摘要
背景
随着年龄增长，肾功能逐渐下降，主要原因是慢性低度炎症。间充质干细胞（MSCs）在某些免疫介导的肾脏疾病中已显示出免疫调节作用，但它们在无慢性肾脏疾病（CKD）的老年个体中维持肾功能的作用尚不清楚。本研究呈现了一项针对帕金森病（PD）的随机临床试验的次要结果，评估了异体人骨髓来源间充质干细胞（allo-hMSCs）对具有正常肾功能的老年帕金森病患者肾功能的影响。
方法
研究对象为年龄在50-79岁之间、基线估计肾小球滤过率（eGFR）>60 mL/min/1.73 m2的帕金森病患者，他们被随机分配接受三次allo-hMSC输注、一次安慰剂后两次allo-hMSC输注或三次安慰剂输注，输注间隔为18周。在基线、前两次输注后9周以及第40周和第88周，通过eGFR、血清肌酐（SCr）和血尿素氮（BUN）评估肾功能。eGFR使用2021年CKD-EPI公式计算。采用贝叶斯建模方法估计治疗效果的后验概率（PP）。
结果
45名随机分配的患者中，44名被纳入分析；43名完成了全部输注，40名完成了88周的随访。三输注组（N=16）的eGFR平均年增长为3.29 mL/min/1.73 m2，而两输注组（N=14）和安慰剂组（N=15）则分别下降-1.46和-2.92。三输注组的SCr在第40周（PP：93.9%）和第88周（PP：86.2%）较安慰剂组降低了-0.12 mg/dL，而两输注组与安慰剂组之间SCr无显著差异。BUN水平在各治疗组与安慰剂组之间无显著差异。
结论
在具有正常肾功能的老年帕金森病患者中，重复allo-hMSC输注与肾功能指标改善相关。尽管结果令人鼓舞，但这些发现是初步的，可能仅适用于帕金森病患者。需要进一步研究评估其在更广泛老年群体中的潜在益处。
试验注册
ClinicalTrials.Gov. NCT04506073. 2020年11月09日。
引言
老年人口正在成为日益增长的人口挑战，预计到2054年，65岁及以上人口将占总人口的23%。这一人口结构变化伴随着与年龄相关的神经退行性疾病（尤其是帕金森病）患病率的增加，65岁以上人群中约有1%患病，85岁以上人群中超过5%患病。与此同时，60岁以上人群中39.4%存在慢性肾脏疾病（CKD），并且CKD也与更高的帕金森病患病率独立相关。虽然这一关联最初被归因于基底节中的尿毒症毒性，但越来越多的证据支持存在"肾脏-大脑轴"，即循环α-突触核蛋白的肾脏清除功能受损可能导致其在大脑中积累和传播，最终导致多巴胺能神经退行性变以及帕金森病运动和非运动症状的发生。
最近，研究人员提出了一个潜在的反向关系：帕金森病本身，特别是其自主神经功能障碍，可能对肾功能产生负面影响。帕金森病中常见的心血管和泌尿系统自主神经功能障碍，如直立性低血压、卧位高血压和神经源性膀胱，可能损害肾脏灌注，增加感染风险，并导致肾脏损伤。在相关突触核蛋白病（如纯自主神经功能衰竭）中观察到的类似模式支持这一可能的联系，这些患者显示出显著较低的eGFR。然而，由于缺乏对具有正常肾功能的帕金森病患者进行的大型前瞻性研究，目前尚无明确证据表明帕金森病独立增加CKD风险，因此它目前未被认可为正式风险因素。
然而，衰老本身与肾脏的结构和功能变化相关，包括肾小球衰老和肾小管萎缩。这些变化导致肾小球滤过率（GFR）每年约下降-1 mL/min/1.73 m2。因此，70岁以上人群中超过一半的人eGFR低于60 mL/min/1.73 m2，这一功能水平被定义为CKD 3期。
肾脏衰老的特征是多种相互关联的机制，包括端粒缩短、细胞衰老和凋亡、线粒体和溶酶体功能障碍、sirtuin和Klotho信号通路变化、肾素-血管紧张素-醛固酮系统退化以及慢性炎症。动物模型的最新研究表明，慢性炎症是肾脏衰老的初始触发因素，肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL）-6可能失调戊糖磷酸途径，导致氧化应激增加，这是细胞衰老和损伤的已知驱动因素。这一假设进一步得到纵向研究的支持，这些研究表明TNFα和IL-6的水平及其增加速率与老年人群中的肾功能障碍相关。尽管炎症在肾脏衰老中起着关键作用，但它并非唯一的机制。其他途径，包括恢复sirtuin活性、调节WNT/β-catenin信号传导以及激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，也被认为与肾脏衰老有关，并代表再生研究中的重要治疗靶点。
除了与衰老相关的生理变化外，非传染性慢性疾病的患病率增加也导致CKD发病率上升，影响27.5%的高血压老年患者和40%的糖尿病患者。然而，衰老本身已被提出作为高血压患者肾功能障碍的独立贡献因素，可能加速已经因高血压和其他慢性疾病而处于风险中的个体eGFR下降。目前尚无有效疗法能够阻止肾脏衰老的自然进程或与年龄相关的肾脏疾病的不利进程。这一未满足的需求推动了再生医学的研究，包括干细胞疗法在减缓与年龄相关的肾功能下降和恢复肾功能方面的潜在应用。
间充质干细胞（MSCs）是从各种组织（包括骨髓、脂肪组织、脐带和外周血）中提取的多能祖细胞。这些细胞表现出多种治疗特性，包括抗凋亡、抗氧化、抗炎、抗纤维化和免疫调节作用。它们还被证明具有最低的免疫原性，肿瘤发生风险低，易于获取和扩增，并且与其他干细胞产品相比引发的伦理问题较少，使其成为再生医学和广泛治疗应用的极具前景的候选者。MSCs能够在促炎表型（MSC1）和抗炎表型（MSC2）之间转换，这一过程主要由IFN-γ、IL-6和TNF-α水平升高驱动。这种表型可塑性可能影响除炎症外与衰老相关的关键通路，包括sirtuin调节、WNT/β-catenin调节和MAPK信号传导，从而提供多方面的方法来靶向肾脏衰老并维持老年人的肾功能。
这些治疗特性已转化为早期临床试验，显示出MSC疗法在治疗急性肾损伤、CKD、糖尿病肾病、动脉粥样硬化性肾血管疾病和狼疮性肾炎方面的潜力，表明MSCs可能通过减缓或在极少数情况下阻止肾功能下降来帮助管理已建立的肾脏疾病。然而，迄今为止，尚无干预性研究评估MSCs对肾功能正常且无预先存在的肾脏合并症的个体的影响。
在此背景下，我们报告了一项针对帕金森病的allo-hMSC二期临床试验的结果，展示了eGFR和血清肌酐（SCr）水平的纵向改善。这些结果基于对入组时肾功能正常（eGFR > 60 mL/min/1.73 m2）的帕金森病患者进行的试验安全评估中使用的全面代谢小组数据。
方法
研究设计
我们于2020年11月至2023年7月在美国休斯顿德克萨斯大学健康科学中心（UTHealth）进行了一项单中心、二期随机、双盲、安慰剂对照临床试验，以评估allo-hMSCs在减轻轻度至中度帕金森病患者症状方面的潜力（NCT04506073）。该研究获得了UTHealth机构审查委员会（IRB编号HSC-MS-20-0150）和美国食品药品监督管理局（IND编号16756）的批准。治疗阶段包括三个组，每组接受不同组合的三次输注，每18周一次，总治疗期为36周，最后一次输注后52周进行最终评估。完整方案见补充材料1。
参与者
纳入50至79岁轻度至中度帕金森病患者。与本报告相关的相关排除标准包括eGFR < 45 mL/min/m2、体重指数（BMI）≥ 40、活动性自身免疫疾病或既往干细胞治疗史。所有参与者在进行特定试验的筛查测试和评估前均提供书面知情同意。纳入和排除标准的详细信息见补充材料1。
程序
MSCs来源于单个健康供体的骨髓抽吸物，经过传染病筛查和HLA分型。细胞在贝勒医学院（细胞和基因治疗中心）按照国际细胞与基因治疗学会（ISCT）标准在cGMP条件下扩增和验证，悬浮在含5% Flexbumin和10% DMSO的Plasma Lyte A中，然后冷冻保存在即用剂量中。安慰剂在视觉上相同，但仅含有5% Buminate而无allo-hMSCs。通过在输注袋和静脉输液管上使用不透明覆盖物来维持盲法。
符合条件的患者以1:1:1的比例随机分配到三个治疗组之一：a) 三次10×10⁶ allo-hMSCs/kg输注，b) 安慰剂后两次10×10⁶ allo-hMSCs/kg输注，或c) 三次安慰剂（5%白蛋白溶液）输注。剂量基于我们的I期临床试验，其中10×10⁶ allo-hMSCs/kg（测试的最高剂量）被发现是安全的。最初，计划每12周进行一次给药，这反映了I期观察结果，即运动改善在此期间后开始减弱。然而，由于2020年2月研究启动时与COVID-19大流行相关的供应限制，间隔延长至18周。所有患者最终都按照此18周时间表接受输注。基于运动障碍学会-统一帕金森病评定量表（MDS-UPDRS）子量表III评分的分层区组随机化用于在各治疗组之间均匀分配基线运动症状严重程度，以加强比较的有效性。
参与者在第1、18和36周接受allo-hMSC或安慰剂输注。输注后随访评估在第9、27和40周进行，最后一次随访在第88周。在基线（第一次输注前）和每次输注后随访期间，所有参与者都接受了全面的安全性评估，包括病史、帕金森病特定评估、生物标志物测量和安全实验室测试。
结果
肾功能通过Memorial Hermann-Texas Medical Center实验室进行的酶法（使用creatininase和比色检测）测量的SCr和通过尿素-谷氨酸脱氢酶方法测量的血尿素氮（BUN）进行评估。eGFR（以mL/min/1.73 m2表示）使用2021年CKD-EPI公式从SCr计算得出。蛋白尿通过在就诊当天收集的首次晨尿样本上的试纸法进行评估。
统计分析
使用贝叶斯方法基于观察数据估计备择假设的概率，捕获后验分布并评估真实参数值在定义范围内的概率。在第40周和第88周，调整分层后比较各治疗组之间的SCr、BUN和eGFR水平。回归系数的先验遵循~Normal（µ=0，σ²=1×10³）分布，一级误差方差遵循~Student-T（µ=0，df=3，σ²=1×10²）。此外，使用具有随机截距的多水平广义线性建模（GLM）来评估SCr、BUN和eGFR的纵向变化。这种方法考虑了随时间在参与者内部的重复测量，并调整了分层和治疗组。GLM结果以每日变化率表示，通过乘以365天线性外推以估计年变化率，为肾功能的逐年变化提供临床意义的见解。此外，测试了时间和治疗组之间的统计交互作用，以检查不同治疗组的变化率差异。回归系数的先验遵循~Normal（µ=0，σ²=1×10²）分布，一级误差方差为~Student-T（µ=0，df=3，σ²=1×10）。二级方差遵循Gelman的建议。分析应用了意向治疗原则，通过观察和缺失数据的联合建模处理缺失，这是一种对可忽略缺失（MCAR和MAR）的稳健方法。使用R版本4.2.0进行数据分析。
结果
招募和纳入分析的参与者数量
总共招募了45名帕金森病患者，并随机分配到三个组之一：16名接受三次allo-hMSC输注，14名接受两次allo-hMSC输注，15名分配到安慰剂组。所有参与者均在18周间隔内接受输注，在一周的治疗窗口内进行。在试验期间，一名参与者被临床诊断为多系统萎缩，经α-突触核蛋白种子扩增测试确认，并从最终分析中排除。在剩下的44名参与者中，43名完成了全部三次输注，并接受安全性评估和临床结果评估，包括第40周的SCr和BUN水平。在第88周研究结束时，两名参与者因被认为与治疗无关的严重不良事件提前退出，另一名参与者自愿退出，导致40名患者完成了88周的随访（图1）。
基线特征
研究队列的平均年龄为66.5岁（SD=7.2），22.2%的参与者为女性。在队列中，35.6%患有慢性高血压，4.4%患有糖尿病，24.4%患有高脂血症。入组时，所有受试者均有记录在案且稳定的血压控制，且无CKD或因高血压或药物导致的进行性肾功能下降的病史。各组之间血管紧张素受体阻滞剂（ARB）或血管紧张素转换酶抑制剂（ACEi）的使用率无差异。没有参与者使用慢性肾毒性药物，既往非甾体抗炎药（NSAID）的使用在各组之间平衡（表1）。平均BMI为27.2（SD=4.27）。基线肾功能评估显示平均SCr水平为0.98 mg/dL（SD，0.19），平均BUN水平为19.38 mg/dL（SD，5.05），平均eGFR为81.12 mL/min/1.73 m2（SD，12.74）。通过尿液试纸测试，6.8%的参与者检测到蛋白尿。按治疗臂分层的基线特征见表1。
血清肌酐
在三次allo-hMSC输注组中，估计的平均SCr水平在第40周（平均差异[MD]：-0.12 mg/dL；95%可信区间[CrI]：-0.28至0.03 mg/dL；后验概率[PP]=94.2%）和第88周（MD：-0.12 mg/dL；95% CrI：-0.34至0.10 mg/dL；PP=86.2%，表2）均持续低于安慰剂组。两次allo-hMSC输注组在第40周（MD：0.03 mg/dL；95% CrI：-0.14至0.19 mg/dL；PP=62.3%）与安慰剂相比无差异，在第88周仅显示轻微差异（MD：0.09 mg/dL；95% CrI：-0.14至0.32 mg/dL；PP=77.0%，表2）。
多水平GLM显示活性治疗组与安慰剂组之间SCr水平的每日变化率存在差异（PP两次输注vs.安慰剂=81.5%；PP三次输注vs.安慰剂>99.9%，图2）。图2A展示了按治疗组随时间变化的SCr变化纵向图，而图2B-D显示了每个组中SCr每日变化率的后验分布。为了提高临床可解释性，图2中的每日变化率线性外推以估计年变化率（即每日变化率×365天）。计算出的SCr年变化率为-0.033 mg/dL/年（95% CrI：-0.055至-0.007；PP<0=99.5%）在三次输注组（图2B），0.029 mg/dL/年（95% CrI：-0.004至0.062；PP>0=96.5%）在两次输注组（图2C），以及0.055 mg/dL/年（95% CrI：0.007至0.10；PP>0=98.6%）在安慰剂组（图2D）。
血清BUN
在第40周，与安慰剂组相比，两次输注组观察到较低的BUN浓度（MD：-1.47 mg/dL；95% CrI：-5.57至2.63；PP=76.4%），尽管在第88周仅观察到最小差异。类似地，在三次输注组与安慰剂组之间，在第40周和第88周均发现BUN水平存在边缘差异（表2）。
基于多水平GLM分析，活性治疗组与安慰剂之间BUN水平的每日变化率无显著差异（PP两次输注vs.安慰剂=51.9%；PP三次输注vs.安慰剂=67%）。当外推至年率时，BUN水平的变化——无论治疗组——为-0.365 mg/dL/年（95% CrI：-1.10至0.37；PP<0=85.4%；见补充材料2 A）。此外，在比较每个活性治疗组与安慰剂时，所有时间点的平均BUN水平无显著差异（补充材料2B）。
估计肾小球滤过率
与安慰剂组相比，接受三次allo-hMSC输注的组在第40周（MD：13.2 mL/min/1.73 m2；95% CrI：2.4至23.7；PP=99.1%）和第88周（MD：9.4 mL/min/1.73 m2；95% CrI：-2.8至21.6；PP=93.6%，表2）的eGFR更高。相比之下，接受两次allo-hMSC输注的组在第40周与安慰剂相比差异最小（MD：-2.8 mL/min/1.73 m2；95% CrI：-14.4至8.6 mL/min/1.73 m2；PP=68.5%），而在第88周观察到比安慰剂更低的eGFR（MD：-7.5 mL/min/1.73 m2；95% CrI：-20.4至5.04 mL/min/1.73 m2；PP=88.2%，表2）。
使用多水平GLM，我们观察到治疗组与安慰剂组之间eGFR的每日变化率存在差异（PP两次输注vs.安慰剂=76.7%；PP三次输注vs.安慰剂>99.9%）。图3A展示了按治疗组估计的eGFR每日变化的纵向图。计算出的eGFR年变化率为3.29 mL/min/1.73 m2/年（95% CrI：1.10至5.48；PP>0=99.7%）在三次输注组（图3B），-1.46 mL/min/1.73 m2/年（95% CrI：-4.02至1.46；PP<0=84.2%）在两次输注组（图3C），以及-2.92 mL/min/1.73 m2/年（95% CrI：-5.11至-0.37；PP<0=98.5%）在安慰剂组（图3D）。
蛋白尿
在基线时，两次allo-hMSC组中所有参与者的蛋白尿均为阴性，而安慰剂组14人中有13人（92.9%）和三次allo-hMSC组16人中有14人（87.5%）检测到蛋白尿（表1）。所有阳性病例均被归类为微量，除了三次allo-hMSC组中一名参与者有30 mg（+）蛋白尿。到第88周，所有基线蛋白尿病例均已解决。
讨论
本试验的结果研究了无预先存在CKD的老年人帕金森病患者（入组时eGFR > 60 mL/min/1.73 m2），提供了临床证据，表明重复静脉输注allo-hMSCs可能有助于稳定并可能改善衰老帕金森病人群中的肾功能。这些发现基于作为评估allo-hMSCs在帕金森病患者中免疫调节作用的二期临床试验（NCT02611167）一部分进行的器官功能的次要安全评估。65岁以上人群中超过1%被诊断为帕金森病，这是一种以多巴胺能神经元丧失为特征的神经退行性疾病，部分由小胶质细胞介导的神经炎症驱动。据推测，allo-hMSCs通过多种机制调节外周免疫系统来减少大脑炎症。
考虑到与年龄相关的eGFR平均下降率约为-1 mL/min/1.73 m2/年，安慰剂组患者经历了更为明显的-2.92 mL/min/1.73 m2/年下降。相比之下，接受活性治疗的患者在两次allo-hMSC输注后下降较慢（-1.46 mL/min/1.73 m2/年），而在三次输注后显示出显著改善（+3.29 mL/min/1.73 m2/年，图3）。这伴随着活性治疗组中血清肌酐变化率的较慢上升，在三次输注组中SCr略有下降（-0.02 mg/dL/年，由线性模型中的-0.00005 mg/dL/天总计算得出），在两次输注组中适度增加（0.03 mg/dL/年，0.00008 mg/dL/天），而安慰剂组则大幅增加（0.73 mg/dL/年，0.0002 mg/dL/天），如图2中的线性建模所示。
重要的是，所有组中的血清BUN水平保持稳定，表明观察到的eGFR和SCr变化不能归因于水合状态或营养因素。尽管这项以帕金森病为重点的研究未包括其他自由过滤生物标志物（如胱抑素C）的测量，但先前的比较研究表明，在eGFR值介于60至89 mL/min/1.73 m2的个体中（观察到我们研究人群的相同范围，见表1），仅SCr估计GFR的准确性与胱抑素C或SCr和胱抑素C方程的组合相同。
根据这些结果，尽管两次输注组与安慰剂相比肾功能下降较慢，但总体轨迹仍为负，表明继续恶化，尽管程度较小。相比之下，三次输注组显示出正斜率，反映了随着时间的推移肾功能的实际改善。两次和三次输注组之间结果的这种差异可能反映了重复allo-hMSC给药的累积剂量效应或阈值效应。尽管患者被随机分配，且组间基线测量变量没有差异，但帕金森病是一种非常异质的疾病，因此存在未测量的混杂因素在组间不同反应中发挥作用的可能性。这也可能是由于细胞产品批次的潜在基础变异性所致。尽管使用相同供体最小化了供体间变异性，但单个输注袋可能仍包含具有不同免疫调节效力的异质细胞群体。因此，批次间的差异可能影响外周炎症反应并影响治疗效果。未来试验将纳入额外的等效性和效力测定，因为治疗反应的差异可能不仅源于给药频率，还源于干细胞制剂功能质量的变异性。建立标准化的效力测量对于确保一致性和优化allo-hMSC疗法的肾保护潜力至关重要。
IL-6和TNF-α在与衰老相关的炎症变化中起着核心作用。动物研究表明，慢性炎症通过破坏戊糖磷酸途径等代谢途径引发并加速与年龄相关的肾功能下降，导致抗氧化防御受损和氧化应激增加，这是细胞衰老的标志。在肾脏中，这可能表现为肾小球损伤、足细胞丧失、肾小管萎缩和间质纤维化，最终导致eGFR下降。纵向人类研究进一步支持这一模型，表明循环IL-6和TNF-α水平升高与老年人群中eGFR加速下降独立相关，即使在调整传统风险因素后也是如此。
了解诸如MSC疗法等干预措施如何调节炎症介质可能提供关于其对肾功能潜在抗衰老效应的关键见解。需要进一步将肾功能与炎症标志物相关联，以阐明所涉及的机制。此外，将这些结果与单个细胞批次的活性联系起来可能有助于识别效力的关键特征，并支持开发更精确的测定来评估MSC产品在肾脏相关炎症中的治疗强度。这种机制见解不仅可以扩展到其他肾脏疾病，还可能支持将MSCs作为对抗自然肾脏衰老策略的更广泛应用。尽管我们在此手稿中未报告炎症生物标志物数据或细胞效力结果，但未来工作应侧重于分析可用的纵向患者样本，并将其与基于细胞的效力和等效性测定相关联，以更好地理解和优化MSCs在肾脏中的治疗潜力。
本研究有几个局限性。首先也是最重要的是，这些发现基于对衰老帕金森病患者的大型临床试验中的次要安全结果，且研究未包括非帕金森病参与者。因此，鉴于这一人群与非帕金森病衰老个体相比理论上可能（尽管未经证实）肾功能恶化的风险，这些发现的普遍性可能有限。此外，缺乏年轻健康对照组限制了评估年龄特异性效应和建立肾脏衰老基线轨迹的能力。总之，这些局限性阻止了当前研究设计将MSC特异性效应与帕金森病进展或正常衰老相关的效应区分开来。未来研究应包括年龄匹配的健康对照组和年轻参与者，以验证和情境化此处观察到的肾脏发现。此外，由于肾功能不是本试验的主要终点，可能存在由于缺乏专注于肾脏结果的试验前分层而导致的基线异质性。然而，这些结果提供了概念验证数据，可能支持未来针对无CKD的无症状个体的抗衰老肾脏疗法的临床试验。第二个局限性是样本量相对较小，这可能限制研究结果的普遍性。为了解决这个问题，我们使用了贝叶斯分析，它提供后验概率，支持更清晰、更明智的解释。这种方法因其灵活性和适用于小样本量而受到FDA等监管机构的认可，适用于早期试验。第三，排除具有显著肾脏合并症的患者限制了这些发现对更晚期CKD个体的适用性。第四，研究未特别追踪对肾毒性药物或环境毒素的暴露，这可能影响肾功能并混淆结果。最后，所有参与者年龄相似，阻止了对老年人和年轻人之间进行比较以评估年龄特异性效应。
结论
这些结果表明，重复静脉输注10×10⁶ allo-hMSCs/kg可能改善无预先存在CKD的衰老帕金森病患者的eGFR和SCr水平。这代表了证明allo-hMSCs作为潜在疗法在衰老帕金森病人群中稳定并可能改善肾功能的安全性和概念验证功效的重要第一步。未来研究应包括设计良好的疗效试验，涉及不同年龄组和合并症特征的多样化人群，以及适当的协变量控制。此外，需要功能性效力测定和机制研究，以更好地表征allo-hMSC分泌组并理解驱动观察到的肾脏益处的生物通路。
【全文结束】