可能具有影响衰老并增强寿命和健康跨度的能力。
数据可用性
MSCs衰老基因从DrugBank、GeneCards、OMIM和PharmGKB四个数据库获得。DFO靶基因也从PubChem网站获得。此外，用于基因验证的GSE35959和GSE68374数据集来自GEO数据库。其他支持本研究发现的数据可向通讯作者请求获得。
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