摘要
确定能够区分常驻小胶质细胞和浸润性单核细胞的特异性标记物一直是神经科学领域的长期挑战。最近，P2RY12、TMEM119和FCRLS等蛋白质被提出作为小胶质细胞特异性标记物，并已被广泛用于定义健康和疾病状态下的小胶质细胞群体。这些标记物的特异性基于一个假设，即循环单核细胞在进入中枢神经系统(CNS)后仍保持其独特特征。本文对此范式提出了挑战。通过结合使用骨髓嵌合体、单细胞RNA测序、ATAC-seq、流式细胞术和免疫组织化学，我们证明植入中枢神经系统的单核细胞会获得这些既定小胶质细胞标记物的从头表达。这种表型转变是由深刻的表观遗传重编程驱动的，其特征是在关键基因位点（包括P2ry12、Tmem119和Aif1(Iba1)）上染色质可及性的动态变化，以及转录因子结合基序向小胶质细胞特征的转变。我们展示了这一过程在损伤后的视网膜中发生，令人惊讶的是，在大脑和脊髓的生理条件下也会发生，其中血液来源的单核细胞逐渐贡献于常驻髓系细胞池。此外，植入的单核细胞下调了经典单核细胞标记物（Ly6C、CD45），最终基于常规表型分析变得与胚胎小胶质细胞无法区分。我们的研究结果揭示，浸润性单核细胞经历广泛的表观遗传和转录重塑以采用小胶质样命运，挑战了当前标记物的特异性，并要求重新评估这两种细胞群体在中枢神经系统病理中的不同作用。
意义声明
区分常驻中枢神经系统小胶质细胞与浸润性单核细胞对于理解神经炎症至关重要。本研究揭示，广泛使用的"小胶质细胞特异性"标记物并非专属，因为进入中枢神经系统的单核细胞在表观遗传上被重编程以表达这些标记物。这种模仿使关于小胶质细胞身份的长期假设失效，并表明先前被确定为小胶质细胞的许多细胞可能具有外周起源。我们的工作强调了需要更可靠的方法来区分这些群体，以准确界定它们对中枢神经系统健康和疾病的各自贡献。
引言
小胶质细胞和浸润性外周单核细胞是中枢神经系统(CNS)疾病病理的核心参与者，已 emerged 作为关键的治疗靶点。然而，鉴于它们重叠的功能和形态，区分这两种髓系群体非常困难。使用特异性不足的标记物常常导致无意的错误标记，损害实验数据的解释以及我们对神经炎症过程的理解。
最近，包括P2RY12、TMEM119和FCRLS在内的新标记物面板被提出为小胶质细胞专属表达，并已被广泛采用。这些标记物的假定特异性是基于比较CNS常驻小胶质细胞与非CNS单核细胞或纯化的CNS急性免疫细胞。然而，这一框架很大程度上忽略了单核细胞在永久整合到CNS实质后可能改变其身份的可能性。事实上，最近的研究表明，浸润性单核细胞在植入后会经历持久的表型变化，采用分支状、类似小胶质细胞的形态，同时保留独特的促炎能力，可能驱动疾病。
在此，我们假设外周单核细胞在CNS植入后会经历深刻的表观遗传重编程，使它们能够表达经典的小胶质细胞标记物，混淆了它们的识别。我们在视网膜——一个公认的CNS模型中研究了这一假设，并将我们的发现扩展到大脑和脊髓。我们证明，植入后不久，单核细胞就开始表达P2RY12、TMEM119和FCRLS。这种表型转变由染色质可及性的动态变化和小胶质细胞相关转录网络的获得所支撑，包括PU.1、IRF2和CEBP等关键转录因子。同时，这些细胞抑制了经典单核细胞标记物（CCR2、Ly6C、CD45），最终通过常规方法变得在表型上与胚胎小胶质细胞无法区分。
我们的研究突显了单核细胞的显著可塑性，并揭示了目前用于识别它们的工具的根本缺陷。我们进一步证明，单核细胞植入的规则在CNS不同区域有所不同；虽然视网膜浸润需要损伤，但单核细胞会生理地定植于大脑和脊髓。这些发现提出了一个关键科学问题：我们如何可靠地区分胚胎小胶质细胞和这些新发现的单核细胞衍生的"小胶质样"细胞？回答这个问题对于最终理清这两种关键免疫群体在CNS病理中的不同作用至关重要。
结果
单细胞RNA测序揭示植入单核细胞向小胶质细胞特征的转录转变
为了追踪损伤后髓系细胞的转录命运，我们对小鼠视网膜中分离的CD45+CD11b+细胞进行了单细胞RNA测序，样本取自基线状态以及角膜碱烧伤后1、4和7天，这是一种已知会诱导单核细胞浸润和植入的模型。我们确定了四个不同的细胞簇（图1A）。基线簇（簇1）对应于原生的卵黄囊来源的小胶质细胞，因为健康视网膜不被外周单核细胞占据。在损伤后第1天，出现了两个独立的簇：一个单核细胞簇（簇3），通过高表达单核细胞标记物Siglec1识别；以及一个小胶质细胞簇（簇4），Siglec1表达较低（图1B）。值得注意的是，到第4天，这些群体合并为单一的转录簇（簇2），到第7天，所有细胞都回归到原始的幼稚小胶质细胞簇（簇1），展示了向小胶质细胞特征的动态转录收敛。
基因表达分析显示，经典巨噬细胞标记物Cx3cr1均匀表达，而单核细胞标记物Ccr2主要在单核细胞丰富的簇3（第1天）和混合簇2（第4天）中表达（图1C，D）。关键的是，假设的小胶质细胞标记物p2ry12、tmem119和fcrls随着时间的推移被植入群体获得。虽然tmem119和fcrls广泛表达，但p2ry12在早期浸润单核细胞（第1天）中不表达，但在第4天和第7天高度表达，与幼稚小胶质细胞的模式一致（图1C，D）。Aif1（或iba1）在所有簇中均有表达，并在簇2（第4天）中高度表达。P2ry12在单核细胞中表现出时间调控，在代表早期阶段浸润的簇3和簇4（均为第1天）中无表达，在蛋白质研究中得到证实（图1C，D）。
使用CX3CR1+/EGFP::CCR2+/RFP骨髓嵌合体(BMT)模型，我们通过流式细胞术证实，浸润性单核细胞逐渐下调其CD45表达，到第7天，它们的CD45谱与常驻小胶质细胞无法区分，进一步证实了单细胞RNA测序发现的细胞特征收敛（图1E）。BMT模型具有高移植效率，受体小鼠血液中93.6%的CD45+CD11b+CX3CR1+细胞为EGFP+RFP+。使用无损伤的转基因CX3CR1+/EGFP小鼠评估了胚胎小胶质细胞的CD45表达预期谱。
到损伤后第七天，流式细胞术证实植入的CX3CR1+单核细胞将其CD45表达调节到与常驻小胶质细胞无法区分的水平，证实了单细胞RNA测序数据表明的细胞特征收敛（图1E）。我们进一步使用在植入后45天从骨髓嵌合体中分选的细胞进行qPCR验证了这些转录变化。该分析证实植入的单核细胞获得了p2ry12、tmem119、fcrls和aif1(Iba1)的mRNA。值得注意的是，虽然植入单核细胞中的p2ry12mRNA相比血液单核细胞显著上调，但其表达仍低于幼稚或损伤小胶质细胞。相比之下，常驻小胶质细胞在幼稚和损伤条件下均保持这些标记物的高水平表达。
植入单核细胞获得P2RY12、FCRLS和TMEM119蛋白的从头表达
我们接下来验证这些转录变化是否转化为蛋白质水平。使用CX3CR1+/EGFP::CCR2+/RFP骨髓嵌合体区分供体单核细胞（GFP+）和常驻小胶质细胞（GFP-），我们分析了损伤后多个时间点视网膜中的蛋白质表达（图2A）。我们首先验证循环血液单核细胞缺乏P2RY12、TMEM119和IBA1蛋白表达（图S3）。我们还确定了CNS植入前循环单核细胞的蛋白质表达基线。对来自幼稚小鼠的CD45+CD11b+CX3CR1+血液细胞的流式细胞术分析证实了FCRLS蛋白的缺失（图2D），并证实了作为阳性染色对照的稳健MHC-II蛋白表达（图S3）。
植入后，植入单核细胞（EGFP+）开始表达这些标记物。P2RY12蛋白在第1天和第7天不存在（白色箭头），但在第14天可检测到（图S4），到第45天，约55%的植入单核细胞表达P2RY12，此时它们已采用分支状、类似小胶质细胞的形态（图2B，图S4）。这种异质性表达长期维持，在植入后16个月得到评估，使用CX3CR1CreER-EYFP::ROSA26tdTomato骨髓嵌合体模型（图S5 A，B），同时仍低于胚胎小胶质细胞的表达水平。相比之下，TMEM119表达迅速获得，在第1天25%的单核细胞呈阳性，到第7天100%呈阳性，这一表达水平在第45天和16个月维持（图2C，图S5C）。同时，EGFP−胚胎小胶质细胞（黄色箭头）在整个研究期间表现出P2RY12和TMEM119蛋白的稳健表达（图2B，C）。
通过CX3CR1+/EGFP::CCR2+/RFP骨髓嵌合体的流式细胞术评估FCRLS在单核细胞和小胶质细胞中的表达。为了区分细胞群体，CX3CR1+细胞用抗CX3CR1（PE-Cy7）抗体标记，将胚胎小胶质细胞定义为PE-Cy7+GFP-，将浸润单核细胞定义为PE-Cy7+GFP+（图S6A）。完整的代表性门控策略见图S6B。使用荧光减一（FMO）对照验证FCRLS染色的特异性。FCRLS在血液单核细胞中不存在（灰色），但在损伤后第1天，浸润单核细胞（紫色）迅速表达FCRLS，水平甚至高于基线小胶质细胞。这种表达持续维持，最终在第45天达到与小胶质细胞相当的水平（图2D，E）。最后，泛髓系标记物IBA1在第1天85%的浸润单核细胞中表达（白色箭头），此后为100%（图S7）。胚胎小胶质细胞（黄色箭头）在整个研究期间也表现出IBA1的稳健表达（图S7）。
这些发现不仅限于损伤模型，因为一种化学诱导的视网膜损伤（NaIO3）导致视网膜色素上皮（RPE）损伤，几乎完全耗尽了胚胎小胶质细胞，随后由外周单核细胞补充，这些单核细胞均匀表达P2RY12、TMEM119和IBA1（图S8）。这种表达在3个月后仍然维持，此时细胞已变为阿米巴状，约50%表达MHC-II（图S8）。
这一现象不仅限于视网膜。在健康、无损伤的嵌合体小鼠中，我们观察到外周单核细胞生理地浸润并植入大脑和脊髓。在一个月内，这些植入细胞表达TMEM119和IBA1，到一年后，它们也稳健表达P2RY12，同时保持静止、非炎症（MHC-II阴性）状态和与常驻小胶质细胞无法区分的分支形态（图S9，S10）。
染色质可及性变化支撑单核细胞到小胶质细胞的表型转变
为了研究这种转变的表观遗传基础，我们对流式分选的循环单核细胞、幼稚小胶质细胞和植入单核细胞进行了ATAC-seq。我们发现，植入后，单核细胞经历了显著的染色质可及性变化，这些变化与常驻小胶质细胞的变化相匹配（图3）。对于p2ry12和tmem119基因，特定的染色质峰在小胶质细胞中存在但在循环单核细胞中缺失，而这些峰在单核细胞植入视网膜后被获得（图3B，D）。对于fcrls和aif1（IBA1），染色质在循环单核细胞中已经可及，表明这些基因在表观遗传上已为接收适当的CNS信号后快速激活做好准备（图3C，E）。
ATAC-seq所有差异染色质可及性峰的热图清楚显示，植入单核细胞在第7天和第45天在表观遗传上与小胶质细胞相似，而不是与它们的循环前体相似（图3F）。对这些差异峰的基序分析揭示了可及转录因子结合位点景观的显著变化。植入单核细胞获得了标志性小胶质细胞转录因子的富集，包括PU.1、CTCF、IRF、RUNX和AP-1。此外，它们获得了疾病相关因子如MITF和促炎因子NFKB1的基序，这些在幼稚小胶质细胞中未富集，暗示尽管形态和基于标记物的相似性，但它们具有不同的功能潜力（图4）。植入单核细胞富含MAF和MEF基序，在胚胎小胶质细胞中缺失。在本研究中新发现的小胶质细胞基序STAT1、FOXN1、KLFs、ATF3和Npas4也在植入单核细胞中富集（图4），表明单核细胞在植入视网膜后染色质可及性的动态开放变化。
植入单核细胞下调经典标记物Ly6C和CD45
为了评估慢性CNS病理中经典单核细胞标记物的稳定性，我们追踪了Ly6C和CD45的表达。众所周知，Ly6C+单核细胞在炎症期间被招募到CNS，并且小胶质细胞通常可以通过其中间（CD45int）与高（CD45high）CD45表达水平与单核细胞区分。
使用CX3CR1+/EGFP::CCR2+/RFP骨髓嵌合体模型，我们追踪了单核细胞植入视网膜后的表型演变（图5A）。我们观察到45天内明显的转变：最初为CCR2highCX3CR1low（第1组）的浸润单核细胞逐渐成熟为主要为CCR2low/-CX3CR1high的群体（第5组），在表型上与常驻小胶质细胞（第6组）相似（图5B）。
Ly6C表达与这一转变紧密相关。早期浸润的CCR2high单核细胞表现出高水平的Ly6C，随后逐渐下调，因为大多数细胞采用CCR2low/-CX3CR1high植入表型（第5组）（图5C，D）。值得注意的是，一小部分保留高CCR2表达的植入单核细胞在整个研究期间也维持高水平的Ly6C（第4组）（图5C，D）。
CD45的表达遵循类似的抑制模式。虽然在第1天和第7天，CD45high单核细胞和CD45int小胶质细胞之间的区别很明显，但大多数植入单核细胞（88.5%的GFP+细胞）到第45天将CD45下调至中间水平，模糊了两种细胞类型之间的区别（图5E-G）。
综合来看，这些数据表明，在慢性环境中，植入单核细胞上Ly6C和CD45的表达与常驻小胶质细胞趋同。这使得这些常规标记物在长期准确区分两个群体时不可靠。图6提供了这些形态和标记物表达随时间的动态变化的综合总结。
讨论
小胶质细胞对CNS病理的确切贡献仍然是激烈争论的主题，研究报告了既有神经保护作用又有有害作用。这一争议是由技术限制和，正如我们的研究所示，缺乏特定标记物来区分常驻小胶质细胞和浸润并永久植入CNS的外周来源单核细胞所引发的。在这里，我们提供了确凿证据，证明植入单核细胞在表观遗传上被重编程，以表达一系列标记物——P2RY12、TMEM119、FCRLS和Iba1——这些标记物被广泛认为是小胶质细胞特异性的。这一发现挑战了如何识别这些细胞群体的基础，并要求重新评估它们在CNS疾病中的各自作用，考虑到单核细胞更具促炎表型。
我们的数据直接反驳了TMEM119和P2RY12的假定特异性。虽然TMEM119被提议作为区分小胶质细胞和浸润单核细胞的稳定标记物，但我们证明CCR2+单核细胞在视网膜浸润后一天内就开始表达TMEM119，此后在植入细胞中普遍表达。同样，P2RY12和FCRLS最初被描述为在急性EAE模型中的浸润单核细胞中缺失，但在我们的慢性植入模型中，它们在视网膜、大脑和脊髓中明显上调。P2RY12的表达明显是异质性的，出现较晚，表明更复杂和渐进的成熟过程。这种动态和区域特异性调控在脊髓中尤为明显，其中植入细胞中的P2RY12表达在一个月时缺失，但到一年时变得稳健。
这些发现具有深远影响。例如，在阿尔茨海默病研究中，围绕Aβ斑块的P2RY12阴性髓系细胞通常被解释为对病理有贡献的机能失调小胶质细胞。我们的结果提出了一个引人注目的可能性，即这种P2RY12阴性群体实际上可能由最近植入的单核细胞组成。如果属实，这将从根本上改变对其作用的解释，将焦点从小胶质细胞功能障碍转向一种不同的、外周来源细胞类型的病理贡献。同样，必须重新考虑在tau蛋白病和多发性硬化症研究中普遍使用IBA1和CD45表达谱来识别小胶质细胞，因为我们证明长期植入的单核细胞采用与常驻小胶质细胞相同的IBA1+和CD45int特征。最后，使用CD45hi CD11b+常规标记物的表达也是不充分的，因为植入单核细胞在45天时具有与小胶质细胞相似的表达水平（CD45lo CD11b+）。
从机制上讲，我们的工作揭示这种表型收敛是由深刻的表观遗传重塑驱动的。ATAC-seq分析为观察到的变化提供了令人信服的解释，显示植入单核细胞在关键小胶质细胞身份基因位点（P2ry12、Tmem119）上获得了染色质可及性。基序分析进一步巩固了这一结论，揭示了PU.1、IRF和RUNX等转录因子的富集，这些是已知的人类和小鼠小胶质细胞身份和小胶质细胞生成的主调控因子。其他已建立的小胶质细胞基因，如SPP1、C1qa和Ms4a7，也在单核细胞植入后变得可及，这一特征在循环血液单核细胞中未观察到。关键的是，这种分析也为这些细胞的功能分歧提供了机制线索。在植入单核细胞中但不在幼稚小胶质细胞中富集的疾病相关转录因子MITF和促炎枢纽NFKB1的独特基序富集，为它们先前报道的促神经退行性表型提供了强大的分子解释。因此，虽然它们获得了小胶质细胞的"外观"，但它们似乎在表观遗传上被硬编码为更具侵略性、炎症性的反应。
我们还发现CNS中免疫监视存在根本差异。在健康动物中，单核细胞植入是大脑和脊髓中的正常生理过程，如本研究所示，随着动物寿命的延长而稳定发生，以及我们实验室先前在视神经中显示的那样。相比之下，健康视网膜仅由胚胎小胶质细胞占据，需要损伤来触发单核细胞浸润。这一区别对理解区域易感性和设计区域特异性疗法具有重大意义。细胞激活状态可能比本体论更重要；在健康大脑中替代小胶质细胞的静止单核细胞为MHC-II阴性，而视网膜中损伤引发的单核细胞为MHC-II阳性且具有反应性（图S8）。这表明靶向反应性单核细胞的"功能"，也许通过表观遗传调节，可能是一种强大的治疗策略。
本研究有局限性。骨髓嵌合体模型依赖于骨髓消融，可能潜在地改变造血，尽管我们实现了近乎完全的嵌合体，屏障破坏最小。异种共生模型可能提供替代方案，尽管技术上更难建立。Cre-based荧光谱系追踪模型也可以作为替代方案，但不完全激活或渗漏的Cre表达可能导致小胶质细胞和单核细胞的错误标记。我们的模型实现了近完全的嵌合体（约95%）和供体细胞在CNS中的长期植入，这对于分子谱分析至关重要。虽然我们提供了稳健的ATAC-seq数据，但未来研究使用CUT&RUN或ChIP-seq可以进一步剖析驱动这种转变的特定组蛋白修饰和增强子景观。未来研究将需要调查这些长期CNS植入单核细胞的功能二分法，以及它们表现为稳态小胶质细胞同时准备超炎症的能力。这种潜在的混合状态可以解释慢性神经退行性疾病的临床困难。
总之，我们的研究表明，CNS微环境积极重塑浸润单核细胞的身份，迫使它们采用小胶质样表型并表达经典的小胶质细胞特异性标记物。这种模仿使其在慢性疾病环境中无法用于确定的谱系追踪。在开发出真正稳定和特异的蛋白质标记物之前，该领域必须依赖复杂的命运追踪策略，并对细胞错误识别的可能性保持警惕。揭示这种显著细胞可塑性的功能后果将是理解并最终治疗各种致残性CNS疾病的关键。
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