摘要
背景
Fontan手术导致慢性血流动力学改变，包括中心静脉高压，这可能导致肠道菌群失调。本研究旨在比较Fontan患者与年龄和性别匹配的健康对照组之间的肠道微生物群谱，并研究如何通过导管测量的血流动力学和肝脏相关参数与微生物变化相关。
方法
这项横断面研究纳入了23名Fontan患者和23名匹配的对照组。Fontan患者接受了心血管评估，所有参与者都提供了粪便样本。使用16S rRNA基因测序分析肠道微生物群谱。
结果
与对照组相比，Fontan患者表现出明显的肠道菌群失调，均匀度较低，β多样性有显著变化。Fontan患者炎症相关分类群的相对丰度较高，而短链脂肪酸产生菌或共生菌属的丰度较低。导管测量的肺动脉和Fontan循环压力较高以及跨肺梯度较大与微生物多样性降低和几种有益菌群的减少有关。相反，较好的肝脏状况—以血清白蛋白水平较高为标志—与更有利的微生物谱相关。
结论
Fontan患者表现出特征性的肠道微生物群紊乱模式，与其血流动力学和肝脏负担平行。将Fontan相关压力作为连续变量处理，揭示了循环充血、肝脏受累和肠道菌群失调之间的分级关联，支持Fontan生理学中的血流动力学-肠道-肝脏轴。特定细菌可能作为潜在的微生物生物标志物，用于识别高风险患者并指导旨在改善临床结局的治疗干预。
非标准缩写和简称
PAP 肺动脉压力
SCFA 短链脂肪酸
临床视角
新发现是什么？
• 本研究整合了基于导管的侵入性血流动力学测量、肝脏评估和粪便微生物组分析，阐明了Fontan生理学中循环充血如何与肠道菌群失调相关。
• 导管测量的较高肺动脉压力和跨肺梯度与微生物多样性降低以及几种有益菌群丰度减少呈负相关，而较高的血清白蛋白（代表更好的肝功能）与更有利的微生物谱相关——支持Fontan患者中存在血流动力学-肠道-肝脏关联。
临床意义是什么？
• 当与基于导管的血流动力学和肝脏评估相结合时，肠道微生物群特征可作为Fontan幸存者风险分层和纵向监测的辅助非侵入性指标。
越来越多接受Fontan手术的单心室患者现已存活至成年期。然而，由于特定的血流动力学变化，这些患者经常面临长期术后并发症。Fontan循环涉及将上腔静脉和下腔静脉的静脉血直接重定向至肺动脉，绕过泵血的右心室。这种改变的生理状态导致中心静脉压升高和心输出量降低，类似于其他形式慢性心力衰竭中观察到的血流动力学特征。
肠道微生物群是指居住在人体胃肠道中的细菌群落。当肠道微生物群与宿主肠道生态系统之间的平衡被破坏时，就会发生肠道菌群失调。重要的是，宿主与肠道微生物群之间存在双向相互作用。多项研究表明，心血管疾病患者（特别是心力衰竭患者）的肠道微生物群发生显著改变。此外，肠道细菌产生的代谢物，包括短链脂肪酸(SCFAs)和其他微生物衍生化合物，已被证明会影响心血管疾病。丁酸盐（一种SCFA）已被报道与心力衰竭患者相关。这些心脏疾病与肠道微生物群之间的相互作用被称为"肠道-心脏轴"。
在Fontan患者中，升高的肺动脉和体静脉压力已与肠道充血及肠道微生物群改变相关联，包括α多样性降低和β多样性变化。尽管Fontan相关肠道菌群失调已被认为与蛋白丢失性肠病和肝脏充血等并发症有关，但个别血流动力学参数对肠道微生物组和Fontan相关肝病的具体影响尚不清楚。因此，我们研究了Fontan患者中基于导管的血流动力学与肠道微生物群谱之间的关系。
方法
本研究生成和分析的数据集已存入美国国家生物技术信息中心序列读取档案库，BioProject登录号PRJNA1301259，个体样本登录号SRR34869580至SRR34869622。
研究人群
在清迈大学医院进行了一项横断面试点研究，包括23名Fontan患者和23名年龄和性别匹配的对照组，如图S1所示。所有在清迈大学医院定期随访并接受标准Fontan术后评估（包括心脏导管检查）的连续Fontan患者均被纳入，无病例选择，以最大限度减少招募偏倚。Fontan患者的数据收集包括Fontan手术时的年龄、手术后持续时间、心脏诊断、先前Glenn手术和Fontan手术类型。对Fontan患者进行的实验室检查包括全血细胞计数、肾功能测试和肝功能测试。此外，这些患者接受了6分钟步行测试、12导联心电图、经胸超声心动图和心脏导管检查。从Fontan患者和对照组收集粪便样本用于肠道微生物组分析。在本研究前1年内，无患者接受过抗生素、益生菌或益生元治疗。所有参与者均获得知情同意。所有程序均在同一天或1周内进行。本研究获得清迈大学医学中心机构审查委员会批准（批准号PED-2565-08968），并遵守国际协调会议-良好临床实践指南（ICH-GCP: E6(R2)）以及《赫尔辛基宣言》中概述的原则。
样本量计算
使用G*Power 3.1.9.7版本计算样本量。基于先前研究报告Fontan患者与健康对照组之间α多样性（Faith系统发育多样性指数）差异的效应量（Cohen's d=0.98）。我们估计，使用双尾t检验，在显著性水平为0.05时，每组至少需要18名参与者才能达到80%的检验效能。为考虑潜在的10%脱落或低质量样本，每组纳入23名参与者。
粪便样本收集和肠道微生物群分析
粪便样本收集、DNA提取、16S rRNA基因测序和生物信息学分析（包括Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2处理、扩增子序列变体生成、分类学分类、多样性指标、差异丰度分析（Analysis of Compositions of Microbiomes With Bias Correction）和功能预测（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）的详细方法见Data S1。我们使用针对V3-V4区域的16S rRNA基因扩增子测序。16S rRNA基因是一种高度保守的细菌核糖体标记，能够在微生物群落中实现准确的分类鉴定，并在临床横断面研究中广泛验证用于肠道微生物群分析。选择这种方法是因为其稳健性、可重复性以及适合检测Fontan组和对照组之间的组成和多样性变化。
经胸超声心动图
儿科心脏病专家进行超声心动图评估，以评估系统性心室的形态、房室瓣反流的严重程度、收缩和舒张功能、Fontan循环和造口。
12导联心电图
在超声心动图评估后，在超声心动图室内进行12导联心电图检查。此程序旨在评估潜在心律失常的存在。
6分钟步行测试
6分钟步行测试用于评估功能运动能力。完整的测试程序见Data S1。
肝脏超声和弹性成像
由一名放射科医生使用标准化超声协议评估肝脏形态和硬度。肝脏磁共振弹性成像也作为临床评估的一部分进行。包括设备规格、诊断标准和弹性成像程序在内的完整方法细节见Data S1。
肝脏计算机断层扫描
使用标准化多期协议进行上腹部计算机断层扫描。完整的影像参数和对比剂给药细节见Data S1。
心脏导管检查
儿科心脏病专家进行心脏导管检查。麻醉师在导管检查期间给予镇静。获得血流动力学测量，包括平均肺动脉压(PAP)、Fontan压力、肝静脉压、系统性心室舒张末期压和跨肺梯度压。随后将所有血流动力学参数作为连续变量纳入与肠道微生物群组成的相关分析中。评估还包括检测Fontan循环、肺动脉或心脏腔室中的血栓，以及评估肺动脉大小、造口和静脉-静脉侧支血管。
统计分析
连续变量以均值±标准差表示（正态分布数据），或以中位数与四分位距(IQR, 25th-75th百分位)表示（非正态分布数据）。分类变量以计数（百分比）表示。使用t检验评估两组间连续变量的差异（正态分布数据）或秩和检验（非正态分布数据）。使用卡方检验比较分类变量。P值<0.05被认为具有统计学意义。所有统计分析均使用Stata（StataCorp, Texas）进行。
结果
参与者特征
本研究评估了23名（13名男性）接受Fontan手术的患者，并使用粪便样本评估其心脏功能和肠道微生物群。中位年龄为20岁（IQR, 16.7-24.5），中位体重为53 kg（IQR, 43.8-57.1）。Fontan手术时的中位年龄为6岁（IQR, 5.5-9.1），手术后中位时间为13年（IQR, 10.0-15.9）。招募时的中位氧饱和度为94%（IQR, 93-95）。基础心脏诊断为三尖瓣闭锁10例（44%）、左心室双入口5例（22%）、二尖瓣闭锁1例（4%）、异构综合征1例（4%）、右心室发育不全2例（9%）和其他诊断4例（18%）。在完全腔静脉-肺动脉连接前，18名患者（78%）接受了双向Glenn分流术，包括脉动性单侧（5例）、非脉动性单侧（12例）和脉动性双侧（1例）分流术。大多数Fontan手术使用腔外导管进行（21例；92%），大多数（15例；68%）使用20 mm聚四氟乙烯导管。13名患者（62%）有造口，最常见造口尺寸为6 mm（7例；35%）。我们队列中有一名患者患有蛋白丢失性肠病。Fontan患者和健康对照的基线特征见表1。
Fontan患者的循环系统和肝脏评估
肝脏影像显示38%的患者肝实质呈不均匀模式，43%有肝硬化改变，19%有肝结节。肝脏弹性成像的中位硬度为10.2 kPa（IQR, 8.7-11.9）。在计算机断层扫描中，39%和74%的患者分别观察到肝硬化和肝结节（表2）。6分钟步行测试的中位距离为426米（IQR, 399-457）。超声心动图显示57%的患者系统性心室功能正常，而30%和13%分别有轻度和中度房室瓣反流（表2）。心脏导管检查显示平均PAP为14.2±3.3 mm Hg，平均肝静脉压为14.7±3.1 mm Hg，平均Fontan压力为14.3±3.3 mm Hg。跨肺梯度为4.1±2.4 mm Hg，肺血管阻力指数为1.7±1.4（表2）。
Fontan组与健康对照组肠道微生物群组成的比较
我们在Fontan组和对照组之间观察到明显的肠道微生物群谱。图1A显示了每位受试者肠道微生物群相对丰度的分类条形图。使用均匀度指数和Faith系统发育多样性评估α多样性。Fontan组的均匀度指数显著低于对照组，而Faith系统发育多样性无显著差异（图1B和1C）。对于β多样性，基于Bray-Curtis和Jaccard距离，两组之间的肠道微生物组成存在显著差异（图1D和1E）。使用Analysis of Compositions of Microbiomes With Bias Correction进行的差异丰度分析显示，Fontan组相对于对照组，Staphylococcus、Sanguibacteroides、S5-A14a、Eubacterium、Collinsella、Clostridia_vadinBB60_group和Anaerococcus等几个分类群增加。相反，Terrisporobacter、Roseburia、Romboutsia、Paludicola、Oxalobacter、Negativibacillus、Lachnospiraceae_UCG-008、Howardella、Fusicatenibacter、Ruminococcaceae_uncultured、Clostridium_sensu_stricto_1、Adlercreutzia、[Eubacterium]_hallii_group和*[Eubacterium]_eligens_group*等的相对丰度降低（图1F）。探索性分析显示，平均PAP升高的患者肠道微生物菌群失调趋势更大（图S2）。
Fontan组中α多样性与临床参数的关联
进行Spearman相关分析，以研究临床参数与α多样性的关系。我们发现Fontan组中均匀度指数与血清白蛋白呈正相关。相反，血流动力学参数，包括导管测量的PAP、肝静脉压、肝静脉楔压和Fontan压力，与Faith系统发育多样性呈负相关（图2A）。
Fontan组中差异丰度分类群与血流动力学/肝脏参数的关联
导管测量的跨肺梯度增加与Fontan组中较低的血清白蛋白水平相关（图2B）。血流动力学和肝脏相关参数均与差异丰度分类群相关。在血流动力学参数中，导管测量的PAP与Fusicatenibacter和Oxalobacter呈负相关，而导管测量的跨肺梯度与Fusicatenibacter和Paludicola呈负相关。对于肝脏相关参数，血清白蛋白与*[Eubacterium]_eligens_group和Howardella呈正相关，但与Collinsella呈负相关。磁共振弹性成像值与Fusicatenibacter和Lachnospiraceae_UCG-008*呈正相关（图2C和表S1）。选择这些参数是因为它们代表Fontan生理学中血流动力学负荷（导管测量的PAP和导管测量的跨肺梯度）和肝功能（血清白蛋白和磁共振弹性成像）的关键指标。
Fontan组中肠道微生物分类群与临床参数的相关分析
使用Analysis of Compositions of Microbiomes With Bias Correction进行细菌分类群与临床参数之间的关联分析，这是一种考虑微生物组数据组成性质的偏差校正模型。这种方法能够识别相对丰度与血流动力学或肝脏相关参数显著相关的细菌分类群。结果表明，细菌群落动态与临床参数的变化相关。导管测量的造口压力增加与Mitsuokella、Atopobiaceae_uncultured、NK4A214_group的丰度较高以及Fusobacterium、[Ruminococcus]_gnavus_group和Tyzzerella的丰度较低相关。在肝脏相关参数中，天冬氨酸转氨酶与血小板比率指数与UCG-002呈负相关，而Fib-4（纤维化-4）指数与Subdoligranulum、Atopobiaceae_uncultured和*[Eubacterium]_eligens_group呈负相关。血清白蛋白与[Eubacterium]_eligens_group和Catenibacterium*呈正相关（图3和表S2）。
Fontan组中肠道微生物群改变相关的预测功能通路
使用Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States进行的差异通路丰度分析显示，Fontan患者和健康对照之间预测的代谢通路存在显著差异。这些预测的通路分为5个主要类别：（1）芳香族和外源性降解；（2）碳水化合物和多元醇利用；（3）辅因子、电子载体和维生素；（4）能量和中心碳代谢；（5）脂质和膜代谢。在Fontan组中，与脂质和膜代谢相关的通路减少，而与其他4个类别相关的通路增加（图4）。
讨论
在本研究中，我们描述了Fontan患者与年龄和性别匹配的健康对照组的肠道微生物群谱，并进一步研究了微生物群改变如何与血流动力学和肝脏相关参数相关，以更好地阐明其与Fontan循环中系统生理学的联系。
我们观察到Fontan患者存在显著的肠道菌群失调，α多样性降低，这与先前在其他Fontan队列中的报告以及将菌群失调与全身炎症联系起来的心力衰竭研究结果一致。Fontan患者表现出先前与促炎状态相关的分类群（如Staphylococcus、Collinsella）的相对丰度较高，而SCFA产生菌属（如*[Eubacterium]_eligens_group*、[Eubacterium]_hallii_group、Roseburia和Lachnospiraceae_UCG-008）的丰度较低。这些微生物模式与促炎环境相关，并可能有助于不良心血管生理；然而，本研究的横断面设计排除了因果推断。Staphylococcus属成员与心肌功能障碍和炎症性心血管反应相关。同样，Collinsella与免疫激活和TNF-α（肿瘤坏死因子α）水平升高以及血脂异常和临床动脉粥样硬化相关，提示其可能与胆固醇代谢和心血管风险相关。相反，此处观察到的SCFA产生菌属的减少可能会降低管腔丁酸盐的可用性，已知丁酸盐具有抗炎作用。
使用连续血流动力学变量的相关分析为肠道-心脏-肝脏轴的双向作用提供了更深入的见解。在我们的队列中，较高的肺动脉压力与较低的血清白蛋白水平相关，表明血流动力学充血可能导致Fontan生理学中的肝脏受累。血流动力学相关的参数和肝脏指数均与肠道微生物组成的改变相关，支持Fontan患者中肠道菌群失调受循环和肝脏因素影响的概念。这些发现与先前描述Fontan相关肝病和肠道菌群失调的报告一致。较高的导管测量的跨肺梯度和平均PAP与产丁酸菌属Fusicatenibacter和草酸盐降解菌属Oxalobacter的丰度降低相关。相反，较高的血清白蛋白和肝脏硬度（磁共振弹性成像）值伴随着*[Eubacterium]_eligens_group*、Howardella、Fusicatenibacter和Lachnospiraceae_UCG-008的丰度增加，表明Fontan患者的肝脏状态和肠道微生物组成发生平行改变。
此外，使用Analysis of Compositions of Microbiomes With Bias Correction进行的偏差校正关联分析进一步支持了这些发现。几种细菌分类群与血流动力学和肝脏相关参数表现出显著关系，强化了Fontan生理学中循环充血、肝脏受累和肠道菌群失调之间的联系。这些数据加强了这样一个概念：血流动力学负荷与肝功能障碍共同塑造了这一人群的肠道微生物景观。
功能预测分析揭示了Fontan患者中改变的微生物代谢潜力。特别是，Fontan组中与脂质和膜代谢相关的通路减少，这与先前在Fontan队列中观察到的血脂异常和代谢紊乱一致。这些改变表明，肠道微生物功能能力可能反映了Fontan生理学中潜在的循环和肝脏负担。
这些发现突显了Fontan生理学中血流动力学充血、肝脏受累和肠道微生物失衡之间的复杂相互作用。观察到的关联表明，肠道菌群失调可能作为反映系统循环负担和肝脏状态的生物标志物，而不仅仅代表次要的表象现象。将微生物组分析与血流动力学和肝脏评估相结合，因此可能增强Fontan患者的风险分层和纵向监测。尽管如此，由于本研究是一项横断面研究，无法进行因果推断，需要进行纵向和机制研究，以确定调节肠道微生物群是否能带来临床益处。
本研究有几个局限性。首先，这是一项在单一地理和文化环境中进行的单中心研究，这可能减少了饮食和环境异质性，但也限制了我们将研究结果推广到具有不同饮食、微生物暴露或卫生系统的其他Fontan人群。参与者饮食大致相似，无人报告定期摄入发酵食品；然而，缺乏正式的饮食控制仍然是一个局限性。其次，横断面设计排除了血流动力学充血、肝脏受累和肠道微生物群改变之间的因果推断；因此，无法确定观察到的微生物变化的临床意义，结果应解释为假设生成而非临床指导。此外，肝脏硬度可能代表充血或纤维化。弹性成像参数的解释应谨慎。第三，样本量相对较小，反映了Fontan循环的罕见性，这可能限制了我们检测较弱关联的能力。第四，微生物功能通路是使用Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States推断的，而不是鸟枪法宏基因组学，因此应视为预测性而非确定性。我们研究的另一个局限性是，我们的队列主要由左心室优势的Fontan患者组成。鉴于右心室优势循环可能相关的形态和生理差异，未来研究应评估右心室优势Fontan患者的肠道微生物群，以确定这些发现是否具有普遍性。
结论
总之，Fontan患者表现出明显的肠道微生物群改变，其特征是SCFA产生菌属丰度降低和炎症相关细菌富集。这些组成变化与静脉充血、肝脏受累和Fontan循环典型的低度系统性炎症的病理生理环境一致。通过整合基于导管的血流动力学数据、肝脏评估和微生物分析，本研究完善了当前对Fontan患者肠道-心脏-肝脏轴的理解，并突出了微生物组特征作为候选生物标志物和未来治疗靶点的重要性。未来需要进行纵向、多中心和多组学研究，以验证这些关联，确定方向性，并确定微生物群靶向干预是否能改善这一高风险人群的结局。
资金来源
本工作得到泰国国家研究委员会杰出研究教授资助（N42A660301：Siriporn C. Chattipakorn）、清迈大学卓越中心奖（Nipon Chattipakorn）和清迈大学医学院的支持；以及2023年泰国科学技术研究与创新基础基金（资助ID 66/062），授予Pannipa Suwannasom。
致谢
由清迈大学信息技术服务中心(ITSC)组织的EraHPC项目提供了高性能计算资源，这些资源对系统生物学和生物信息学至关重要，使我们能够进行宏基因组分析。
作者贡献：Saviga Sethasathien：概念化；方法；数据整理；正式分析；撰写-初稿；撰写-审阅和编辑。Chanon Kunasol：正式分析；撰写-初稿；撰写-审阅和编辑。Suchaya Silvilairat：概念化和监督。Rekwan Sittiwangkul：概念化和监督。Pannipa Suwannasom：概念化，资金支持。Nipon Chattipakorn：概念化；监督；方法；资金支持。Krit Leemasawat：概念化；方法；撰写-审阅和编辑。Siriporn C. Chattipakorn：概念化；正式分析；监督；方法；资金支持；撰写-审阅和编辑。
【全文结束】
