摘要
微生物群衍生的代谢物已成为长寿的关键调节因子。肠道微生物群的代谢活性受饮食成分和摄入化学物质的影响，对宿主健康产生深远影响。虽然饮食益生元的益处广为人知，但化学靶向肠道微生物群以增强宿主健康的策略仍很大程度上未被探索。本研究报道了一种新的化学方法，在宿主肠道中诱导促长寿细菌代谢物。研究发现，当暴露于低剂量头孢洛林(cephaloridine)时，野生型大肠杆菌(Escherichia coli)菌株会过度产生岩藻糖酸(CAs)，从而延长宿主生物线虫(Caenorhabditis elegans)的寿命。在小鼠肠道中，口服低剂量头孢洛林诱导了共生大肠杆菌中负责CA生物合成的荚膜多糖合成(cps)操纵子在37°C下的转录，并减弱了与年龄相关的代谢变化。研究还发现，低剂量头孢洛林克服了CA生物合成的温度依赖性抑制，并通过膜结合组氨酸激酶ZraS介导的机制促进其诱导，独立于头孢洛林已知的抗生素特性。这项工作为通过化学调节细菌代谢的微生物群基础治疗奠定了基础，并突显了利用靶向细菌药物在促进宿主长寿方面的巨大潜力。
引言
存在于胃肠道(GI)中的肠道微生物群在人类健康和疾病易感性方面起着关键作用，影响宿主的神经元功能、免疫和寿命。超过2000个属的微生物群基因组成(称为微生物组)编码关键酶，介导独特微生物代谢物、宿主衍生的次级代谢物以及宿主-微生物共享代谢物的产生。这些微生物代谢物作为必需营养素为局部肠上皮细胞提供能量，并作为信号分子通过血液循环影响远端器官。微生物群还响应环境输入，如饮食变化和药物使用，基于摄入的饮食产生生物活性化合物，或改变药物功效，使其更具活性、活性降低甚至产生毒性，从而对宿主产生有利和不利的结果。药物与肠道微生物群之间的相互作用在各种生物过程中起着至关重要的作用。其中一种过程是异种生物效应，微生物群将前药转化为活性或非活性形式，从而改变其生物利用度和生物活性。相反，接触药物会影响微生物群内的代谢途径，通过改变微生物群落组成和调节酶活性。在小鼠和人类中的研究表明，胃肠道接触各种药物会导致肠道微生物群组成发生变化。常用的药物，如质子泵抑制剂、二甲双胍、抗生素和泻药，都与微生物代谢途径的改变有关。然而，这些药物诱导变化的精确机制，以及它们对肠道生理和宿主健康的功能后果，仍然知之甚少。
近年来，越来越多的基于微生物组的治疗方法已显示出对宿主的益处，包括粪便微生物群移植、饮食益生元、肠内共生细菌重建、工程细菌引入以及微生物群衍生生物活性化合物的补充。本研究介绍一种基于微生物组的方法，使用宿主不可渗透的药物特异性靶向肠道共生体中的代谢生物合成途径，以促进宿主长寿。与现有策略不同，该方法化学靶向现有共生群落，以诱导对宿主有益的代谢产物。研究团队在秀丽隐杆线虫(C. elegans)和小家鼠(Mus musculus，小鼠)中证明了这种方法，并进一步揭示了大肠杆菌中这种化学诱导效应的分子机制。
结果
低剂量头孢洛林诱导CA突破温度限制延长寿命
岩藻糖酸(CA)是一种在大肠杆菌和其他肠杆菌科中合成的细胞外多糖。其生物合成由荚膜多糖合成(cps)操纵子编码的一系列酶催化。研究团队之前的研究揭示了CA在秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇中的促长寿作用。他们还表明，cps操纵子的光遗传学诱导足以延长秀丽隐杆线虫的寿命。为了检验cps操纵子在人类肠道微生物组中的相关性，研究团队使用DIAMOND在统一人类胃肠道基因组(UHGG)中进行了搜索。在这个数据库中，4,744个物种中的47个(约0.99%)包含至少一个携带cps操纵子的基因组，对应于289,232个总基因组中的5,578个基因组。这些包括大肠杆菌中的4,598个，沙门氏菌中的466个，肠杆菌中的341个，柠檬酸杆菌中的147个，以及其他物种中的26个。
研究团队分析了两个人类百岁老人肠道微生物组的公开可用宏基因组数据集(P RJNA675598，PRJEB25514)。在他们的分析中，肠杆菌科占意大利队列(P RJEB25514)总读数的约1.43%，日本队列(P RJNA675598)中占3.02%。他们进一步比较了这两个队列中百岁老人和老年对照组之间cps操纵子的存在情况。平均而言，日本队列中9.16%的总读数和意大利队列中7.25%的总读数映射到从47个已识别物种中获得的代表性cps阳性基因组。
在日本队列中，包括每组100多名个体，研究团队观察到百岁老人和对照组之间cps操纵子丰度存在统计学显著差异(Welch's t检验，p = 0.0071)，效应大小为小到中等(Cohen's d = 0.37)。在包括每组约20名个体的意大利队列中，也观察到统计学显著差异(Welch's t检验，p = 0.0436)，效应大小为中等(Cohen's d = 0.64)。这些发现支持百岁老人个体中cps操纵子丰度有小到适度的增加。
大肠杆菌属是携带cps操纵子的最大属，大肠杆菌是已知最早定植人类肠道的共生细菌之一。然而，当环境温度超过30°C时，大肠杆菌cps操纵子产生的CA会受到限制。先前的研究表明，某些β-内酰胺类抗生素在亚最小抑菌浓度(sub-MIC)下在37°C时触发大肠杆菌中cps操纵子的过表达。研究团队利用含有cps操纵子转录调控LacZ报告基因的大肠杆菌菌株，筛选了多种β-内酰胺类抗生素以及破坏外膜、蛋白质合成和基因组复制的抗生素。他们确认头孢洛林(Cepha)和头孢唑啉(Cafez)强烈诱导cps操纵子，而头孢噻吩(CephT)、头孢呋辛(Cefu)和青霉素类——苄青霉素(PenG)、氨苄西林(Amp)和羧苄西林(Carb)——显示出不同程度的中等效果。
研究团队量化了不同抗生素处理后细菌培养基中的CA产量。亚MIC头孢洛林处理的大肠杆菌培养基显示出最高的CA水平。此外，他们发现最有效的CA诱导浓度的头孢洛林为1.8 μg/mL。与亚MIC抗生素暴露通常观察到的生长延迟不同，用1.8 μg/mL头孢洛林处理的野生型大肠杆菌表现出与未经处理对照相当的生长速率。
研究团队将这种低剂量头孢洛林称为岩藻糖酸诱导剂量(Cepha-CAI剂量)。
研究团队应用受激拉曼散射(SRS)显微镜来监测氘标记葡萄糖掺入单个细菌的情况，发现Cepha-CAI剂量在37°C下克服了CA生产的温度限制，而不抑制大肠杆菌生长或导致细胞不可行。与Δlon突变体类似，用Cepha-CAI剂量处理的野生型大肠杆菌在对数生长期显示出增加的CA产生，并且升高的水平持续到稳定期。重要的是，用Cepha-CAI剂量处理的大肠杆菌饲养的野生型秀丽隐杆线虫与未经处理的对照相比，寿命延长了14%。这表明化学诱导的CA有效地赋予了宿主秀丽隐杆线虫促长寿益处。
低剂量头孢洛林通过CA诱导改善小鼠衰老过程中的代谢健康
由于口服吸收不良，头孢洛林作为抗生素制剂已在临床上终止使用。即使在1 mM浓度下，由于高外排率，头孢洛林也无法被胃肠道充分吸收。研究团队首先在37°C下用Cepha-CAI剂量处理MG1655(一种源自人类微生物群的K-12大肠杆菌菌株)，并在培养基中检测到CA水平升高。此外，用Cepha-CAI剂量处理的MG1655饲养的野生型秀丽隐杆线虫寿命延长了13%。
为了监测小鼠肠道内CA生物合成的诱导，研究团队对MG1655菌株进行了基因工程改造，使其在cps启动子控制下表达GFP，并在组成型启动子syn135下表达RFP(cps G-R报告菌株)。他们发现Cepha-CAI剂量在37°C下将GFP-to-RFP强度比率从0.87提高到1.05。接下来，他们通过饮用水将这种G-R报告菌株引入野生型C57B6(B6)小鼠，以检查小鼠肠道中的化学诱导。
利用最小的肠道吸收并使用低剂量头孢洛林(2 μg/mL或4.8 μM，4 μg/mL或9.6 μM)，研究团队检查了它对肠道细菌诱导ps操纵子的影响。通过对从小鼠回肠腔内容物中收获的RFP标记的大肠杆菌进行成像，他们观察到用2 μg/mL(2.01至2.16)和4 μg/mL(2.19至2.41)头孢洛林处理的小鼠中GFP-to-RFP比率增加。在用8 μg/mL头孢洛林处理的小鼠中未观察到这种增加。这些发现表明低剂量头孢洛林有效地刺激了哺乳动物肠道微生物群中大肠杆菌的ps操纵子。
研究团队通过饮用水用2 μg/mL头孢洛林处理一岁野生型小鼠6个月，并对血浆样本中的一系列代谢参数进行了分析。他们发现18月龄雄性小鼠的低密度脂蛋白(LDL)水平升高，而18月龄雌性小鼠的胰岛素水平升高。值得注意的是，这些与年龄相关的增加被头孢洛林处理减弱。此外，头孢洛林处理不影响高密度脂蛋白(HDL)水平，从而导致LDL/HDL比率降低。这些发现表明头孢洛林诱导的CA产生减轻了小鼠与年龄相关的代谢功能障碍。
研究团队还收集了粪便样本，对这些样本的宏基因组分析显示微生物组丰富度未被头孢洛林处理降低，支持低剂量头孢洛林不会导致微生物群中细菌致死性的观点。
化学诱导岩藻糖酸独立于RcsC-RcsD
研究团队调查了Cepha-CAI剂量诱导CA的分子机制。在低于30°C的非限制温度下，CA生物合成的诱导已知由RCS双组分系统(TCS)介导。该系统涉及位于内膜的RcsC传感器组氨酸激酶，它响应环境线索自磷酸化。
为了评估RCS系统在37°C下化学诱导CA的必要性，研究团队用Cepha-CAI剂量处理了大肠杆菌的rcsA、rcsB、rcsC和rcsD缺失突变体。通过测量它们各自培养基中的CA水平，他们发现删除rcsA或rcsB完全消除了Cepha-CAI剂量对CA的诱导。令他们惊讶的是，删除rcsC或rcsD并未抑制诱导。这些结果表明头孢洛林依赖于RcsA-RcsB对ps操纵子的转录控制，但独立于细菌内膜上的RcsC-RcsD TCS。
进一步调查秀丽隐杆线虫的宿主寿命显示，与用头孢洛林处理的野生型大肠杆菌不同，用头孢洛林处理的rcsA缺失突变体未能延长宿主寿命。相反，用头孢洛林处理的rcsD缺失突变体在引起寿命延长方面仍然有效。这些结果进一步支持细菌中CA的化学诱导是低剂量头孢洛林对宿主促长寿效应的基础，并表明RcsC-RcsD内膜激酶复合物对于头孢洛林介导的促长寿CA诱导是可有可无的。
PBP1a和ZraS介导CA的化学诱导
研究团队假设Cepha-CAI剂量通过其他细菌内膜蛋白发挥作用。考虑到β-内酰胺类抗生素对各种青霉素结合蛋白(PBPs)表现出优先亲和力，他们探索了这些内膜蛋白在调节CA化学诱导中的作用。在大肠杆菌中，头孢洛林、头孢唑啉和头孢噻吩主要与PBP1a结合，PBP1a是由mrcA编码的蛋白。Cepha-CAI剂量未能在mrcA缺失突变体(ΔPBP1a)中诱导CA生物合成，但在dacB缺失突变体(ΔPBP4)中仍然有效。因此，低剂量头孢洛林特异性通过PBP1a诱导CA。
研究团队使用RNA-seq分析，对Cepha-CAI剂量处理的大肠杆菌和未处理对照之间显著差异表达的基因进行了鉴定。他们观察到RcsB靶基因的富集，确认RcsB转录因子在头孢洛林介导的CA诱导中的关键作用。此外，他们识别出另外四个TCS——BtsS-BtsR、RstB-RstA、GlrK-GlrR和ZraS-ZraR——它们的靶基因在Cepha-CAI剂量响应中差异表达的候选基因中富集。
研究团队用Cepha-CAI剂量在37°C下处理了btsS、glrK和zraS的单基因缺失突变体大肠杆菌，然后测量了它们各自培养基中的CA水平。他们发现zraS缺失突变体中的CA水平高于未用头孢洛林处理的野生型大肠杆菌。这一发现表明ZraS在基线条件下通常抑制CA生物合成。此外，用Cepha-CAI剂量处理并未进一步提高zraS突变体中的CA水平，表明ZraS对于介导头孢洛林的CA诱导效应是必需的。相反，删除btsS或glrK不影响Cepha-CAI剂量对CA的诱导。这些结果表明ZraS作为内膜激酶，通常在37°C下抑制CA生物合成；然而，暴露于低剂量头孢洛林似乎将ZraS从抑制剂转变为CA生产的激活剂。
研究团队提出了一个模型，即ZraS在37°C下抑制RcsAB，从而在该温度下沉默ps操纵子。当头孢洛林与PBP1a结合时，ZraS的激活(可能与其自磷酸化相关)通过RcsAB触发ps操纵子的转录上调，进而促进在37°C下产生促长寿CA。
讨论
在这项研究中，研究团队使用异种生物化学物质直接靶向和激活对宿主健康产生积极影响的共生大肠杆菌的代谢途径。他们表明，低剂量头孢洛林诱导共生大肠杆菌产生CA，导致宿主秀丽隐杆线虫寿命延长。这种化学诱导克服了小鼠肠道中ps基因表达的温度限制。此外，他们发现了组氨酸激酶ZraS作为细菌中这种化学诱导的新调节因子。
有趣的是，低剂量头孢洛林在小鼠肠道中诱导了ps操纵子，而高剂量未能产生相同效果。此外，并非所有抗生素，即使是其他β-内酰胺类抗生素，都与头孢洛林在诱导ps操纵子方面具有相同效果。这些发现表明头孢洛林与细菌的相互作用与药物的经典抗菌特性不同，突显了头孢洛林在这种调控中的化学特异性的重要性。
低剂量头孢洛林作为化学诱导剂，通过细菌膜蛋白PBP1a和ZraS-RcsA/B信号传导，激活ps操纵子。研究团队的遗传分析表明，ZraS在37°C下抑制野生型大肠杆菌中的CA生物合成，并且低剂量头孢洛林激活ZraS，从而解除这种抑制。他们的发现表明头孢洛林上调zraP，支持它激活ZraS信号传导的观点。鉴于头孢菌素类β-内酰胺类抗生素主要与大肠杆菌中的PBP1a结合，这些发现表明ZraS可能特异性响应这些化合物对PBP1a的参与。
研究团队的发现强调了异种生物化学物质、细菌代谢和宿主健康之间的复杂相互作用，敦促重新评估主要关注真核靶标的传统药物发现范式。微生物群的巨大遗传多样性和代谢途径为开发靶向细菌的化学诱导剂或抑制剂提供了巨大机会。将这些策略与已建立的基于微生物组的治疗方法相结合，有望提供一种协同方法来应对复杂的健康挑战。
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