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马自发性心房颤动模型与人类共享蛋白质组变化
摘要
马与人类同为少数易发自发性心房颤动（AF）的哺乳动物，均表现出治疗后高复发率。治疗抵抗常归因于渐进性心房重构，但现有疗法未能有效干预这一过程。我们通过建立新型马自发性AF模型，研究疾病早期生物学通路变化。对8匹早期持续性AF马和8匹对照马的右心房、左心房及左心室腔进行数据独立采集质谱分析，发现所有三个腔室存在多个差异调控蛋白。通路富集分析和组织染色显示早期AF中细胞外基质（ECM）重构具有显著作用。其他关键蛋白质组变化涉及代谢、收缩性和蛋白折叠，且与人类公共数据库结果重叠。研究表明马与人类共享多个AF相关蛋白质组变化，为理解导致治疗抵抗的早期心房重构过程提供了转化见解。这些蛋白质水平变化可作为预防AF相关心房重构的生物标志物或药物靶点，改善跨物种治疗效果。
引言
心房颤动（AF）是一种高度流行的心律失常，其特征是心房内快速不规则电活动，导致心房收缩无效和血液淤滞。该病可导致卒中风险增加、心力衰竭和生活质量下降。尽管AF在人类中已有详细记录，马匹也是少数已知患AF的物种之一，纯种赛马患病率达4.9%，混合品种群体达6.2%。多项研究探讨了马匹AF的流行病学和发病机制，尽管其卒中和心衰发生率较低，但AF仍是影响马匹运动表现的最常见心律失常，常导致提前退役或安乐死。
马匹AF发病机制与人类有许多相似之处，包括相似的渐进病程、肺静脉异位和纤维化改变。尽管对AF驱动机制的认知不断增加，但两物种的临床管理仍具挑战。人类AF发病率持续上升，针对电生理紊乱的新疗法效果有限，且人马复发率均高达50%。为提高治疗成功率，理解驱动心律失常重构的分子通路至关重要。除干预电生理紊乱外，靶向心房重构可能构成更有效的"上游"管理策略。
基于质谱的蛋白质组学已用于研究人类AF心房变化。这些研究揭示了潜在的心房变化后果，尤其强调局部代谢改变。然而，研究受限于小样本量（n=3-10）且仅限于左心房（LA）或需心脏手术患者的左心耳样本。此外，多数患者伴随多种合并症（二尖瓣狭窄、心衰、冠心病等），且AF病程常达3个月以上。这种高度异质性研究群体使得区分AF诱导变化与其他疾病的改变变得困难。
在无潜在混杂变量的动物模型中研究AF早期阶段，可探讨导致AF治疗抵抗表型的关键早期变化。马匹通常在相对年轻时发展AF而无基础健康问题，从而克服了人类研究中混杂健康因素的局限性。本研究绘制了马匹自然AF的蛋白质变化图谱，并与人类公共数据库进行比较。通过在疾病早期阶段研究马匹心房致心律失常重构，并与人类数据对比，识别出可能成为AF预防或治疗靶点的共享代谢、收缩和结构性变化。
结果
马匹特征
本研究纳入8匹AF马和8匹经表面心电图确认窦性心律的健康马（ECG示例见补充图1）。两组马匹在年龄和体重方面无差异，但AF马匹左心房（LA）储库指数显著降低（表1）。
健康马匹与人类心脏蛋白质组高度重叠
为绘制健康马匹蛋白质组图谱，我们对心脏三个区域（右心房、左心房和左心室）进行无标记数据独立采集（DIA）-MS定量分析。分析共鉴定出3,400种蛋白（图1A）。与人类心脏蛋白质组数据库比较后，发现88.8%的重叠，表明健康马匹与人类心脏蛋白质组具有基础相似性（图1B）。主成分分析（PCA）显示左心室样本沿第一主成分聚类，占观察到方差的29.8%（图1C）。尽管第二主成分未显示心房样本的明确聚类，但右心房与左心房比较发现134种差异丰富蛋白（DAPs），包括TRMO、CKB、THEM4、BBOX1、PKIA和DTNA。通路富集分析显示左心房中"核糖体"和"氧化还原酶活性"通路富集，而右心房则显示更高代谢和线粒体蛋白关联。
AF马匹LA的蛋白质组分析揭示代谢和收缩功能改变
为研究不同心脏区域AF的蛋白质特征，我们首先比较对照组与AF组的左心房区域。PCA显示两组沿第二主成分形成两个独立聚类，占18.5%方差（图2A）。统计分析发现324种DAPs（补充表1）。上调DAPs的通路富集分析突出"代谢"和"电子转移活性"，而下调DAPs富集于"肌肉收缩"和"细胞骨架蛋白结合"（图2C和D）。具体而言，基因调控网络分析显示代谢调控因子PRKAA2在上调蛋白中富集，而转录因子SRF和NFE2在下调蛋白中富集。
AF马匹RA的蛋白质组分析揭示细胞外基质和收缩蛋白变化
接着比较对照组与AF马的右心房区域。PCA显示两组沿第四主成分形成两个聚类，占9.2%方差（图3A）。统计分析发现268种DAPs（图3B）。上调DAPs通路富集分析突出"细胞外基质组织"和"碳水化合物代谢"（图3C），而下调DAPs与"肌肉收缩"和"羧酸代谢"相关（图3D）。
AF马匹LV的蛋白质组分析揭示代谢通路改变
最后比较对照组与AF马左心室区域的蛋白质差异。PCA显示两组沿第三主成分形成两个独立聚类，占10%方差（图4A）。统计分析发现284种DAPs（图4B）。通路富集分析显示上调DAPs富集于"代谢"和"tRNA氨酰化"通路。下调DAPs分析同样突出"代谢"和"肌动蛋白"相关通路（图4C和D）。
有趣的是，在所有三个腔室中发现21种DAPs以相同方向调控（补充图2A-C），包括两个心房中VCAN上调和MYH6下调。所有区域DAPs的完整列表见补充表1。
组织学和蛋白质组分析揭示AF早期细胞外基质糖蛋白重构
AF进展的主要标志是结构重构，包括心房组织结构改变和纤维化。为研究三个心脏区域的纤维化程度，我们对组织进行苦味酸天狼星红和麦胚凝集素（WGA）染色。自动化分割图像分析显示AF马左心房胶原含量显著增加（p=0.01），而右心房和左心室与对照组相比无显著差异（图5A）。我们还发现AF马右心房WGA阳性含量强度显著更高（p=0.01），表明细胞外基质糖蛋白水平升高（图5B）。
为深入了解与细胞外基质重构相关的特定蛋白质变化，我们对蛋白质组数据中的细胞外基质蛋白进行富集分析。鉴定出左心房、右心房和左心室分别有324、268和284种细胞外基质相关蛋白（图6A-C；补充图3）。仅基于细胞外基质相关蛋白的PCA分析显示三个心脏区域均形成两个聚类（补充图3）。统计分析显示在AF与对照组比较中，左心房、右心房和左心室分别有23、21和22种差异表达的细胞外基质蛋白（非调整p<0.05；图6D-F）。有趣的是，大多数差异调控的糖蛋白在左心房和右心房上调，但在AF马的左心室下调（图6G-I）。
基于AF马中观察到的细胞外基质糖蛋白特异性调控，我们进一步研究了两个公开可用的人类AF患者数据库中的类似调控模式。与我们的马研究相似，约6%的左心房DAPs/基因与细胞外基质相关（图7A和B，补充图4）。此外，多个心房糖蛋白在蛋白质组和转录组水平均上调（图7C和D）。跨物种直接比较显示，如POSTN和VCAN等糖蛋白在人和马的左心房组织中均上调（图7E和F）。
AF马左心房蛋白质变化与人类AF相似
为研究马AF蛋白质组与人类的相似程度，我们将左心房DAPs与包含显著调控蛋白和基因的人类AF蛋白质组和转录组研究的精选基因列表进行比较。在我们研究中鉴定的282种DAPs中，41种与蛋白质组研究重叠，21种与转录组研究重叠。通过绘制我们研究与Doll等人（2017年）折叠变化差异的散点图，我们识别出多个共享上调蛋白如HSPA4、PSMD13和POSTN，以及共享下调蛋白如MYH6、TPM2、TNNT2。与van den Berg等人（2021年）的比较中，TNNT2也是共享下调蛋白。通路富集分析显示，共享蛋白中与"横纹肌收缩"相关的蛋白下调，而"细胞外区域"蛋白上调。
讨论
尽管进行了大量研究，但理解AF的分子发病机制和心房致心律失常重构的机制仍具挑战性，阻碍了有效的治疗和预防策略。据我们所知，本研究首次评估了自发性AF动物模型中AF诱导的蛋白质组变化。研究结果显示健康马与人类心脏蛋白质组存在显著重叠，突出了AF马模型的转化价值，并证实了先前发现。本研究还揭示了在健康模型生物中与早期AF相关的心房代谢、收缩和结构变化，并强调了细胞外基质糖蛋白变化在疾病早期的重要作用。最后，我们证明了AF诱导的蛋白质及其相关信号通路的变化在AF马和人类中是共享的。
马AF的蛋白质组分析揭示了三个心脏区域中代谢蛋白的变化。这一发现与一项研究人类AF患者心脏手术样本的研究结果一致。该研究发现，显著下调的蛋白中富集了线粒体功能相关蛋白。其中COX7B、IMMT和TIMM8A的丰度比健康组织少25倍以上。相比之下，我们观察到AF马左心房中线粒体蛋白增加，表现为氧化磷酸化和ATP合成功能富集。有趣的是，COX7A2在AF马左心房中上调，与人类观察结果相反。这种明显差异可能是由于物种特异性因素，但研究人群之间AF持续时间的不同也可能很重要。在阵发性或短暂持续AF中，线粒体被认为最初通过补偿高心房率和增强ATP合成来应对。然而，随着时间推移，持续的代谢压力可能导致线粒体分解和ATP生产下降。在此过程中，心肌细胞可能会将其首选能量底物从脂肪酸转换为葡萄糖，这种现象被称为胎儿表型变化。这种代谢重编程已在人类心血管疾病中观察到，包括扩张型心肌病、心脏肥厚和AF。这一过程与能量传感器AMPK的激活有关，我们在右心房基因调控网络分析中识别出该调控因子是AF中的关键转录调控因子。与此发现一致，我们在右心房中观察到与碳水化合物代谢相关蛋白的上调，进一步支持胎儿重编程作为马AF心房代谢反应组成部分的作用。
我们还发现AF马存在双心房细胞外基质蛋白变化，并通过左心房胶原含量增加和右心房WGA染色强度增加的组织学证据得到支持。这表明即使在疾病早期阶段，细胞外基质重构已经发生。结构重构被认为是人类治疗失败和复发的主要原因。本研究发现多个关键细胞外基质蛋白（包括MFAP5、VCAN、EFEMP1和PRELP）在双心房中上调。VCAN是细胞粘附、增殖和迁移的重要调节因子，由心脏成纤维细胞产生，之前已与人类AF患者左心耳中胶原生成成纤维细胞样细胞和细胞外基质基因表达增加相关。我们还观察到AF马双心房中MXRA5和TGM2下调。MXRA5在肾脏中具有抗炎和抗纤维化特性，可能在心脏中具有类似作用。在左心房中，马AF中显著更丰富的matricellular蛋白LGALS1和POSTN，强烈提示纤维生成增加，这从组织学染色中可见。LGALS1促进成纤维细胞分化，已被提议作为AF治疗的潜在靶点，并在人类AF中显著上调。值得注意的是，AF相关的糖蛋白如POSTN、MFGE8和MFAP5特别上调，这与之前的人类数据一致。总之，我们的发现强调AF发病早期阶段心房细胞外基质蛋白质组发生显著重构，突出早期治疗预防结构重构的重要性。
我们发现马和人类AF患者中存在一系列共享表达谱的蛋白。具体而言，观察到HSPA4和PSMD13的共享上调，这两种蛋白都参与监控蛋白质稳态（"蛋白稳态"）。HSPA4是热休克蛋白家族成员，协助蛋白质折叠和重新折叠，并被认为支持线粒体外膜组装。有趣的是，热休克蛋白通常在AF早期阶段上调，在应激细胞毒性环境中表现出心脏保护作用。PSMD13是26S蛋白酶体的重要组成部分，负责降解受损和泛素化蛋白。这个复合体对于通过降解错误折叠或受损蛋白维持细胞内蛋白平衡至关重要。虽然PSMD13在AF中的作用尚不明确，但研究表明它通过阻止TAK1泛素化来抑制NF-κB通路，TAK1是促炎信号通路的关键介质。因此，PSMD13对TAK1的抑制可能是AF中的一种保护反应。总之，热休克蛋白和泛素蛋白酶系统的增加表达表明蛋白质质量控制系统被激活，这可能是由于快速心房率引发的细胞骨架和肌节蛋白损伤。蛋白质稳态失调被认为是AF诱导重构的驱动因素，使这些蛋白成为AF治疗的潜在上游靶点。
最后，我们发现两个物种中AF相关的收缩蛋白下调，包括肌球蛋白（MYH6）、原肌球蛋白（TPM2）和肌钙蛋白（TNNT2）。多项研究发现人和马AF中都有心房收缩功能下降。使用超声心动图，我们观察到AF马左心房储库指数减少，这是机械功能障碍的指标。这一发现与先前的马研究一致，其中诱导AF三天后心房收缩力下降。细胞收缩功能低下此前已与人类卒中和血栓栓塞有关，这是AF患者的重要关注点。
虽然之前的研究使用过速起搏诱导模型研究AF病理生理学，但本研究首次使用自发性持续AF的临床前大动物模型。最近一篇关于转化AF研究挑战与解决方案的综述特别强调这是现有AF模型的局限性。目前的AF模型依赖于过速起搏、遗传操作或诱导炎症、自主神经或心室功能障碍来创建AF基质，因此无法提供关于健康动物中AF早期事件的见解，忽视了疾病启动相关的因素。马模型不仅因其自发性疾病而突出，还因其与人类相似的蛋白质组特征。此外，马匹与人类共享病理生理特征，如肺静脉异位，并且它们的AF进展过程与人类相似。大尺寸的心房允许重复进行纵向经静脉组织采样，这有助于未来研究AF进展中基质变化的时间进程。总体而言，马作为理解AF发病机制和早期进展的转化模型具有重要前景，这是需要填补的知识空白，以便开发新的AF疗法。
本研究存在某些局限性。AF和对照马的完美匹配不可行，这可能引入混杂因素，如品种、性别和年龄，这些可能会影响DAP识别。此外，应用了两种不同的采样方法：经静脉和死后采集。虽然这可能引入变异性，但PCA聚类主要由疾病状态和地区驱动，而不是样本类型、年龄或品种，表明这些潜在效应可能较小。知道这些马的确切AF持续时间也将是有利的。然而，由于AF并非实验性诱导，确定确切的起病时间是不可能的。在人类中研究AF病理发生具有若干挑战，由于心房组织可用性有限，以及伴随疾病的高度普遍性。虽然我们探讨了马和人类AF诱导变化在RNA和蛋白水平的相似性，但我们认识到直接比较转录组和蛋白质组数据的局限性。基因表达和蛋白丰度受不同调控机制控制，很少完美相关。然而，我们的分析识别了共享分子，支持蛋白质组比较中发现的保守生物学反应。未来结合马转录组数据的研究对于推进我们对AF的比较理解至关重要。尽管是不同物种，在马中研究AF具有明显优势，可以在没有任何基础系统性或局部心脏病的情况下捕捉早期自发AF。
总之，我们的研究提供了关于早期AF病理生理学的重要见解，这些机制可能驱动人类和马的心律失常发生。我们识别了早期代谢和收缩适应，以及马心脏中的结构重构迹象，其中许多与人类AF患者共享。这些发现强调了AF管理中早期干预的重要性，并为缓解早期AF诱导重构的潜在机制靶点提供了见解。此外，在活马患者中成功实施无创经静脉心脏采样证明了纵向研究心房致心律失常重构动态的可行性。我们的研究介绍了一种新的自发性AF马模型用于转化AF研究。
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