摘要
颅内神经毒性碎片清除受损会加剧神经系统疾病，是颇具前景的治疗靶点。药物疗法在临床前模型中可增强脑膜淋巴清除，但可能受限于系统毒性或侵入性给药方式。本研究报道了一种低强度聚焦超声方案，可非侵入性地清除小鼠脑脊液和脑间质中的致病物质。在两种出血性脑卒中模型中，我们证明该方案清除了脑脊液和间质中的血细胞，这些血细胞通过脑膜淋巴管积聚在深部颈淋巴结中。该方案直接调节分子过程，包括机械敏感通道，改变小胶质细胞表型和星形胶质细胞水通道蛋白定位，以减少神经炎症和神经毒性。在脑内出血模型中，它改善了行为预后并提高了生存率，效果优于药物治疗基准。该方案符合美国食品药品监督管理局(FDA)的安全指南，支持临床转化性。若临床证明有效，该技术不仅可能对出血性脑卒中有治疗益处，还可能对其他涉及碎片清除障碍的神经系统疾病有益。
正文
脑脊液(CSF)循环障碍已被关联到各种神经系统疾病的病理发生中。特别是，脑脊液和间质液中分散碎片的清除受损会促进神经炎症和神经毒性，导致缺血性脑卒中、出血性脑卒中、创伤性脑损伤、神经退行性疾病和其他神经系统疾病的病理和症状严重程度加重。药物上调脑膜淋巴管以增强神经毒性碎片清除在临床前模型中已显示出治疗潜力。然而，尽管临床前数据令人鼓舞，目前尚无获批的药物疗法能直接增强颅内液体清除。对实验性候选药物的担忧涉及脱靶效应、系统毒性、治疗效果的长期延迟以及侵入性给药方案的有限转化可行性。同时，手术方法，如蛛网膜下腔出血(SAH)中的直接脑脊液引流和脑内出血(ICH)中的血肿清除，可提供临床益处，但仅适用于最严重受影响的个体，且具有侵入性，不能直接纠正潜在的分子和细胞病理生理学。
聚焦超声(FUS)已被证明可增强或抑制脑中的神经炎症谱，结果在很大程度上取决于声波参数，并进一步受外源性试剂(如微泡)共同给药的影响。低强度FUS与微泡配对可能破坏血脑屏障，在临床前模型中可清除阿尔茨海默病相关斑块，但也产生无菌性神经炎症效应，并引发安全担忧，因为存在微泡惯性空化风险以及在微泡快速清除(半衰期为几分钟)时协调声波的实际问题。最近，一种无需微泡的FUS方案在相同的阿尔茨海默病模型中重现了类似的行为效果，但未显示斑块和神经毒性物质的清除，且所需的超声频率对经颅传输提出了临床挑战。
低强度FUS已知可在体外和动物体内激活机械敏感离子通道，如Piezo1。此外，动物研究中的机械敏感通道药理学激动剂在神经系统治疗开发方面显示出前景，因为它们可以抑制神经炎症状态并增强糖淋巴介质，包括脑膜淋巴管新生。然而，在许多情况下，这些药物必须通过侵入性方式给药，如脑室内或小脑延髓池内给药，或需持续数周，使得实际转化面临挑战。它们也可能带来系统毒性风险。目前尚无此类药物获准用于人体。这些发现表明，如果能够定制超声方案以激活机械敏感离子通道，它们可能促进类似的神经炎症和糖淋巴循环有益效果，同时避免侵入性给药和系统毒性风险。
我们和其他人先前已证明，单独使用低强度FUS(无需外源性试剂共同给药)可增强脑脊液循环。超声改善了鞘内给药药物在大脑中的分布，并促进了小脑延髓池和脑实质内给药示踪剂的循环。尽管这些研究未在神经系统疾病模型中确立治疗效果，但它们表明低强度FUS有潜力从中枢神经系统清除致病物质并实现相应治疗效果。
在本研究中，我们开发并严格验证了一种低强度经颅FUS方案，旨在专门增强出血性脑损伤的神经毒性碎片清除。我们在两种小鼠出血性脑损伤模型(SAH和ICH)中评估了该方案的安全性和有效性。我们检查了从脑脊液和间质隔室清除微米级出血碎片、神经炎症和神经毒性的变化以及清除效果的潜在细胞和分子机制。结果显示，超声治疗增强了神经毒性碎片清除，减少了神经炎症和神经毒性，改善了功能性行为预后并提高了生存率，其安全性和有效性优于药物治疗基准。在分子水平上，我们记录了对机械敏感离子通道激活的依赖性，超声诱导小胶质细胞向稳态表型转变，星形胶质细胞血管足突中水通道蛋白的极化增加。若在临床试验中得到验证，该方法将提供一种临床可行、非药物、非侵入性的卒中治疗策略，并可能适用于其他涉及神经毒性碎片清除障碍的神经系统疾病。
结果
超声碎片清除增强颅内出血清除
为评估低强度经颅FUS在卒中模型中清除脑脊液和脑间质隔室中神经毒性碎片的效用，我们首先将先前用于大鼠的方案适配到小鼠，因为已为小鼠开发了多种疾病模型。尽管我们先前的方案有效，但其650 kHz的超声中心频率在向较大动物和人类转化时存在挑战，因为与200-250 kHz等较低频率相比，颅骨对其吸收更为显著(因此存在不安全加热风险)，且颅骨和人类头发对超声的畸变效应更大。我们首先确认，当中心频率降低到250 kHz时，先前发现的脑脊液-间质液混合增加效果无明显降低。其次，由于在此f = 1.0聚焦换能器下250 kHz的超声焦点将一次性影响大部分小鼠大脑，为防止应用过程中的热量积累，我们使用了占空比(25%)的脉冲方案，我们估计这不会导致实质加热，基于生物热方程和模拟及实验验证，同时保持了我们在先前方案中使用的脑部应用点的超声占空比一致性。最后，我们完成了应用超声压力的参数变化，以获得用于小鼠的目标超声方案。这些结果显示超声增加了脑实质对脑脊液分散示踪剂的进入，证实了我们先前发现的低强度FUS增加了脑脊液和间质液交换。
我们随后将这种超声碎片清除(UDC)方案应用于两种出血性脑损伤模型，其中出血产物的清除受损被认为是致病的：SAH和ICH(也称为脑实质内出血)。此外，这些模型中的微米级出血碎片为清除提供了雄心勃勃的目标，如果成功，将表明清除各种神经毒性碎片的潜力。在小鼠SAH模型中，UDC治疗减少了与假手术治疗相比在脑脊液中检测到的红细胞数量(SAH + 假手术：338.33 ± 65.55；SAH + UDC：140 ± 44.27，P ≤ 0.01；健康对照中未见血管外红细胞)。这种减少与深部颈淋巴结中红细胞积累增加相关，表明通过脑膜淋巴系统有效清除(SAH + 假手术：12 ± 4.47；SAH + UDC：24.83 ± 6.85，P ≤ 0.01；健康对照中未见血管外红细胞)。同样，在ICH模型中，UDC治疗减少了间质红细胞数量(ICH + 假手术：26.17 ± 7.47；ICH + UDC：11.67 ± 5.32，P ≤ 0.01；健康对照中未见血管外红细胞)。这种清除再次伴随着深部颈淋巴结中红细胞积累增加(ICH + 假手术：7.67 ± 4.37；ICH + UDC：14.5 ± 4.32，P ≤ 0.05；健康对照中未见血管外红细胞)。这些发现表明，UDC促进了微米级出血碎片从脑脊液和间质隔室到深部颈淋巴结的清除，可能通过脑膜淋巴管、蛛网膜袖套出口点或动静脉软脑膜重叠实现，这些被认为是脑脊液和间质液分散溶质的主要排出路径。
UDC减少出血后神经炎症和神经毒性
神经炎症和神经毒性是导致出血性脑损伤后不良预后的关键因素。为评估UDC对这些过程的影响，我们对UDC治疗的SAH和ICH模型脑组织进行了免疫组织化学分析。UDC治疗降低了IBA1+细胞(一种常用于标记小胶质细胞的标志物，包括静止和激活状态)的平均荧光强度，表明在两种模型中都减弱了小胶质细胞反应(健康对照：18.5 ± 3.73；SAH + 假手术：35 ± 8.27；SAH + UDC：24 ± 7.62；ICH + 假手术：44.7 ± 8.09；ICH + UDC：30.5 ± 7.64，P ≤ 0.05)。此外，通过胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色评估的星形胶质细胞激活(星形胶质细胞表达的中间丝蛋白，在反应性/激活星形胶质细胞中强烈上调)在两种模型的UDC治疗动物中也减少(健康对照：21.7 ± 3.85；SAH + 假手术：43.33 ± 11.52；SAH + UDC：24 ± 10.77；ICH + 假手术：46 ± 8.39；ICH + UDC：33.17 ± 9.06，P ≤ 0.05)。这些结果表明UDC有效减弱了出血性脑损伤后的神经炎症反应。此外，使用Fluoro-Jade C染色(一种选择性标记退化神经元的荧光染料，无论细胞死亡机制如何)对神经元变性的组织学评估显示，与假手术相比，UDC治疗动物中退化神经元数量减少(健康对照：2.0 ± 1.63；SAH + 假手术：38.5 ± 9.54；SAH + UDC：22.5 ± 7.40；ICH + 假手术：35.5 ± 12.24；ICH + UDC：17 ± 5.14，P ≤ 0.01)。这种神经毒性的减少表明非侵入性早期血液清除在减少神经元损伤方面的保护作用。
UDC治疗改善行为预后和生存率
接下来，我们评估了功能恢复和生存率作为UDC有效性的指标。我们的初步研究表明SAH模型未产生持续的行为缺陷。因此，我们使用ICH模型进行行为、发病率和死亡率结果分析。UDC治疗改善了在出血后6天即可观察到的测试行为和功能结果(转角测试和握力)，并通过14天持续改善(从ICH后到第14天：转角测试中左肢使用百分比：健康对照基线：50.7 ± 5.33；ICH + 假手术：26.89 ± 6.83；ICH + UDC：39.13 ± 7.09；握力测试中每克力：健康对照基线：89.8 ± 7.91；ICH + 假手术：61.67 ± 10.27；ICH + UDC：77 ± 11.51，P ≤ 0.01 与假手术相比)。
发病率结果，包括体重和脑含水量(水肿指标)，也进行了评估。UDC治疗小鼠表现出较低的脑水肿，并且比假手术对照更快恢复体重(脑水肿，作为脑含水百分比：健康对照基线：72.6 ± 3.40；ICH + 假手术：81.17 ± 2.40；ICH + UDC：76.17 ± 3.37；第14天体重(克)：健康对照基线：32.4 ± 3.10；ICH + 假手术：26.33 ± 3.91；ICH + UDC：31.07 ± 2.54，P ≤ 0.05)。值得注意的是，UDC治疗提高了与假手术相比的生存率(14天时83.3% 对 50%，P < 0.05)。假手术组和UDC组之间这些不同的生存率支持了积极的行为效果，尽管存在幸存者偏差，这些数据中仍观察到行为效应。
为提供基准比较，我们使用先前诱导脑脊液清除的方案测试了一种机械敏感通道的药理学激动剂(Yoda-1)。在ICH模型中，这些方案被证明是有害的，与假手术相比，治疗小鼠的生存率降低。存活到终点的小鼠未显示血肿体积减少，表明与UDC相比清除效果降低。因此，在此环境中UDC比药物治疗基准更安全、更有效。
UDC诱导稳态神经免疫变化和细胞糖淋巴过程
为调查UDC诱导的潜在细胞和分子效应，我们将空间转录组分析应用于健康对照和假手术或UDC治疗的ICH模型小鼠脑组织。与先前文献和我们对激活小胶质细胞和星形胶质细胞状态的评估一致，ICH模型诱导了明显的神经炎症和小胶质细胞激活。在ICH模型中，与假手术相比，UDC降低了炎症和小胶质细胞评分，特别是在血肿周围区域，疾病相关和稳态小胶质细胞状态的转录变化幅度相似。研究特定因素，我们观察到ICH模型中Aqp4、Gfap、Cd68、Aif1(IBA1)、Lgals3、P2ry6和P2ry14的显著转录上调，特别是在血肿周围区域。UDC治疗ICH模型后，神经炎症基因Cd68和Lgals3在血肿周围区域表现出相对下调，与我们先前关于UDC减少小胶质细胞激活的分析一致。相比之下，稳态小胶质细胞标志物P2yr12在UDC治疗ICH时表现出表达增加的趋势。对于Aqp4，尽管转录水平在ICH模型中未受UDC改变，但我们注意到AQP4在胶血管界面的星形胶质细胞足突中强烈表达，其蛋白定位或极化的变化可能独立于转录变化发生。在转录水平上，ICH模型中UDC对Aqp4或Gfap没有明确变化，可能与观察到的GFAP蛋白表达变化(图2c,g)形成对比。UDC在健康对照动物中未显示出这些选择标志物的明确变化。血肿周围基因表达的最大激活在ICH和对照之间观察到(ICH中1,777个基因上调，19个基因下调)。UDC将ICH血肿周围基因表达恢复至基线，ICH + UDC与ICH相比有大量基因下调(ICH + UDC中486个基因下调)，ICH + UDC与健康对照动物之间仅有轻微基因表达差异(ICH + UDC中466个基因上调，14个基因下调)。此外，UDC在对照动物中仅诱导有限的基因表达变化(对照 + UDC与对照相比324个上调，21个下调)，支持其效果特定于损伤相关通路的解释。综合这些数据表明，UDC可校正ICH相关基因网络，而在对照条件下不会产生实质性或令人担忧的脱靶基因激活。
为确定这些转录变化是否反映在蛋白水平上，我们在有无UDC治疗的ICH模型中研究了免疫组织化学面板。首先，鉴于我们发现UDC治疗出血性脑损伤减少了GFAP蛋白(图2c,g)，但未减少GfapmRNA(图4c)表达，我们通过免疫组织化学评估了独立星形胶质细胞标志物S100β的表达，结果显示UDC后无差异。这表明UDC不会减少星形胶质细胞数量，UDC后GFAP蛋白表达的减少可能反映GfapmRNA和GFAP蛋白之间的生物差异或每个星形胶质细胞激活状态的降低。其次，根据空间转录组学数据表明小胶质细胞状态的变化，我们评估了文献中确定的不同小胶质细胞状态标志物，包括疾病相关小胶质细胞和稳态小胶质细胞。小胶质细胞分支复杂性是小胶质细胞状态的标志，高分支复杂性与稳态状态相关。UDC增加了小胶质细胞分支复杂性(ICH + 假手术：3.68 ± 0.28；ICH + UDC：5.23 ± 0.77，P ≤ 0.05)。与这一结果和空间转录组学分析一致，CD68和GAL-3(小胶质细胞激活标志物)在UDC下均减少(CD68：健康对照：0.0 ± 0；ICH + 假手术：401.5 ± 200.17；ICH + UDC：45.63 ± 29.49；GAL-3：健康对照：0.0 ± 0；ICH + 假手术：727.5 ± 66.75；ICH + UDC：257 ± 131.97，P ≤ 0.05)。同样，P2RY12(稳态小胶质细胞的细胞表面标志物，对清除细胞碎片必不可少)在UDC下增加(健康对照：25.5 ± 0.32；ICH + 假手术：12.05 ± 3.84；ICH + UDC：21.18 ± 0.95，P ≤ 0.05)。此外，我们观察到血肿周围区域红细胞标志物(TER-119+)与小胶质细胞(IBA1+)共定位显著增加，表明UDC治疗ICH时小胶质细胞对红细胞的吞噬作用增强(吞噬细胞数量：ICH：1.5 ± 0.58；ICH + UDC：9.75 ± 2.5，P ≤ 0.05)。最后，与ICH中Aqp4的整体转录上调相反(图4c)，我们观察到ICH后星形胶质细胞足突血管周围极化AQP4有非统计学显著趋势降低。糖淋巴上调的关键要求AQP4足突血管周围极化在UDC治疗的ICH模型中得到恢复(健康对照：37.15 ± 3.04；ICH + 假手术：21.03 ± 7.53；ICH + UDC：50.8 ± 11.80，P ≤ 0.05)。综合考虑转录组学和免疫组织化学数据，我们得出结论：UDC通过将小胶质细胞转变为稳态表型来减少神经炎症，并通过增加星形胶质细胞足突中AQP4的血管周围极化来上调糖淋巴功能。
超声介导的碎片清除通过分子机械转导通路发挥作用
为进一步调查超声介导清除的潜在机制，我们考虑了可能的热效应。在本研究使用的强度、占空比和超声频率下，计算模拟(通过k-Wave)表明无实质性实质加热，热量积累最小且优先在颅骨而非实质中。我们通过将热电偶放置在颅内(紧贴颅骨下方)并在方案应用前后测量脑温来实验确认。我们注意到实验过程中有冷却趋势，可能是由于与背侧头皮接触的室温凝胶和水通过热传导导致(颅内温度峰值变化：-0.5 ± 0.2 °C)。
鉴于此结果，我们考虑了可能的机械机制，如直接诱导颅内流体介质的对流或振荡，促进脑脊液和间质液交换(如扩展数据图1所示)，无论是否伴有促进下游脑脊液循环的实质机械变化。然而，我们先前的结果表明UDC的反应在超声暴露后持续超过1小时，暗示了更持久的机制。因为我们的方案超声强度足以激活机械敏感通道，可诱导脑膜淋巴管新生和增加脑脊液排出，我们调查了UDC对颅内机械敏感通道的影响。使用ICH模型，我们在小脑延髓池内给药广谱机械敏感离子通道阻断剂(GsMTx4，Piezo和TRP家族通道的选择性阻断剂)，并观察到UDC的血细胞清除效果被消除，ICH + UDC + GsMTx4治疗组与UDC单独治疗相比血肿体积增加(ICH + UDC：11.63 ± 4.59；ICH + UDC + GsMTx4：23.63 ± 5.50)，而假手术 + GsMTx4和UDC + GsMTx4组之间无差异。GsMTx4阻断后可检测清除的消除表明机械敏感离子通道主要介导UDC的清除效果。我们观察到ICH模型或UDC治疗后脑膜淋巴管覆盖率或口径无变化，可能反映了该疾病模型和干预的短期(数天)时间线。相比之下，我们观察到当仅应用于健康对照大脑时，UDC急性增加了P2RY12+小胶质细胞(稳态状态标志物)，支持机械敏感通道在UDC功效中的作用。值得注意的是，UDC仅一次应用于健康对照大脑后AQP4表达未变化，表明UDC间接作用于驱动ICH中观察到的糖淋巴增强。相反，UDC治疗ICH时AQP4极化可能通过UDC驱动的神经炎症更直接减少而继发诱导，伴随着AQP4极化的次级解抑制，表明UDC的直接免疫调节作用与其对AQP4极化的相对间接糖淋巴作用之间的区别。
讨论
我们已证明UDC方案促进了小鼠脑中细胞碎片的清除，减少了出血性脑损伤后的神经炎症和神经毒性，并改善了功能预后和生存率(图1-3)。UDC比该适应症的药物治疗基准更安全、更有效(扩展数据图3)。我们的机制研究表明(扩展数据图4)，UDC的清除效果主要依赖于机械敏感通道的激活(图6a,b)和增加颅内流体隔室混合(扩展数据图1)。机械敏感通道的激活将小胶质细胞表型转变为稳态状态(图5c-e和6d)，促进脑脊液和间质隔室中的碎片清除(图1、图5f和补充视频1)。这种转变的神经炎症环境通过在出血后AQP4表达增加的情况下解抑制极化，促进星形胶质细胞足突血管周围极化(图5g)。我们的数据表明一个模型(扩展数据图4)，其中神经炎症减少、流体隔室混合增加和糖淋巴介质增加(如水通道蛋白星形胶质细胞足突血管周围极化)结合，将碎片从中枢神经系统清除到身体的淋巴系统(图1)，从而降低出血性卒中模型的发病率和死亡率(图2和3)。
应强调的是，该模型仍为假设性，未来研究中需要进一步调查和验证几个方面。例如，阻断UDC功效的机械敏感通道拮抗剂GsMTx4在脂质双层水平限制机械转导，因此拮抗机械敏感通道的广泛一般类别，包括大多数(如果不是全部)Piezo和TRP家族，使不清楚哪些特定通道(Piezo1、Piezo2、TRPA1、TRPC6等)对UDC功效贡献最大。还值得注意的是，我们未观察到UDC对淋巴管覆盖率或形态的变化(图6c)，尽管机械敏感通道激活可以在无淋巴管形态变化的情况下刺激淋巴流动。此外，由于面部和颈部的机械刺激可增加中枢神经系统的淋巴引流，而UDC是一种形式的机械刺激，该机制可能部分贡献于UDC功效。
我们设计UDC方案以与临床转化兼容。我们使用的250 kHz超声频率处于全球市场上商用临床经颅FUS系统的范围内，用于多种神经系统疾病的脑刺激。该超声频率通过人类头皮和颅骨的衰减和畸变相对较低。此外，我们使用的原位峰值负压力目标对应于机械指数(表示超声诱导机械损伤风险的指标)为0.9，完全在FDA安全应用指南范围内，类似于最近超声神经调节研究。这表明UDC的临床试验应获得当地机构审查委员会的非显著风险指定。
如果UDC的碎片清除在临床试验中得到验证，它将不会产生侵入性手术方法的风险或药物治疗的系统毒性，并且不需要共同给药外源性试剂如纳米颗粒或微泡，简化临床应用并增加其安全操作范围。由于其机制不需要特定的脑活动模式(即在麻醉动物中有效)，它将适用于处于各种认知状态的人类，包括清醒、睡眠、执行任务或意识模糊，在受伤后即刻恢复期。此外，它将提供一种驱动脑脊液循环和排出的方法，与药理学方法和激活与这种循环相关的特定神经活动模式的方法互补。因此，它将提供一种替代方法，用于理解并在已暗示其作用的各种疾病和正常状态中进行干预，包括睡眠、神经退行性疾病、创伤性脑损伤和心理健康状况。
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