摘要
脑出血（ICH）与高死亡率和致残率相关，目前的治疗方法对功能恢复提供的益处有限。人脐带来源的间充质基质细胞（hUCMSC）具有强大的增殖、神经保护和免疫调节特性，使其成为临床转化的有吸引力选择。我们评估了在雄性小鼠的胶原酶诱导的ICH模型中静脉注射hUCMSC的治疗效果。小鼠在ICH后72小时内接受一次或两次低剂量或高剂量的hUCMSC。重复高剂量给药显著改善了运动、认知和情感行为。尽管重复高剂量hUCMSC给药产生了最显著的行为恢复，但大多数后续分析使用的是单次给药组。组织学分析显示神经元凋亡和小胶质细胞活化减少，与神经保护一致。体外实验表明，在免疫细胞中抑制了炎症基因表达并促进了抗炎表型。流式细胞术显示选择性减少促炎巨噬细胞和小胶质细胞，增加了修复性亚群，并系统性地调节了髓系动力学。我们的结果表明，较高剂量的静脉注射hUCMSC通过协调的局部和系统性免疫调节提供了强大的神经保护，为ICH临床MSC治疗提供了转化见解。
引言
脑出血（ICH）占所有中风的10-20%，是最严重类型的中风之一。其发病后一个月死亡率约为40%，三个月后致残率约为60%。尽管外科干预和急性医疗措施可以挽救生命，但它们对改善长期神经行为结果的影响有限。康复已被确定为ICH患者功能恢复的关键策略；然而，其治疗效果仍然有限。
近年来，基于干细胞的疗法作为神经系统疾病潜在的再生治疗方法得到了积极研究。干细胞具有在特定条件下增殖和自我更新的能力。它们大致分为两类：源自囊胚内细胞团的胚胎干细胞和源自各种成年组织的体细胞干细胞。在体细胞干细胞中，间充质基质细胞（MSCs）因其独特的生物学特性而受到广泛关注，包括分泌生长因子和细胞因子、免疫调节、神经发生和血管生成。MSC可以从骨髓、脂肪组织和围产期组织等多种组织中分离出来，使其成为临床应用的有吸引力候选者。
人骨髓来源的MSC（hBMSC）是研究最广泛的MSC类型，已在许多国家获批用于治疗移植物抗宿主病（GVHD）。针对各种疾病的临床试验也在进行中，包括中风。几项动物研究表明，MSC的静脉给药可改善ICH后的神经行为结果。然而，hBMSC的获取需要侵入性骨髓抽吸，其并发症风险约为0.05%，包括出血和感染。
为克服这一限制，我们小组开发了人脂肪来源的干细胞（hADSC），这些细胞可以以较少侵入性方式获取，并且与hBMSC相比具有相当或更优的细胞因子分泌谱。随后，我们从剖腹产过程中获得的胎膜建立了人羊膜来源的MSC（hAMSC），该过程避免了额外的侵入性采集。hAMSC分泌的细胞因子水平等于或大于hBMSC，并且据报道在细胞因子分泌谱方面超过了hADSC。我们之前的研究表明，hAMSC在ICH小鼠中产生的功能改善优于hADSC。临床前体内研究报道hAMSC给药后无显著不良事件，人体试验中也未出现重大安全问题。事实上，hAMSC的临床试验正在进行中，用于GVHD和克罗恩病。
人脐带来源的MSC（hUCMSC）与hAMSC有许多共同优势，因为它们可以从围产期组织中分离出来，无需额外的侵入性程序。值得注意的是，与骨髓来源的MSCs相比，hUCMSC表现出增强的增殖能力，这可能有利于大规模临床应用。
基于这些发现，我们假设静脉注射hUCMSC将通过调节局部和全身炎症反应来增强神经行为缺陷的恢复。为验证这一假设，我们在小鼠中诱导ICH，给予hUCMSC，并利用全面的神经行为评估电池评估功能恢复。此外，为研究潜在机制，我们进行了定量PCR（qPCR）、免疫染色、TUNEL实验和流式细胞术。
材料与方法
hUCMSC细胞制备
hUCMSC分离和扩增的程序获得了兵库医科大学机构伦理委员会的批准（批准号：0325）。操作按照先前报道进行。已获得所有捐赠者的书面知情同意。简而言之，脐带取自足月剖腹产。脐带通过机械方式与绒毛膜和羊膜分离，并在37°C下用胶原酶/分散酶溶液消化1小时。将所得细胞悬液通过100-µm筛网过滤，重悬于含专有生长因子的R: STEM培养基（ROHTO Pharmaceutical Co., Ltd., Japan）中，并在标准条件下（37°C，5% CO₂，湿润大气）培养于未涂层塑料培养皿中。细胞粘附未使用任何涂层材料。hUCMSC在第7代冷冻保存并在使用前解冻。冷冻保存时，hUCMSC悬浮于冷冻培养基中并储存在-80°C超低温冰箱中直至使用。实验时，将冷冻小瓶在37°C水浴中快速解冻，轻轻混合以确保完全解冻，并立即转移到预热的培养基中进行恢复，然后给药。本研究中使用的所有hUCMSC均来自单一供体，以确保实验的一致性。
小鼠和ICH诱导
本研究的所有动物实验均获得机构动物护理伦理委员会批准（批准号：21–012 A和24–047 A）。该程序已在先前报道中描述。将7–9周龄的雄性C57BL/6J小鼠（20–25克）用1.5–2.0%异氟烷麻醉，并固定在立体定位装置中。将连接至Hamilton注射器的30号针头插入右侧纹状体（前囟前0.2毫米、外侧2.0毫米，硬脑膜下3.5毫米）。将胶原酶A型（AOF级；Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ, USA；目录号CLSAFA）溶解在0.5 µL无菌生理盐水中，并以0.1 µL/min的速率注射0.4 U，持续5分钟。注射后将针头停留10分钟以防止回流，然后缓慢拔出。术后，将小鼠放在加热垫上恢复，并送回家庭笼子，自由获取食物和水。每天至少监测两次小鼠是否有疼痛、脱水或神经功能恶化的迹象，并在必要时提供额外的支持性护理（液体补充或软食）。没有动物符合预先定义的排除标准，这些标准包括手术期间死亡。
使用随机数生成器将小鼠随机分配到治疗组。所有行为、组织学和流式细胞术分析均由对分组不知情的研究人员进行。
ICH小鼠hUCMSC给药
我们进行了一项实验以优化hUCMSC给药的剂量和次数。为了优化hUCMSC的剂量和给药次数，将小鼠随机分为六组：ICH-high*1 hUCMSC组（n = 17）、ICH-high*2 hUCMSC组（n = 14）、ICH-low*1 hUCMSC组（n = 11）、ICH-low*2 hUCMSC组（n = 11）、ICH-Vehicle组（n = 17）和假手术对照组（n = 16）。其中，ICH-high*1 hUCMSC组和ICH-low*1 hUCMSC组分别在ICH诱导后24小时静脉注射2.5 × 10^5个细胞/50 µl和0.5 × 10^5个细胞/50 µl的hUCMSC。ICH-high*2 hUCMSC组和ICH-low*2 hUCMSC组分别在ICH诱导后24小时和72小时静脉注射2.5 × 10^5个细胞/50 µl和0.5 × 10^5个细胞/50 µl的hUCMSC。ICH-Vehicle组接受50 µl载体对照的静脉注射。假手术组仅进行头皮切口。
组大小基于我们先前的研究，这些研究表明使用类似样本量可以检测到神经行为结果的统计学显著差异。未进行中期分析。
神经行为测试
该程序已在先前报道中描述。简而言之，从第29天开始进行以下神经行为测试，以评估小鼠的表型差异。所有行为评估均由对组身份不知情的实验人员进行。对测试结果的评估由对实验不知情的研究人员进行。每个测试的详细信息如下所述。从ICH后第29天到第51天遵循详细的行为测试时间表。测试顺序如下：开放场测试（第29–31天）、强迫游泳测试（第38天）、Morris水迷宫获取和探测试验（第42–46天）以及被动回避测试（第48–50天）。
开放场测试
一个由透明丙烯酸板制成的无顶立方开放场箱（30 × 30 × 30 cm）放置在通风隔音室（Taiyo Electric）内。一个顶置白炽灯在测试区域中心提供约110 lx的环境照明强度。安装在墙壁上部的一个风扇在室内产生45 dB的掩蔽噪声。在开放场箱的每个侧面上，设置两个红外线束，距地板2 cm，相距10 cm。在两个光束之间安装了一个触发器电路。记录电路断开的总次数作为运动行为。每只小鼠允许在开放场区域内自由探索10分钟，连续三天。
开放空间游泳测试
开放空间游泳测试用于评估小鼠的神经肌肉力量和抑郁样症状。一个圆形水池（内径：95 cm，深度：35 cm）被白色墙壁包围（宽度：130 cm，高度：120 cm），注水至20 cm深。水用二氧化钛制成不透明，以便视频跟踪系统（Be Chase ver.1.3, ISONIX）跟踪小鼠行为。水温保持在22 ± 1 °C。在每次测试中，将一只小鼠放入水池中，头部朝向水池外缘，允许自由游泳10分钟。所有测试均使用顶置CCD摄像机记录。使用视频跟踪系统计算受试小鼠的总游泳长度。
被动回避学习测试
被动回避学习测试用于评估小鼠的长期记忆功能。装置由尺寸相同的明暗隔间（15 × 15 × 15 cm）组成，带有网格地板。一个闸刀门将两个隔间分开。在条件测试中，将小鼠放在明隔间中。10秒后，打开闸刀门。当小鼠进入暗隔间时，关闭闸刀门。5秒后，通过网格地板输送电击（120 V，5秒）。
24和48小时后，进行保留测试，不使用电击。将受试小鼠放在明隔间中，记录进入暗隔间所需的时间，最长180秒。此持续时间（被动回避潜伏期）反映了受试小鼠对间隔24小时的电击的记忆功能。
强迫游泳测试
强迫游泳测试使用修改自原始报告的程序进行。在立方室（每边45 cm）天花板中心安装了一个红外传感器，具有隔音和通风功能，可以提前一秒检测小鼠活动。直接将小鼠单独放入玻璃圆筒（高度25 cm，直径10 cm）中，其中装有15 cm深、温度保持在23–25 °C的水。每分钟总计6分钟，根据活跃的、逃逸导向行为（如游泳、跳跃、直立、嗅探或潜水）的存在记录小鼠的活动计数。在每个时间点，观察小鼠1分钟，并记录活动计数。
Morris水迷宫学习测试
Morris水迷宫学习测试用于评估小鼠的空间识别能力。一个圆形水池（内径：95 cm，深度：35 cm）被白色墙壁包围（宽度：150 cm，高度：120 cm），注水至22 cm深。水用二氧化钛制成不透明，以便视频跟踪系统跟踪小鼠行为。水温保持在24 ± 1 °C。水池被分为四个虚拟象限：北、南、东和西。一个圆形白色平台（直径：10 cm）放置在水池北象限中心，低于水面0.5 cm。在每次测试中，随机将小鼠放入水中，头部朝向水池边缘，分别在南、东或西象限。当受试小鼠到达平台并在其上停留10秒时，测试结束。如果小鼠在60秒内找不到平台，则由实验者引导至平台并保持10秒。每只小鼠每天测试5次，间隔30秒，连续五天。所有测试均使用顶置CCD摄像机记录。使用视频跟踪系统测量从将受试小鼠放入水中到其到达平台的持续时间作为逃避潜伏期。
免疫染色
该程序已在先前报道中描述。将小鼠分为两组：hUCMSC组，在ICH诱导后24小时静脉注射2.5 × 10^5个hUCMSC悬浮在50 µL载体中；ICH组，仅静脉注射50 µL载体。在ICH第3天进行组织采集，因为先前研究表明血肿周围炎症和神经元凋亡在出血后72小时内达到峰值。在3–4%异氟烷深度麻醉下，小鼠经心脏灌注生理盐水，然后灌注4%多聚甲醛PBS溶液。大脑在4%多聚甲醛中后固定1天，然后在4°C下用30%蔗糖进行冷冻保护。使用冷冻切片机（CM1950, Leica Biosystems, Wetzlar, Germany）将脑组织冠状切片至10 μm。
脑切片使用以下一抗进行免疫荧光染色：抗-Iba1（兔多克隆；Abcam, Cambridge, UK；目录号ab178847；1:250）、抗-GDNF（鼠单克隆；Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA；目录号sc-13147；1:100）、抗-TNF-α（兔单克隆；Abcam, Cambridge, UK；目录号ab6671；1:100）和抗-CD11b（大鼠单克隆；BioLegend, San Diego, CA, USA；目录号101201；1:100）。应用适当的二抗，包括Alexa Fluor 488偶联抗兔IgG（Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA；目录号4412 S；1:500）、Alexa Fluor 555偶联抗鼠IgG（Cell Signaling Technology；目录号4409 S；1:500）和Alexa Fluor 647偶联抗大鼠IgG（Cell Signaling Technology；目录号4418 S；1:500）。用DAPI（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA；目录号D9542）对细胞核进行复染。使用荧光显微镜（BZ-X710, Keyence, Osaka, Japan）在所有组相同曝光设置下获取图像，以便进行定量比较。
为评估凋亡，使用原位细胞死亡检测试剂盒（In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein；Sigma-Aldrich；目录号11684795910）按照制造商说明对冷冻脑切片进行TUNEL染色。简而言之，切片在室温下与含有末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和荧光素标记dUTP的TUNEL反应混合物孵育1小时。然后用PBS洗涤切片，并用DAPI复染。所有染色切片均使用荧光显微镜（BZ-X710, Keyence）进行可视化。TUNEL和Iba1的Alexa Fluor 488信号在绿色通道检测，而DAPI在蓝色通道检测。
为定量分析，每只小鼠分析两个冠状切片，每个切片拍摄三个血肿周围区域，每只小鼠产生六个区域。切片在相对于前囟约+0.5至-0.5 mm处收集。每个感兴趣区域的大小对应于荧光显微镜采集放大倍数下的视野。样本量如下：TUNEL（hUCMSC，n = 8；ICH对照，n = 5），Iba1（hUCMSC，n = 5；对照，n = 5），TNFα、CD11b和GDNF（hUCMSC，n = 5；对照，n = 5）。
RNA提取和定量实时PCR
对于体内分析，在ICH后第3、4和8天收集血肿周围脑组织。在深度麻醉下取出大脑，用PBS冲洗，并切下包含血肿和周围组织的约2-mm厚冠状块，速冻在液氮中，并储存在-80°C。
对于体外分析，用LPS（100 µg/mL）刺激免疫细胞（外周血白细胞、脾细胞和骨髓细胞），并在Transwell插件（0.4 μm孔径）中与hUCMSC共培养，如下所述。24小时后，收获细胞并在PBS中洗涤。外周血细胞在红细胞裂解后以4 × 10^5/插件接种，脾细胞以5 × 10^6/插件接种，骨髓细胞以4 × 10^5/插件接种。hUCMSC在Rstem培养基中培养至融合后进行共培养。
使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）提取脑组织和共培养样品的RNA，并进行柱上DNase处理。使用SpectraMax® ABS Plus测量RNA浓度和纯度，使用ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix（TOYOBO）将1 µg RNA逆转录为cDNA。使用QuantStudio 12 K Flex（Applied Biosystems）和THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix（TOYOBO）进行定量PCR。循环参数为：95°C 1分钟，然后40个循环（95°C 15秒，60°C 15秒，72°C 35秒）。熔解曲线分析确认特异性。
使用2^−ΔΔCt方法以β-actin为参考基因确定相对表达。靶基因包括TNFα、TSG6、GDNF和VEGFα（脑组织）以及CCL2、F4/80、Ly6c、IL6、TNFα、CD163和CD204（共培养）。
LPS刺激免疫细胞的体外共培养实验
为评估hUCMSC在炎症条件下的免疫调节作用，我们使用Transwell系统建立了一个体外共培养系统。免疫细胞来自7–9周龄C57BL/6J小鼠的外周血、脾脏和骨髓，并用脂多糖（LPS，100 µg/mL）刺激。hUCMSC在下室培养至融合，LPS刺激的免疫细胞置于上插件中24小时，仅允许旁分泌相互作用。
使用肝素化注射器收集外周血白细胞。红细胞裂解后（RBC Lysis Buffer, BioLegend），白细胞重悬于补充10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640中，并以4 × 10^5细胞/插件接种到Transwell插件中。
脾细胞通过切碎脾脏、通过70-µm滤网过滤和红细胞裂解制备。细胞悬浮于RPMI-1640 + 10% FBS中，并以5 × 10^6细胞/插件接种。
通过用PBS冲洗股骨分离骨髓细胞，随后进行红细胞裂解。有核细胞以4 × 10^5细胞/插件接种到RPMI-1640 + 10% FBS中的插件中。
hUCMSC培养在24孔Transwell板（0.4 μm孔径）的下室Rstem培养基（ROHTO Pharmaceutical）中。一旦融合，将LPS刺激的免疫细胞添加到插件中，并在37°C 5% CO2条件下共培养24小时。
流式细胞术
所有流式细胞术分析均由对治疗组不知情的操作员进行。如图5B、6A所示，对所有样品应用相同的门控策略。该程序已在先前报道中描述。简而言之，在3–4%异氟烷深度麻醉下，小鼠经冰PBS灌注。取出大脑和脾脏；解剖股骨和胫骨以收获骨髓。通过心脏穿刺使用肝素化注射器或试管（MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD, Tokyo, Japan）收集外周血，并在进一步处理前保持在冰上。通过轻轻按压通过70-µm细胞筛网（使用注射器柱塞）机械解离脾脏。在4°C下以400 × g离心5分钟。将沉淀重悬于1–2 mL红细胞（RBC）裂解缓冲液（eBioscience或等效物）中，在室温下轻轻搅动孵育2–3分钟，用PBS中止，然后用PBS洗涤一次。将白细胞重悬于FACS缓冲液中。
使用25号针头用冷RPMI-1640冲洗股骨和胫骨中的骨髓，通过70-µm滤网过滤，在4°C下以400 × g离心5分钟。用1–2 mL RBC裂解缓冲液（BioLegend）在室温下轻轻搅动处理沉淀2–3分钟，用PBS中止，用PBS洗涤一次，并重悬于FACS缓冲液中。
将全血与冷PBS以1:1稀释，并在室温下与RBC裂解缓冲液（BioLegend）孵育10分钟，同时轻轻混合。用过量冷PBS中止裂解，然后在4°C下以400 × g离心5分钟。将沉淀用PBS洗涤一次，并重悬于FACS缓冲液中。
将大脑切碎并通过18号和20号针头轻轻剪切。洗涤组织，重悬于25% Percoll（GE Healthcare）中，并以500 × g离心20分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于Histopaque（Sigma）中。第二次离心（20分钟，500 × g）后，从Histopaque界面收集富集的免疫细胞，用PBS洗涤一次，并重悬于FACS缓冲液（PBS + 2% FBS）中。
细胞在4°C黑暗中与荧光染料偶联抗体孵育20–30分钟，用FACS缓冲液洗涤，并在采集前通过40–70 μm筛网过滤。包括荧光染料、供应商和最终工作浓度的抗体列表见补充表S2。根据制造商说明使用活力染料。使用LSRFortessa X-20（BD Biosciences）和BD FACSDiva软件获取荧光。使用FlowJo v10.5（BD Biosciences）分析数据。
除另有说明外，所有离心均关闭刹车。裂解步骤后，立即将样品用过量冷PBS稀释以终止红细胞裂解。
统计分析
所有结果以平均值±标准误表示。对于神经行为测试的统计分析，进行重复测量方差分析，将组作为受试者间因素，重复测量（例如，会话、试验或时间）作为受试者内因素。当方差分析显示显著效应时，使用Tukey–Kramer方法进行事后比较。对于流式细胞术数据和免疫染色数据的统计分析，对每一天应用Wilcoxon检验。统计显著性设定为P < 0.05（双尾）。所有统计分析均使用JMP版本17（SAS Institute, Cary, NC, USA）进行。根据ARRIVE 2.0指南，在所有分析中纳入了盲法、随机化和排除标准。
结果
静脉注射hUCMSC剂量依赖性改善ICH诱导的神经行为缺陷
为评估hUCMSC的治疗效果和最佳剂量及给药频率，我们在小鼠中诱导ICH。给予两种不同剂量：每只小鼠0.5 × 10^5或2.5 × 10^5个细胞，分别在ICH后24小时一次或在ICH后24小时和72小时两次。从第29天开始进行神经行为评估，包括开放场、被动回避学习、强迫游泳和Morris水迷宫测试（图1A）。在开放场测试中，运动计数存在显著的组效应（图1B；F5, 270= 21.9002，P < 0.0001）。与ICH-vehicle组相比，ICH-high*2组在第2天（P = 0.022）和第3天（P = 0.0059）的运动计数显著降低，而ICH-high1组在第3天显示出类似趋势（P = 0.088）。
在被动回避学习测试中，组效应也显著（图1C；F5, 270 = 9.7170，P < 0.0001）。与ICH-vehicle组相比，ICH-high*2组在24小时和48小时的步进潜伏期显著延长（P < 0.0001）。ICH-high*1组在48小时显示更长的潜伏期（P < 0.0001），ICH-low*2组在24小时显示更长的潜伏期（P < 0.0001）。
在Morris水迷宫中，逃避潜伏期在各组间显著不同（图1D；F5, 86 = 8.6717，P < 0.0001）。与vehicle-treated ICH小鼠相比，ICH-high*2组在第2天（P = 0.0398）、第4天（P = 0.0489）和第5天（P = 0.0030）显示更短的潜伏期；ICH-high*1组在第4天（P = 0.0135）和第5天（P = 0.0092）；ICH-low*2组在第4天（P = 0.0490）和第5天（P = 0.0252）。
在强迫游泳测试中，观察到显著的组效应（图1E；F30, 425 = 3.4666，P < 0.0001）。在第一分钟内（图1F），ICH-high2、ICH-high1和ICH-low*2组的活动计数显著高于ICH-vehicle组（P < 0.0001）。
总之，这些结果表明，hUCMSC治疗，尤其是重复高剂量给药，显著改善了ICH损伤的运动活动、学习和记忆。
静脉注射hUCMSC减少血肿周围区域的凋亡性细胞死亡
已知ICH通过巨噬细胞和小胶质细胞的激活诱导神经炎症，随后触发大脑中的凋亡途径。如实验时间线所示（图2A），在ICH诱导后24小时静脉给予hUCMSC，并在第3天收集大脑进行组织学分析。为检查凋亡性细胞死亡，对血肿周围切片进行TUNEL染色。在未治疗小鼠中，检测到大量TUNEL阳性细胞（图2B，顶排），而hUCMSC治疗小鼠显示明显更少的TUNEL阳性细胞（图2B，底排）。定量分析证实，与未治疗小鼠相比，hUCMSC给药显著减少了TUNEL阳性细胞密度（P < 0.01；图2B，右侧面板）。
hUCMSC治疗减轻小胶质细胞活化
在相同时间线（图2A）下，进行Iba1的免疫荧光染色以评估小胶质细胞活化。vehicle-treated小鼠在血肿周围区域表现出大量Iba1阳性细胞，而hUCMSC治疗小鼠显示出显著减少（图2C）。定量分析表明，hUCMSC给药后Iba1阳性细胞密度显著降低（P < 0.05；图2C，右侧面板）。
hUCMSC减轻脑中的局部神经炎症
为检查hUCMSC给药对ICH后神经炎症反应的影响，按照相同时间表（图2A）进行TNFα、CD11b和GDNF的免疫荧光染色。在ICH-vehicle组中，观察到大量TNFα阳性细胞，而hUCMSC治疗小鼠表现出明显更少的TNFα阳性细胞（图2D）。相反，与vehicle组相比，hUCMSC组中GDNF阳性细胞明显增加（图2D）。CD11b免疫反应性在hUCMSC治疗后显示出降低的趋势，尽管差异无统计学意义。定量分析证实，hUCMSC组中TNFα阳性细胞显著减少（P < 0.01），GDNF阳性细胞显著增加（P < 0.01）。这些发现表明，hUCMSC给药抑制了急性期促炎细胞因子的表达，同时增强了血肿周围区域中神经营养因子的产生。
静脉注射hUCMSC调节血肿周围脑中的炎症和神经保护基因表达
为评估hUCMSC治疗对ICH后炎症和神经保护介质的影响，我们在静脉注射hUCMSC或vehicle后第3、4和8天对血肿周围脑组织进行定量PCR分析（图3A）。定量TNFα、mTSG6、GDNF和VEGFα的表达以捕获促炎和修复反应。
在本研究中，我们发现静脉注射hUCMSC显著调节了血肿周围脑中的这种病理微环境。
促炎细胞因子TNFα在hUCMSC治疗组中与未治疗ICH组相比在第8天显著降低（P < 0.05）（图3B），表明延迟但持续的抗炎效应。相反，在hUCMSC组中，已知与活化的小胶质细胞和星形胶质细胞上的CD44⁺相互作用的强效免疫调节因子mTSG6在第4天（P < 0.01）和第8天（P < 0.05）显著上调（图3C）。这表明hUCMSC衍生的TSG6可能抑制NF-κB驱动的促炎基因转录，从而减弱小胶质细胞活化和细胞因子产生。
GDNF表达在hUCMSC治疗的大脑中在第4天和第8天显著上调（P < 0.05）（图3D），而第3天的水平与对照组相比无显著差异。这种模式表明延迟但持续增加的神经营养支持可能促进神经元存活和修复。关键血管生成介质VEGFα在第3天（P < 0.05）和第4天（P < 0.01）也显著上调（图3E），可能促进血管重塑并改善亚急性期的组织灌注。
这些时间表达模式与先前报道一致，即MSC衍生的TSG6减少神经炎症。但我们的发现将这些观察扩展到血肿周围区域。这种分子谱——以促炎信号的持续抑制和修复途径的激活为特征——可能有助于改善功能恢复，正如我们在神经行为评估中观察到的那样。总之，这些结果支持hUCMSC通过细胞和分子机制创造有利的ICH后微环境的概念，对人类ICH治疗具有潜在的相关性。
hUCMSC在体外共培养模型中减轻促炎基因表达并部分增强来自脾脏、外周血、骨髓和脑的免疫细胞的M2标志物
鉴于静脉hUCMSC给药在体内调节了免疫反应，我们接下来研究了hUCMSC是否能在体外直接影响免疫细胞的炎症表型。脾细胞、外周血白细胞、骨髓细胞和脑源性细胞用LPS刺激，并使用Transwell系统与hUCMSC共培养24小时（图4A）。通过qPCR进行的基因表达分析显示，在脾细胞中，与单独LPS相比，LPS + hUCMSC组中F4/80和Ly6c显著下调（P < 0.01），而CCL2表达显著上调（P < 0.01）（图4B）。在外周血白细胞中，F4/80和IL6减少（P < 0.05），而CCL2显著增加（P < 0.01）（图4C）。在骨髓衍生细胞中，Ly6c表达显著降低（P < 0.05），hUCMSC组中TNFα和IL6显示出下降趋势（图4D）。在脑源性细胞中，促炎标志物CD86的表达趋于降低，而抗炎/修复标志物CD163显著上调（P < 0.05），CD204水平保持不变（图4E）。这种转变表明向更抗炎表型的转变，尽管最近的研究强调巨噬细胞/小胶质细胞激活状态存在于连续体中，而不是严格的M1/M2二分法。
这些发现表明，hUCMSC广泛抑制多个免疫区室中LPS诱导的促炎基因表达，同时选择性增强M2相关标志物，支持其调节LPS诱导后系统和中枢免疫反应的潜力。
hUCMSC治疗差异性调节ICH后浸润巨噬细胞和驻留小胶质细胞的促炎和抗炎极化
对血肿周围脑组织的流式细胞术分析（图5）显示，hUCMSC治疗在ICH后显著调节了浸润巨噬细胞（CD45^hiCD11b^hi）和驻留小胶质细胞（CD45^intCD11b^int）。
在CD45^hiCD11b^hi巨噬细胞群体中，与ICH-vehicle组相比，hUCMSC治疗组在第7天CD86⁺促炎细胞显著减少（P < 0.01），而在第2天或第3天未观察到显著差异。CD163⁺细胞在hUCMSC组中在第3天增加，尽管无统计学显著性，并在第7天恢复到基线水平。CD204⁺亚群在hUCMSC组中在第3天显示出增加的趋势，但在任何时间点均未检测到显著的组间差异。
在CD45^intCD11b^int小胶质细胞群体中，hUCMSC治疗在第2天（P < 0.05）和第7天（P < 0.05）显著降低CD86⁺细胞，而在第3天未观察到显著差异。相反，CD163⁺修复细胞在hUCMSC组中在第7天显著增加（P < 0.05），在第3天有增加趋势。CD204⁺小胶质细胞在任何检查时间点均未显示组间显著变化。
总之，这些发现表明，hUCMSC给药选择性抑制浸润巨噬细胞和驻留小胶质细胞中的CD86⁺促炎亚群，并促进CD163⁺修复亚群，而CD204⁺细胞不受影响。
系统髓系动力学反映短暂动员后抑制
为进一步表征hUCMSC治疗诱导的体内免疫变化，我们接下来通过流式细胞术分析评估了脾脏、血液和骨髓中的系统反应（图6）。在脾脏中，hUCMSC治疗小鼠在第2天CD11b⁺Ly6G⁺中性粒细胞短暂增加（P < 0.05），随后在第3天显著下降（P < 0.05）。CD11b⁺Ly6C^low单核细胞在第3天也减少（P < 0.05），CD11b⁺Ly6C^hi亚群无显著差异。外周血反映了这些动态：中性粒细胞和Ly6C^low在第2天达到峰值（中性粒细胞：P < 0.01；Ly6C^low：P < 0.05），而炎症单核细胞在第3天下降（P < 0.05）。在骨髓中，hUCMSC治疗导致CD11b⁺Ly6G⁺细胞在第7天显著减少（P < 0.01），并在第3天和第7天抑制Ly6C^low和Ly6C^hi单核细胞群（P < 0.05和P < 0.01）。这些发现证明了早期动员后快速免疫调节反应，随后炎症亚群被抑制——表明ICH后早期向抗炎调节转变。
讨论
在本研究中，我们证明了静脉注射hUCMSCs在胶原酶诱导的ICH小鼠模型中具有多方面的治疗效果。行为评估显示，高剂量重复给药（图1）显著改善了运动和认知恢复，表现为Morris水迷宫中逃避潜伏期缩短、开放场中探索活动增加以及强迫游泳测试中抑郁样行为减弱。这些发现表明，hUCMSC治疗不仅可以改善运动和认知缺陷，还可以改善情感障碍，这些障碍越来越被认为是ICH的重要后果。组织学分析显示，hUCMSC治疗减少了神经元凋亡并减弱了血肿周围小胶质细胞活化（图2），与直接神经保护作用一致。在分子水平上，hUCMSC抑制了促炎细胞因子TNFα，同时诱导了抗炎介质TSG6，并上调了神经营养和血管生成因子如GDNF和VEGFα（图3），表明协调的免疫调节和修复作用。互补的体外共培养实验进一步证明，hUCMSC下调炎症转录物并促进以CD206表达增加为特征的抗炎巨噬细胞表型（图4）。免疫细胞动力学的流式细胞术分析提供了这些效果的机制见解。在大脑中，hUCMSC给药显著调节了浸润巨噬细胞（CD45^hiCD11b^hi）和驻留小胶质细胞（CD45^intCD11b^int）。在两个群体中，hUCMSC抑制了CD86⁺促炎细胞的积累，同时促进CD163⁺修复亚群，而CD204⁺细胞不受影响（图5）。系统上，hUCMSC短暂动员髓系细胞，但随后在脾脏、血液和骨髓中抑制中性粒细胞和Ly6C^low单核细胞（图6），突显了它们在协调中枢和外周免疫反应中的作用。
总之，这些发现表明，静脉hUCMSC治疗通过神经保护和免疫调节的双重机制促进ICH后的功能恢复。hUCMSCs减少了神经元凋亡和小胶质细胞活化，同时增强了神经营养因子表达，从而支持组织修复。同时，它们选择性抑制CD86⁺促炎巨噬细胞和小胶质细胞，并增加CD163⁺修复亚群，同时系统性地限制中性粒细胞和Ly6C^low单核细胞扩增。这种结合的神经保护和免疫调节作用表明，hUCMSCs可能代表一种有希望的辅助疗法，可改善ICH的神经和神经精神结果。
ICH仍然是最严重的中风形式之一，占所有病例的10–20%，尽管在急性医疗和手术干预方面取得了进展，但仍与高死亡率和致残率相关。虽然及时的血肿清除、止血治疗和严格的神经重症监护可以降低早期死亡率，但这些措施在改善长期神经功能缺陷方面效果有限。ICH后的功能恢复在很大程度上取决于大脑自我修复的能力。然而，内源性修复机制不足以逆转继发性损伤级联，包括神经炎症、凋亡、氧化应激和神经血管完整性的破坏。神经炎症在触发这些病理级联中起核心作用，包括铁介导的氧化损伤和免疫细胞浸润，所有这些都对ICH后的神经功能恶化有重大贡献。小胶质细胞的早期活化、促炎介质的释放和外周白细胞浸润是继发性脑损伤的关键贡献者。
在过去的二十年中，MSC已成为神经系统疾病再生治疗的有希望候选者。MSC具有广泛的治疗效果：它们分泌支持神经元存活和突触可塑性的营养因子，通过将小胶质细胞和巨噬细胞转向抗炎表型影响免疫反应，并促进血管生成和神经发生。在MSC来源中，hBMSC研究广泛，但其临床使用受到骨髓抽吸侵入性和供体变异性的限制。脂肪组织和围产期组织（如羊膜、脐带）等替代来源提供侵入性较小的采集、更大的增殖能力和在某些情况下更高的细胞因子分泌谱。
hUCMSC对临床转化具有吸引力。它们可以从产后被丢弃的组织中非侵入性地获得，在体外高效扩增，并在缺血性中风和神经退行性疾病的临床前模型中表现出强大的免疫调节和神经保护作用。几项研究还探讨了hUCMSCs在实验性ICH中的治疗潜力。静脉或脑内移植hUCMSCs已被报道可减少血肿体积、抑制神经炎症并在小鼠和大鼠ICH模型中促进神经恢复。这些发现共同支持hUCMSCs在出血性中风中的神经保护和免疫调节潜力。然而，很少有研究全面检查它们在ICH中的作用，特别是在与脑和外周免疫反应相关时。先前的工作表明，外周免疫调节可以显著影响中风后的中枢神经系统炎症和恢复，但hUCMSC治疗ICH的直接证据有限。
在此背景下，本研究旨在检验静脉注射hUCMSC可以通过协调局部和系统性炎症调节改善ICH后神经行为结果的假设。通过整合行为测试、分子分析、组织学分析和系统免疫细胞表征，我们旨在阐明hUCMSC治疗的神经保护和免疫调节机制，并确定可能指导未来临床应用的潜在转化标志物。
在分子水平上，hUCMSC治疗调节了血肿周围区域的炎症和神经保护基因表达（图3）。值得注意的是，mTSG6表达显著上调，同时TNFα减少，表明hUCMSC可能部分通过诱导内源性TSG6发挥抗炎作用，TSG6已知可抑制TNFα介导的炎症级联。免疫组织化学进一步显示，在ICH后第3天，血肿周围区域的TNFα阳性细胞已经减少（图2），尽管全脑qPCR差异在此时间点无统计学意义，这意味着局部早期抗炎反应。同时，hUCMSC治疗增强了血肿周围脑中GDNF和VEGFα的表达，两者都已知促进神经元存活、突触可塑性和血管生成。尽管这些因子不直接与炎症相关，但它们的上调，加上小胶质细胞活化的抑制（图2），表明hUCMSC治疗协调了神经保护和抗炎机制，共同改善行为结果。
组织学分析证实了这些分子发现：TUNEL染色显示在ICH后第3天血肿周围区域凋亡细胞显著减少（图2），表明hUCMSC在早期损伤阶段减轻了细胞死亡。这与先前证据一致，即MSC治疗通过旁分泌介导的神经营养支持减少凋亡。
除了中枢神经系统外，我们的体外共培养实验（图4）显示，hUCMSCs抑制LPS诱导的促炎基因表达（CCL2、F4/80、Ly6C、IL-6）并增强脾脏、血液、骨髓和脑来源免疫细胞中的抗炎CD206表达。这些结果表明，hUCMSC直接抑制炎症反应，同时促进抗炎程序，从而在多个免疫区室中发挥细胞内在的免疫调节作用。重要的是，流式细胞术分析（图5和6）显示，hUCMSC给药在体内改变了系统髓系细胞动力学，包括短暂动员后Ly6G⁺中性粒细胞的抑制和炎症Ly6C^hi单核细胞的减少。同时，hUCMSC治疗在大脑中减少了多个时间点的CD86⁺髓系细胞，并选择性增加了CD163⁺巨噬细胞，表明向抗炎表型的转变。这些系统和中枢免疫调节作用共同可能有助于观察到的CNS炎症减少，与先前将外周免疫抑制和小胶质细胞极化与ICH和中风中的神经保护联系起来的研究一致。
总之，我们的发现支持hUCMSC治疗改善ICH诱导损伤的双重机制：（1）在血肿周围脑内局部抑制神经炎症和凋亡；（2）系统性免疫调节，限制外周髓系活化和浸润到CNS。这种中枢和外周免疫反应的综合调节可能解释了观察到的功能恢复，特别是重复高剂量给药。在临床上，这些结果表明，优化细胞剂量和时间可能最大化hUCMSC对ICH患者的治疗潜力，值得进一步转化和临床研究。
除了这些发现外，本研究还提出了几个新的贡献。最显着的特征是在同一实验框架内同时评估中枢（脑）和外周（脾脏、血液、骨髓）免疫反应，证明hUCMSC在两个部位发挥协调的免疫调节作用。值得注意的是，高剂量、重复静脉给药产生了最显著的功能恢复，与MSC治疗中剂量依赖性益处的先前报道一致。此外，TSG6表达增加与TNFα减少的时间和空间对应，以及小胶质细胞活化减少和凋亡细胞死亡减少，支持一个工作模型，即hUCMSCs通过旁分泌机制促进炎症解决并提供神经保护，可能涉及TSG6-CD44轴。
关于VEGF表达的几项发现与先前研究一致。在我们的模型中，VEGFα mRNA在早期亚急性期（第3–4天）短暂上升，表明hUCMSC给药后不久发生血管生成反应。这种模式与先前报道一致，即MSC移植增强了ICH后的血管生成。例如，Bao等人证明Flk-1⁺人骨髓来源的MSCs在大鼠ICH模型中显著增加了血肿周围区域的血管密度。更广泛的综述还描述了MSCs通过分泌VEGF和bFGF等血管生成因子在出血性中风环境中促进血管生成和血管重塑。此外，在非中风环境中，Wu等人表明hUCMSCs通过整合素β1/ERK1/2/HIF-1α/VEGF-A信号轴刺激内皮迁移、增殖和管形成。这些数据共同支持hUCMSCs通过短暂上调VEGF和相关营养因子促进ICH后的神经血管修复的观点。
其次，TNFα和GDNF表现出"局部与全脑"差异：免疫组织化学在第3天检测到显著的血肿周围变化，而全脑qPCR通常未达到统计学显著性。这可能反映了全组织分析中局部效应的稀释，并强调hUCMSC作用可能起始于病变周围区域。
第三，Ly6G⁺和Ly6C^low细胞的早期短暂增加——随后下降——与报道立即抑制的研究不同。这种双相模式可能代表初始动员阶段促进碎片清除，随后是免疫解决，并且可能特定于此处使用的急性期高剂量方案。
从转化角度看，这些发现支持临床发展的三个重要策略。首先，优化剂量和时间表——特别是结合初始高剂量推注和早期重复给药——可能增强功能恢复。第二，识别早期药效学标志物，如TSG6上调、TNFα抑制和小胶质细胞活化减少，可以告知个体化给药时间。第三，此处观察到的中枢-外周双重机制表明，hUCMSC治疗可以通过抑制系统性免疫激活同时抑制局部神经炎症，与常规手术和医疗干预协同作用。hUCMSC的即用性和静脉给药进一步增强了向临床实践转化的可行性。
这些发现的转化潜力相当可观。hUCMSC对系统性和局部免疫反应的双重调节表明，类似的治疗益处可能在人类ICH中实现，其中系统性炎症和局部神经炎症都是结果的关键决定因素。静脉给药途径——微创且适合快速给药——与急性中风护理路径很好地契合，便于与血肿清除、血压管理和神经重症监护监测等标准治疗整合。此处观察到的剂量依赖性效应，高剂量、重复给药产生最大功能恢复，支持对ICH患者测试递增剂量方案的早期临床试验的合理性。本研究中确定的生物标志物，包括血肿周围TNFα抑制、TSG6上调、小胶质细胞活化减少和循环髓系亚群调节，可作为早期药效学终点，指导给药时间表和患者选择。
此外，观察到的抗凋亡和神经营养作用——以更少的TUNEL阳性细胞和增加的GDNF表达为例——表明hUCMSC治疗可以将其获益窗口扩展到超急性期之外，靶向持续的继发性损伤过程。这在临床ICH中特别相关，因为血肿周围水肿、小胶质细胞活化和延迟神经元死亡在发病后持续数天至数周。
虽然必须承认啮齿动物模型与人类病理学之间的差异，但此处展示的稳健和多方面的机制——包括旁分泌介导的免疫调节、营养支持和凋亡抑制——增强了成功转化的可能性。事实上，最近一项在急性ICH患者中使用静脉MSC的I期剂量递增试验展示了可行性和安全性，患者纳入根据血肿体积（< 60 mL）和神经状态进行分层，并利用基于细胞因子的生物标志物评估治疗反应。此外，临床前荟萃分析表明，MSC给药时间（例如，ICH后8小时内vs. 24小时）显著影响结构性和功能性结果方面的疗效。因此，未来的试验应根据血肿体积、细胞给药时间和基线系统性炎症状态进行分层，以优化治疗效果。最终，这些数据强化了这样的观点：静脉给药的hUCMSC治疗，精确计时，可以作为辅助治疗，增强ICH患者的神经恢复并减少残疾。
结论
总之，静脉注射hUCMSC通过同时减少血肿周围脑中的局部神经炎症和细胞死亡以及调节系统性髓系反应，在小鼠ICH模型中提供神经保护。这些结合的中枢和外周免疫效应导致运动、认知和情感功能的显著改善。这些发现强调了优化剂量和时间以最大化治疗益处的必要性，支持临床转化的潜力，特别是作为ICH标准治疗的辅助治疗。
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