阴道微生物群移植用于治疗阴道微生态失调（不使用抗生素）：一项针对阴道微生态失调女性的双盲、随机对照试验 - 硒与微生态

摘要

背景

由乳杆菌属主导的阴道微生物群与降低感染风险和不良生殖结局风险相关。恢复健康微生物群的有效干预措施仍然稀缺。在本研究中，我们旨在评估在不使用抗生素预处理的情况下，阴道微生物群移植（VMT）在实现向乳杆菌主导的阴道微生物组转换方面的疗效。

方法

这项单中心、双盲、随机对照试验于2021年6月1日至2023年3月1日在哥本哈根大学医院（丹麦Hvidovre）进行。我们招募了18-40岁、患有无症状或有症状的分子阴道微生态失调（乳杆菌属总相对丰度<10%，加德纳菌属、阴道范妮氏菌和普雷沃菌属相对丰度>20%）且其他方面健康的绝经前女性（非妊娠）作为受试者；供体为18-40岁、拥有乳杆菌主导的阴道微生物群（>80%）且加德纳菌属、阴道范妮氏菌和普雷沃菌属丰度低（<5%）、性传播感染筛查阴性的健康女性。参与者通过计算机生成的随机分组方案（区组随机化，按激素避孕分层）以3:1的比例随机分配至干预组或安慰剂组。参与者和研究者均对分组不知情。在三个月经周期内给予最多三次VMT或安慰剂，并随访六个周期。主要终点是随访期间任何时间点微生态失调的缓解，定义为通过阴道样本的鸟枪法宏基因组测序评估，乳杆菌属相对丰度至少为70%，且加德纳菌属、阴道范妮氏菌和普雷沃菌属的总丰度低于10%。该分析在意向治疗人群中完成，不包括任何撤回知情同意的参与者。一项扩展研究评估了在难治性参与者中，进行额外VMT前使用抗菌预处理的效果。本研究已在ClinicalTrials.gov（NCT04855006）注册，并已完成。

发现

共筛选了302名女性，其中49名被纳入研究。37名女性被随机分配到VMT组（平均年龄26.1岁 [SD 3.8]），12名分配到安慰剂组（平均年龄27.3岁 [4.8]）。主要结局显示，活性组和安慰剂组在微生态失调缓解方面无显著差异（HR 0.65；95% CI 0.20–2.16，p=0.49）。在一项针对难治性参与者的扩展研究中，接受抗菌预处理后接受VMT的10名女性中有5名（50%）实现了微生物组转换。VMT组有15名（42%）参与者发生不良事件，安慰剂组有5名（42%）；均不严重，也未导致退出研究。发生一例妊娠和一例新发人乳头瘤病毒感染，均与治疗无关。

解释

本试验中，不使用抗生素的VMT并未显著改善微生物组转换。然而，扩展研究的结果表明，抗菌预处理可能增强疗效。未来的试验应探索优化剂量，并将供体植入作为主要结局。

资助

Freya Biosciences。

正文

引言

由乳杆菌属（卷曲乳杆菌、加塞乳杆菌、惰性乳杆菌或詹氏乳杆菌）主导的阴道微生物组与更好的生殖健康结局呈正相关。相反，加德纳菌属、阴道范妮氏菌和普雷沃菌属的存在则标志着通常被描述为微生态失调的微生物组成。阴道微生态失调影响16-52%的女性，具体比例取决于人群、地理位置和检测方法，并与不孕、流产和产科并发症相关。随着过去20年的进步，特别是DNA测序技术的发展，现在可以更深入地探索阴道微生物组，从而能够识别分子微生态失调以及基于临床体征（Amsel标准）或阴道微生物组显微镜评估（Nugent评分）的传统诊断。阴道微生物组失衡的管理策略通常包括在满足临床标准（如Amsel标准或Nugent评分）后进行抗生素治疗。然而，这些治疗面临着巨大挑战，12个月内复发率高达60%。为了降低抗生素治疗后的复发率，2019年的一项研究探索了使用来自健康供体（其阴道微生物组以乳杆菌为主）的阴道微生物群移植（VMT）。该研究包括五名有复发性症状性阴道微生态失调的女性，其中四名在长达三个周期的抗生素和VMT联合干预后获得了临床缓解。遵循这种方法，我们的团队报告了一例对一名有复杂妊娠史和严重症状性、以加德纳菌为主的阴道分子微生态失调的女性，通过不使用抗生素的VMT实现了长期成功治疗。尽管这些概念验证研究突显了VMT的潜力，但该治疗尚未在随机对照试验（RCT）环境中进行测试。这项安慰剂对照RCT的目的是评估不使用抗生素预处理的VMT在实现向乳杆菌主导的阴道微生物组转换方面的疗效，无论是否有阴道症状，并检查相关的免疫变化和供体菌株植入。

方法

研究设计

这项关于VMT在分子微生态失调参与者中的双盲、随机对照试验（DYSCOVER 2）于2021年6月1日至2023年3月1日在哥本哈根大学医院（丹麦Hvidovre）进行。研究方案于2021年3月16日获得丹麦首都地区伦理委员会（档案号 H-20068230）和丹麦数据保护局（P-2020-1080）的批准。本试验已在ClinicalTrials.gov（NCT04855006）注册，现已结束。完整的研究方案可供审稿人和期刊查阅，并可根据合理要求从通讯作者处获取。所有研究均按照赫尔辛基宣言进行，所有参与者均提供书面知情同意。本研究未指派数据监测委员会，因为根据丹麦法规不要求。该研究获得了丹麦健康研究伦理区域委员会的批准，该委员会确定VMT不属于丹麦药品法（因为它不被视为药物）也不属于组织法。因此，该研究被归类为非药物、非组织干预性研究，对此类研究不强制要求设立数据监测委员会。通过批准的研究方案、定期的研究者监测以及遵守良好临床实践标准，确保了伦理监督和参与者安全。

参与者

参与者通过社交媒体、研究地点哥本哈根大学医院内部以及哥本哈根地区不同教育机构的招贴画进行招募。参与研究的总体纳入标准为年龄18-40岁、自认为健康、绝经前且未怀孕的女性。参与者进一步接受筛选并分为供体和受者。尽管受者必须有阴道微生态失调，但这可以是无症状的或有症状的（例如，异常阴道分泌物、气味或瘙痒）；供者必须有阴道微生态正常且无症状（完整的纳入和排除标准清单见附录第19页）。受者需要愿意接受最多三次VMT，每次月经周期单次给药，并避免使用阴道内产品，避免使用泳池和浴缸等活动。此外，符合条件的受者还被要求在研究期间避免阴道和肛交，除非使用避孕套。我们开发了一份预筛选问卷，参与者回答了详细问题，例如个人病史、家族病史、生活方式因素、性史和性行为，以及避孕药具和阴道产品使用情况。同意参与后，参与者被要求在周期第8-12天（如果因激素避孕导致闭经，则任何一天均可）到研究地点，她们在那里收到关于研究的进一步信息，签署知情同意书，并自行采集阴道拭子样本。

随机化和盲法

在第二次访视时，受者队列中的参与者以3:1的比例随机分配至活性治疗组（VMT）或安慰剂组，按激素避孕药使用情况（是或否）分层，并使用在Sealed Envelope中生成的单独列表（每组n=50）进行区组随机化（每组4个）。这种分配是事先确定的，旨在为VMT生成更广泛的安全性和初步疗效数据，同时保留对照组进行比较。一名不参与试验实施或数据处理的第三方拥有随机化和揭盲列表的独家访问权。在筛选时，参与者根据其进入试验的时间顺序获得一个三位数的筛选编号。符合条件的参与者在第二次访视的基线评估后获得一个分层随机化编号。由Freya Biosciences生产的VMT和安慰剂外观相同，装在唯一编号的小瓶中，与随机化列表相关联。所有参与者、研究者、现场工作人员、实验室工作人员和统计学家在数据库锁定和正式揭盲前均对治疗分配保持盲态。

程序

指导参与者将拭子插入阴道5-6厘米，并确保拭子不接触其他身体部位或表面。临床采样使用Zymo Collection Swabs, 80XX（Zymo research, CA, USA）并储存在COPAN（Brescia, Italy）容器中（附录第3页）。在首次筛选之后，根据阴道微生物组的鸟枪法宏基因组测序分析（附录第4-5页），参与者被分为两组：潜在供者和潜在受者。潜在供者的阴道微生物组中，阴道乳杆菌属（卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌、加塞乳杆菌或惰性乳杆菌）的相对丰度大于80%，阴道微生态失调相关细菌（加德纳菌属、阴道范妮氏菌和普雷沃菌属）的相对丰度小于5%。潜在受者的乳杆菌属总相对丰度小于10%，加德纳菌属、阴道范妮氏菌和普雷沃菌属的相对丰度大于20%。参与者在40天内参加第二次预定访视。在此访视期间，符合条件的供者和受者接受了全面的医学和妇科评估。检查包括阴道检查、阴道超声扫描、一般健康检查，包括心、肺听诊、体重测量以及心率和血压测量。进行标准诊断性血液和阴道拭子检测，以评估各种病原体和疾病的存在，包括HIV、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、巨细胞病毒、人乳头瘤病毒（HPV；16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、69、73、82、11、40、42、43、44、54、6、61和70）以及单纯疱疹病毒（HSV）1型和2型（附录第9、20-21页）。供体的宫颈阴道分泌物材料由Freya Biosciences在丹麦哥本哈根收集、处理和储存，然后交付给哥本哈根大学医院Hvidovre。安慰剂材料由0.9%氯化钠溶液组成。关于供体参与者招募以及样本收集、处理、分析以及供体和受者样本表征方法的详细信息见附录（第3-4、8、20-21页）。在初次和第二次筛选中满足受者标准的参与者被纳入研究，并根据其月经周期获得个性化的访视时间表。每14天进行一次访视。在周期第8-12天之间，参与者接受VMT或安慰剂；在周期第22-26天之间，她们返回进行健康检查、自行拭子、尿检和通过一次性月经盘采集宫颈阴道分泌物样本。对于避孕药引起的闭经者，假设周期为28天进行安排。为了便于持续监测，每次访视前一天完成一份在线问卷，收集有关月经、分泌物、性活动、避孕套使用、药物和任何治疗不良事件的数据。总共，受者需要来诊所九次，这可能包括最多三次VMT，具体取决于转换为乳杆菌主导的微生物组的成功与否和时间。转换后，下次预定的VMT访视将改为一般检查访视。在第三个周期（即最后一次VMT）之后，受者在1个月和3个月后返回进行随访访视。关于受者研究访视的更多信息见附录（第8、20页）。转换定义为通过阴道样本的鸟枪法宏基因组测序评估，乳杆菌属总相对丰度至少70%，并且加德纳菌属、阴道范妮氏菌和普雷沃菌属的总比例低于10%。通过单核苷酸变异（SNV）分析评估供体植入。使用MetaSNV生成SNV图谱，并通过曼哈顿距离（两个样本在所有SNV上的差异总和）评估相似性（附录第5页）。作为对初始RCT方案的修正案（2021年12月6日批准），前24名有规律月经周期、通过筛选标准成为受者并加入RCT研究的参与者被要求参与经血和外周血的流式细胞术子研究。参与者在月经开始后的前48小时内收集其经血，用于流式细胞术免疫细胞分析（附录第5页）。有两个收集时间点：第一个时间点是第一次VMT前的最后一次月经，第二个时间点是对整个人群的第二次随访访视之后（附录第10、20页）。因此，我们比较了微生物组转换和未转换的参与者。我们进行了流式细胞术分析，以评估与VMT和微生物组转换相关的外周血和经血中的免疫细胞群体。关于细胞分离、程序以及分离的淋巴细胞分析（包括门控策略）的更多信息，见附录（第5-6、18页）。我们假设，阴道微生态失调相关细菌负荷的减少可能有助于供体微生物组的植入，因此我们决定修改试验方案，在难治性RCT队列参与者的开放标签扩展研究中评估额外VMT前使用抗菌预处理的效果。我们决定使用氯己定和西曲溴铵的抗菌组合，因为先前的研究表明其能有效减少细菌负荷。在三次周期内接受三次单剂量VMT或安慰剂后仍处于分子微生态失调状态的受者，在3个月随访时被邀请加入开放标签RCT扩展研究（2022年5月17日批准）。参与者按照预定义的轮换序列被系统分配至三个干预组之一（即准随机设计）：(1) 氯己定0.2%联合西曲溴铵0.1%预处理，盐水，然后VMT；(2) 盐水然后VMT；或(3) 氯己定0.2%联合西曲溴铵0.1%，盐水，无VMT。三个治疗组的程序描述见附录（第6页）。安排了两次访视：在周期第8-12天之间，参与者接受健康检查和生物样本库采样（附录第11、20页）；在周期第22-26天之间，他们接受健康检查、自行采集阴道拭子、尿液和宫颈阴道分泌物样本，进行妇科检查、超声检查以及感染检测（针对沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、阴道毛滴虫、生殖支原体、A、B、C和G组链球菌、HSV 1型和2型以及念珠菌属）。在每次随访访视时记录不良事件。为了确定从微生态失调向微生态正常转换的免疫学效应，我们使用nCounter Human Immunology V2 Panel（NanoString Technologies, Seattle, WA, USA）分析了两次访视的宫颈阴道分泌物。

结局

主要结局是在不使用抗生素预处理的情况下，经过最多三次（连续三个月经周期）VMT治疗后，转换为乳杆菌主导的微生物组。主要结局的时间范围为移植后最多6个月。次要结局是在一次VMT治疗后（移植后1周内）转换为乳杆菌主导的微生物组，以及在受者中识别供体微生物组（供体植入；附录第5页）。在一项修正案中，我们增加了与基线相比，VMT后外周血和经血# 阴道微生物群移植用于治疗阴道微生态失调（不使用抗生素）：一项针对阴道微生态失调女性的双盲、随机对照试验

方法（续）

次要结局是单次VMT治疗后（移植后1周内）转换为乳杆菌主导的微生物组，以及在受者中识别供体微生物组（供体植入；附录第5页）。在一项修正案中，我们增加了流式细胞术分析，比较VMT前后外周血和经血中T细胞和NK细胞的变化。针对难治性参与者的扩展研究评估了抗菌预处理后额外进行一次VMT后2周的转换率和供体植入测量。在该子研究中，还通过靶向转录组学分析了宫颈阴道分泌物，以评估与微生物组转换相关的局部免疫基因表达变化。关于差异表达分析和聚类分析（包括主成分分析）的详细信息，见附录（第6页）。仅记录被认为与试验产品或程序相关的不良事件。在试验开始前，我们定义了可能的与产品相关的不良事件为：整个6个月研究期间阴道症状恶化；随访期间从基线阴性血清学转为阳性（HIV、甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎、巨细胞病毒和C反应蛋白）；性传播感染（支原体、沙眼衣原体、阴道毛滴虫、淋病奈瑟菌、HSV 1型和2型以及HPV）；以及妊娠。这些事件被纳入考虑，是因为理论上存在通过供体宫颈阴道分泌物传播细菌、病毒或精细胞的风险，尽管进行了严格的供体筛选（附录第3、21页）。每次移植程序中使用的每个供体移植物的样本均被储存，以便在发生不良事件时进行回顾性检测。这种采样使我们能够评估任何治疗后感染是否可归因于VMT产品。在发生与产品相关的严重不良事件（例如，在参与者中检测到可追溯到VMT产品的性传播感染）时，制定了正式的停止程序。在一项事后分析中，我们估计了治疗效果，即乳杆菌属相对丰度的变化。此外，我们测试了基线测量值对主要结局的影响。我们基于宏基因组测序数据进行了微生物代谢途径的探索性功能分析（附录第5页）。

统计分析

样本量基于细菌性阴道病80%的缓解率。选择3:1随机化是为了平衡随机化设计，同时增加VMT治疗的数量。目标是I类错误（α）为0.05，II类错误（β）为0.10（检验效能90%），以检测治疗组之间的显著差异，我们需要总共48名参与者（活性治疗组36名受者，安慰剂组12名）。基于16-20%的丹麦育龄女性患有阴道微生态失调，筛选300-350名参与者将产生25名供者和48名受者。主要结局分析在意向治疗数据集中进行，包括所有随机分配的参与者，除非他们撤回同意。此外，对于主要结局分析，符合方案集分析仅包括严格遵守干预方案的参与者。使用Kaplan-Meier曲线比较VMT组和安慰剂组之间转换为乳杆菌主导状态的时间模式，并进行右删失以考虑失访。通过未调整的log-rank检验和Cox比例风险回归计算风险比（HR）和95% CI，评估整个研究期间两条曲线之间的差异。比例风险假设经过检验并成立。在一项事后分析中，我们使用多变量Cox回归来确定在治疗组之间调整不均的基线测量值是否会增加检测VMT治疗效果的效能。我们使用Wilcoxon符号秩检验在每个时间点进行了治疗效果的事后分析，定义为乳杆菌属的增加（附录第7页）。对于人口统计学数据，报告计数和百分比以及均值和标准差。我们使用配对t检验对中心对数比转换后的百分比进行估计，估计两组（VMT vs 安慰剂）的细胞群体差异，并调整是否转换为乳杆菌主导状态。我们使用Benjamini-Hochberg方法调整p值以进行多重比较。分别对有无转换调整的模型进行p值调整。主要淋巴细胞和T细胞亚群被分别调整，以考虑这些亚群的嵌套性质。我们使用Fisher精确检验来确定抗菌预处理子研究中三组之间的独立性。通过使用R中的logistf包（版本1.26.0）进行小样本分析的Firth逻辑回归，进行组间成对比较。我们使用R中的DESeq2包进行差异表达分析，比较VMT加抗菌组中访视2时转换和未转换的个体，并调整预处理表达值（附录第6页）。关于供体菌株植入分析和途径功能分析的信息，见附录（第5页）。缺失数据的处理取决于来源。对于主要分析，Cox回归将缺失的微生物组样本（例如，由于失访）作为右删失数据处理。对于难治性参与者的子研究，两名个体在随访时未获得转录组学数据，原因是样本缺失（随访时微生态失调）或样本中材料太少（随访时微生态正常）。问卷调查数据中的缺失信息未被插补，因为这些信息未包含在随机化或统计分析中。所有统计检验均作为双侧检验进行，显著性阈值设为<0.05。所有分析均在R（版本4.3.0）中进行。本研究未指派数据监测委员会。

资助方的作用

研究的资助方在研究设计、供体选择和数据分析方面进行了合作，但在数据收集、数据解释或报告撰写方面没有作用。数据解释和报告撰写由作者根据其贡献声明完成，其中包括一些身为资助方雇员的作者。

结果

在2021年6月1日至2022年6月2日期间，我们筛选了302名女性，其中49名（16%）符合作为受者参与研究的所有资格标准（图1）。49名参与者被随机分配接受VMT（n=37）或安慰剂（n=12）。一名参与者撤回同意，导致活性组有36名参与者，安慰剂组有12名参与者（图1）。两名参与者（每组一名）在基线时即干预前就显示出乳杆菌主导的微生物组，因此被排除在符合方案集分析之外。受者的基线特征见表1。所有访视的微生物组组成见图2A。VMT组和安慰剂组阴道微生物组的多样性在基线时没有显著差异。最丰富的分类单元是加德纳菌属，安慰剂组12名受者中有9名（75%），VMT组36名受者中有28名（78%）（图2B）。对于主要结局，我们发现在接受VMT和安慰剂的参与者之间没有显著差异，HR为0.65（95% CI 0.20–2.16，p=0.49；图3A；附录第23页）。符合方案集分析显示类似结果，组间无显著差异（附录第12页）。首次VMT后，VMT组36名参与者中有1名（3%），安慰剂组12名参与者中有2名（17%）显示出向乳杆菌主导的转换。在3个月随访时（首次给药后6个月），VMT组35名受者中有4名（11%）（一名参与者失访），安慰剂组12名受者中有3名（25%）显示出转换，每个给药周期后的转换率相似。未报告严重不良事件，不良事件发生在VMT组15名（42%）参与者和安慰剂组5名（42%）参与者中，均未导致研究提前终止（表2）。一名参与者在研究期间怀孕并随后退出（图1；失访）。该妊娠与治疗无关，因为VMT产品不含任何精子（显微镜检查），且参与者知晓怀孕的时间和方式。另一名参与者被诊断出HPV，这在基线时未被检测到。该HPV株在受者使用的VMT中未被识别，因此也被认为与产品无关（附录第22页）。未观察到可归因于VMT程序的感染（附录第22页）。基线时，所有临床化学和血液学变量均在正常范围内，且两组在最后一次随访时未观察到显著差异（数据未显示）。我们进行了SNV分析，以评估转换是由于供体植入还是自发转换。在VMT组中转换的四人中，有两人被识别出供体植入，并且两人均保持了稳定的乳杆菌主导状态长达199天（图3B、C）。在流式细胞术子研究中，我们未发现外周血和经血中免疫细胞群体的显著差异，无论是与VMT、转换为乳杆菌主导状态还是植入相关（附录第13–14、25–26页）。27名难治性受者进入了开放标签扩展研究（附录第11页）。10名接受了抗菌（氯己定0.2%联合西曲溴铵0.1%）加VMT，其中5名（50%）在2周后转换为乳杆菌主导的微生物组。接受盐水加VMT的10名或接受抗菌剂而不加VMT的7名均未转换。因此，抗菌预处理加VMT产生了显著更高的转换率（OR 21.0，95% CI 1.8–2956.0，p=0.011；附录第24页）。对5名转换者的SNV分析显示，其中3名存在供体植入（图4A）；一名没有足够的读数，一名转换时没有植入。在RCT和扩展研究中，有供体菌株植入的参与者显示出比没有植入而转换的参与者更高的VMT后卷曲乳杆菌丰度，表明向乳杆菌主导的转变更强。在确认植入的参与者中（n=5），VMT后卷曲乳杆菌相对丰度为71–100%（平均值90%），而在没有植入的转换者中则为0–100%（n=3；平均值32%；调整后p=0.086）。由于样本材料不足，无法确定另外一名参与者的植入状态（附录第15页）。使用MetaCyc途径对宏基因组进行功能分析显示，在转换前样本中，与自发转换的样本相比，供体菌株植入的微生物组中，三种戊糖磷酸途径和一种糖酵解途径的丰度较低（附录第5、15页）。这些途径与特定的细菌物种无关。在扩展研究中，使用NanoString转录组学分析宫颈阴道分泌物，我们发现在成功转换（抗菌加VMT后）的参与者与未转换的参与者之间，649个基因中有130个存在差异表达（图4B；完整数据集见附录第27–35页）。这些发现表明，VMT后参与免疫应答的基因表达谱发生了变化，涉及凋亡过程（CASP-10）、炎症反应（IL-32和CXCL2）和细胞毒性T细胞活性（CD8b）的基因表达降低。VMT后，几个关键基因上调，包括IL-18（免疫应答调节）和LGALS3（细胞粘附和细胞间相互作用调节）。VMT前后表达比率的主成分分析显示，两组在PC1和PC2上存在明显聚类（附录第16页），在四名微生物组转换者中的三名中观察到（附录第17页）。看家基因表达在乳杆菌主导的样本（转换后）中通常高于预处理样本。我们测试了基线症状、HPV感染或异性关系状态是否影响VMT效应估计。异性关系状态影响最大，但并未改变基础模型的结论（附录第36页）。为了比较VMT的成功率与Bosma及其同事进行的平行试验的结果，我们按照他们分析中使用的方法，对乳杆菌丰度的变化进行了事后计算。与我们最初的发现一致，VMT组和安慰剂组之间未观察到统计学显著差异（附录第37页）。

讨论

基于关于VMT的开创性里程碑研究，我们的研究，连同另一项平行试验，是首批在未接受抗生素治疗的分子阴道微生态失调女性中评估VMT的随机对照试验。该随机对照试验招募了有症状和无症状的参与者，涉及超过900次临床访视。VMT以每个周期单次剂量给药，最多三个周期，对转换没有总体效果；然而，两名参与者发生了供体菌株植入，并持续了长达199天。在一项针对难治性参与者的开放标签扩展研究中，抗菌预处理加VMT（10名参与者中有5名）增加了转换，并增加了植入（5名参与者中有3名），而盐水加VMT或单独使用抗菌剂则无此效果，使研究总共达到5例植入。抗菌预处理后更高的转换率和植入率可能反映了细菌负荷的减少和阴道生物膜的破坏，特别是由阴道加德纳菌形成的生物膜，这与微生态失调的持续存在和治疗耐药性有关。氯己定和西曲溴铵可能通过破坏此类生物膜促进了植入，尽管这一点尚未得到证实，因为未进行生物膜特异性测定。这些结果表明，VMT可能有助于解决某些受者中的分子微生态失调，但适度的结局和小样本量需要确认性研究。观察到的持久供体菌株植入支持这些是真实的治疗诱导的变化，而非自发转换。基于已报告的病例系列，这项随机对照试验和并行试验为VMT在不同条件和成功定义下的应用提供了关键见解。我们的事后分析表明，症状不影响反应，尽管研究并非为此目的而设计，表明治疗有症状患者可能带来额外挑战。本试验和并行研究中的VMT产品在组成和稳定性方面相似（附录第9页），但剂量方案不同。Bosma及其同事的研究仍处于初步阶段，以预印本形式提供，成功定义不同，基于阴道乳杆菌的总体增加，而我们的试验要求乳杆菌大于70%且加德纳菌属、阴道范妮氏菌和普雷沃菌属的总和小于10%。根据我们更严格的标准，两项研究均未达到统计学显著性，尽管并行试验报告了20名受者中有9名（45%）乳杆菌显著增加并存在供体植入。这些差异表明，剂量方案和基线微生物组可能影响结局，并应为未来试验设计提供信息。我们未发现明确的超级供体效应，但植入似乎由供体和受者微生物组之间的相互作用决定。在难治性参与者中，在随机对照试验中不成功的VMT在抗菌预处理后取得了成功，表明预处理可以促进植入。此前，我们报告了一例有症状性微生态失调和复发性流产的女性，在无预处理的情况下，VMT后供体植入持续了430天。在那项研究中，我们使用了基于平板扩散试验抑制微生态失调相关细菌的供体选择方法，此处未使用，但可能提高成功率。VMT成功的机制仍不清楚。其他因素，如受者阴道内驻留细菌以及宫颈阴道分泌物的其他成分（如糖原和乳酸），可能影响植入。因此，我们研究了表现出供体菌株植入的受者与未植入而转换的受者之间的模式，以及特定供体VMT的疗效。有供体菌株植入的受者（n=5）治疗后卷曲乳杆菌水平显著更高，表明向乳杆菌主导的微生物组的转变更强。植入前的功能分析揭示了与能量代谢相关的不同基因差异，特别是戊糖磷酸途径和糖酵解。这些途径对微生物能量代谢至关重要，可能表明影响植入的微生物组功能差异。与特定细菌分类群缺乏直接关联，突显了微生物组的功能特征而非其分类组成在决定植入成功中的重要性。在分子微生态失调缓解后观察到的基因表达变化，包括IL-18和LGALS3的上调以及CASP-10、IL-32、CXCL2和CD8b的下调，表明VMT增强了免疫监视并减少了炎症。然而，由于样本量小，这些发现应谨慎解读。相比之下，对经血和外周血的流式细胞术分析未显示全身性或局部免疫细胞变化，表明仅有微妙或局部效应。总之，这些发现突显了VMT免疫应答的复杂性。未来的多组学研究整合流式细胞术、转录组学和微生物组分析，并在更大队列中进行，对于解决这些差异以及更精确地将微生物功能变化与宿主免疫应答联系起来至关重要。尽管这项研究标志着探索VMT作为分子微生态失调治疗的重要进展，但也指出了需要优化疗效的领域。尽管这是迄今为止规模最大的VMT研究，但针对难治性参与者进行抗菌预处理的流式细胞术和扩展研究统计效能较低，如事后分析中宽泛的置信区间所示。我们的效能计算需要48名参与者，这已包含在意向治疗分析中，但符合方案集分析中仅包含46名。尽管这一微小偏差不太可能改变结果，但它略微降低了统计效能，应被视为一个局限性。需要更大的样本量才能就供体菌株植入与非供体菌株植入及其相关特征的事后比较得出可靠结论。从这些初步随机对照试验中获得的见解表明，未来的VMT研究可以探索几种策略来优化结局，重点是增强植入、改进预处理方案和细化结局测量。尽管供体是根据高总乳杆菌属丰度和低微生态失调相关分类群的存在来选择的，但惰性乳杆菌的主导地位——一种现在被认为是过渡性或稳定性较差微生物组的特征的物种——可能影响植入的持久性，因为最近的研究表明，惰性乳杆菌主导的群落比卷曲乳杆菌主导的微生物组更不可能支持稳定的定植。此外，每个周期连续三次给药，如Bosma及其同事的平行研究中所用，可能比本试验中测试的三个连续周期中每个周期一次给药更有效。此外，植入可能是首选的主要结局而非转换，因为自发转换率高，并且VMT试验中通过SNV分析直接评估植入具有独特优势。一个局限性是未具体记录种族背景。尽管我们收集了参与者出生地的信息，但这并未完全涵盖可能影响阴道微生物组的种族背景或文化因素。未来的研究应包括种族和相关的社会人口学变量的标准化测量，以评估它们对微生物组成和治疗反应的潜在影响。总的来说，在丹麦进行试验，考虑到其特定的人口统计学特征，限制了对其他微生态失调患病率更高的群体的普遍性。尽管主要结局不显著，但本研究为VMT的潜力提供了基本见解，并为支持未来大规模干预研究奠定了必要的方法基础，以治疗分子微生态失调。

作者贡献

HSN、TW、BM、LME、JETvHV、KV和NlCF设计了研究。EFB、BM、TW、AMH、KDW、EVE和KV负责供体的参与者招募、临床操作和采样。TW、AMH、KDW、EVE和KV负责受者的参与者招募、临床操作和采样。TW、KV和HSN撰写了初稿。JEH、SM、ATL、DW、KD、HW、AMP和LWH进行了阴道微生物组分析和生物信息学分析。所有作者均对研究All authors made substantial contributions to the study set-up, data interpretation, and manuscript revision. All authors had full access to all the data in the study and accept responsibility for the decision to submit for publication. TW, HSN, and ATL verified the underlying data for the study.

数据共享

本研究报告所述发现所依据的去标识化参与者数据（包括数据字典）已进行假名化处理，由丹麦首都大区（欧盟）拥有和控制。通用数据保护条例法律适用于这些数据的处理与共享。其他相关文件（研究方案和统计分析计划）将根据合理请求提供。数据自发表之日起可用，无截止日期。可向通讯作者请求获取数据，但需要提交数据访问提案，获得丹麦首都大区的批准，并与丹麦首都大区签署数据处理协议。访问期限取决于数据共享协议。元数据和统计分析日志可供审稿人查阅。

利益冲突声明

EFB、BM、KD和JETvHV是Freya Biosciences的员工，并持有该公司员工认股权证。JETvHV、LME和ABT是Freya Biosciences的联合创始人兼股东。Freya Biosciences已提交多项与阴道微生物群移植相关的专利申请。LME是微生物移植领域多项专利和专利申请的共同发明人。LME的安排已由约翰霍普金斯大学根据其利益冲突政策进行审查和批准。ATL报告从丹麦独立研究基金获得研究资助（博士后基金，支付给机构）；从Carl og Ellen Hertz's Legat til Dansk Læge- og Naturvidenskab（支付给机构）、Etly og Jørgen Stjerngreens Fond（私人支付）、Torben og Alice Frimodts Fond（私人支付）、Knud Højgaards Fond（私人支付）、Christian og Ottilia Brorsons Rejselegat for yngre videnskabsmænd og kvinder（私人支付）和Fonden til Lægevidenskabens Fremme（支付给机构）获得差旅补助。KV从默克、Gedeon Richter和Ibsa获得演讲费。NlCF从Gedeon Richter、默克和Cryos获得用于不相关研究活动的机构付款；从默克获得参加一次会议的个人付款，以及从默克（2024年12月）和Ferring（2025年6月）获得在生育专家会议上介绍其自身研究成果的演讲费；从默克、Ferring、IBSA和Gedeon Richter获得机构差旅支持；并担任丹麦生育学会指南小组指导委员会主席（无报酬）。HSN从Freya Biosciences、Ferring Pharmaceuticals、BioInnovation Institute、教育部、诺和诺德基金会、Augustinus Fonden、Oda og Hans Svenningsens Fond、Demant Fonden、Ole Kirks Fond和丹麦独立研究基金获得机构研究资助；从Ferring Pharmaceuticals、默克、阿斯利康、Cook Medical、Gedeon Richter、IBSA Nordic和诺和诺德获得演讲费，用于介绍其自身研究成果；是Maternity Foundation（非营利组织）的创始人和主席，以及Lulu Health的联合创始人。ABT是Freya Biosciences的联合创始人，目前是辉瑞的全职员工，担任首席医学官和医学事务集群负责人；通过员工激励计划持有辉瑞和诺和诺德的股票；担任丹麦妇女健康出版业的非报酬顾问委员会成员以及丹麦生命科学女性组织的非报酬董事会成员。所有其他作者声明无利益冲突。