摘要
背景 发酵食品是通过肠-脑轴影响大脑功能和心理健康的有前景但尚未充分探索的干预手段。
目的 本研究旨在评估用益生菌细菌发酵的乳制品对大脑结构和功能各方面的影响。
设计 在一项三盲、随机、安慰剂对照试验中，40名18-55岁的健康女性被随机分配，每天食用130克发酵益生菌酸奶或安慰剂，持续8周。主要结局是通过磁共振波谱测量的左海马代谢物从基线到第8周的组间差异变化。次要结局包括大脑结构和功能的变化、粪便微生物组组成和功能潜力、心理健康、胃肠道症状、记忆以及血液氧化应激和炎症标志物。
结果 海马谷胱甘肽浓度的平均变化存在组间差异（变化的平均差异：-0.49；95% CI -0.95至-0.04），以及海马和伏隔核的脑容量，尽管这些结果未经过多重比较校正。左海马与左额极之间的平均功能连接变化存在组间差异。肠道微生物组β多样性也存在显著的组间变化。其他次要指标无差异。
结论 本研究提供了初步证据，表明益生菌发酵乳制品可以调节与海马相关的结局。
试验注册号 ACTRN12622000622707。
引言
肠-脑轴——被描述为肠道微生物组与大脑之间的相互作用——在心理健康和认知功能方面被认为可能非常重要。肠道微生物组对大脑健康的影响得到了临床前研究的支持，这些研究表明海马（一个对学习、记忆、情绪和压力调节至关重要的大脑区域）相关关键通路的调节。无菌小鼠的动物研究表明，肠道微生物组可以调节5-羟色胺和5-羟基吲哚乙酸的海马浓度，以及海马神经发生。临床前研究已经证明，益生菌和益生元的干预有益地调节了影响海马的几个机制，包括增加脑源性神经营养因子浓度、减少氧化应激、抑制海马凋亡和减少海马内淀粉样β斑块的沉积。最近的益生菌补充临床试验也报告了大脑成像结果的显著变化。
与先前研究中评估的单独益生菌和益生元干预相比，发酵食品（如酸奶和发酵蔬菜）含有这些益生菌和益生元生物活性成分的组合，以及在发酵过程中产生的生物源性化合物。据推测，由于这种微生物组相关成分的组合，与单独干预相比，发酵食品可能对心理和认知功能产生额外益处。例如，一项先前的研究检查了在12名健康女性中，与非发酵乳制品或未接受干预的组相比，食用添加益生菌细菌的发酵乳制品4周的影响，结果显示发酵乳制品干预调节了参与情绪和感觉处理的大脑区域（岛叶、导水管周围灰质）的活动。然而，鉴于评估发酵食品干预对大脑影响的研究有限，需要进一步研究来复制这些结果，并探索与心理和认知结果相关的其他大脑功能维度。
因此，我们的研究旨在通过随机、安慰剂对照试验设计，评估发酵益生菌酸奶对多个大脑参数（特别关注海马）以及相关血液、临床和肠道微生物组终点的可能影响，从而扩展当前知识。
方法
试验设计
本试验已在澳大利亚新西兰临床试验注册处（ACTRN12622000622707）前瞻性注册。迪肯大学人类研究和伦理委员会（2022-018）和莫纳什大学人类研究和伦理委员会（2022-32337-77961）批准了本研究。该研究由迪肯大学吉朗食品与情绪中心的研究人员领导，并在莫纳什大学墨尔本脑与精神健康特纳研究所的BrainPark进行。
这是一项为期8周的三盲、安慰剂对照、平行试验。符合条件的参与者完成了两次面对面的研究访问：一次在基线，一次在第8周随访。8周的研究持续时间基于先前的益生菌干预研究，这些研究在此时间框架内报告了大脑成像结果的显著变化，以及先前的荟萃分析表明>4周的研究可能更有效。参与者被随机分配到干预或安慰剂产品，并要求在8周研究期间每天早上食用指定产品。在8周试验期间，通过电话、短信或电子邮件与参与者联系两次，以评估不良事件和研究依从性。
参与者
参与者通过2022年6月16日至2022年12月21日的在线社交媒体广告和实体传单招募。在参与者注册之前，通过电话完成预先筛选面试以确定资格。可能符合条件的参与者通过在线REDCap eConsent表格提供同意。
我们仅招募女性以减少个体间变异性并提高内部有效性，基于临床前研究表明微生物组-大脑相互作用可能存在性别特异性差异。例如，Clarke等人报告了微生物组对海马5-羟色胺信号传导的性别依赖性影响，这是与我们主要结局相关的关键机制。这种方法与优先在受控条件下进行信号检测的早期阶段机制试验一致。
进一步的资格标准包括：18-55岁，被认为健康且无认知障碍诊断、重大神经系统疾病、任何已诊断的精神疾病、无情绪障碍（患者健康问卷(PHQ)-2评分<3）或重大胃肠道疾病；被认为安全且舒适地接受MRI；愿意保持习惯性饮食和运动水平，遵守研究程序并提供自愿知情同意；以及说英语或能够确保现场临床访问和电话随访时间点的外部翻译的非英语参与者。
排除标准包括：过去2周使用益生菌或抗生素；最近开始使用已知影响肠道/大脑健康的新的补充剂（例如，膳食纤维）；报告定期食用发酵乳制品；对乳制品过敏或乳糖不耐受或对任何研究成分过敏/不耐受；急性疾病或从急性疾病中恢复；怀孕或哺乳；和/或参与使用研究产品的另一项研究。
要求参与者保持正常的运动/身体活动水平和饮食摄入量。他们还被指示列出并维持任何符合条件的饮食补充剂或处方药。此外，参与者因完成研究而获得100澳元，以支付参与试验相关的自付费用。
患者和公众参与
患者和公众未参与本研究的设计、实施、报告或传播计划。
干预
干预是每天食用130克发酵益生菌酸奶，该酸奶用>30亿菌落形成单位(CFU)的双歧杆菌乳酸亚种(BB-12)和>1000亿CFU的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵。安慰剂也是乳制品基础的，但未用细菌培养物发酵或经历任何发酵过程。它包括以下成分以匹配干预酸奶的外观、质地和风味：牛奶、水、牛奶固体、奶油、增稠剂（1422、果胶）、明胶、天然香料和酸度调节剂（330）。所有研究产品均免费提供给参与者。参与者完成研究产品日志以记录遗漏的剂量，该日志在最终时间点提交给研究工作人员。
结局
成像测量
在基线和第8周使用西门子Skyra 3特斯拉MRI扫描仪和32通道头部线圈在莫纳什大学莫纳什生物医学成像设施进行脑成像。成像方案包括T1加权结构MRI、静息态功能MRI(rs-fMRI)、扩散张量成像(DTI)、基于任务的fMRI和磁共振波谱(MRS)。
磁共振波谱
预先指定的主要结局是组间海马谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰天冬氨酸(NAA)、胆碱(Cho)、肌酸(Cr)、肌醇和谷氨酸/谷氨酰胺浓度的差异。MRS数据使用LCModel软件进行分析，应用标准质量控制阈值（Cramer-Rao下限<20%，信噪比>10）并使用组织浓度估计进行部分体积效应校正。
结构和功能MRI处理
T1加权结构MRI数据使用FMRIB软件库(FSL)的FIRST和FreeSurfer流程分析海马和皮质厚度，进行总颅内体积调整。功能连接分析使用CONN工具箱进行，而DTI数据使用MRtrix和FSL处理，包括运动校正和扩散指标提取。基于任务的fMRI数据使用SPM12进行预处理，对记忆编码和检索阶段的激活对比进行建模。
有关MRI采集参数、预处理步骤和分析流程的更多详细信息，请参阅在线补充材料。
临床、心理和认知评估
在基线使用80项流行病学研究饮食问卷(V.3.2)评估饮食摄入量。使用PHQ-9（经过验证的9项工具，评分范围：0-27）在基线和第8周测量抑郁症状，评分越高表示症状严重程度越大。使用WHO幸福感指数(WHO-5)评估幸福感，并使用肠易激综合征视觉模拟量表测量肠道症状学。
使用配对联想学习任务(Cantab, UK)在基线和第8周评估海马依赖性记忆功能，这是一种空间记忆的计算机化评估。评估工具的完整详细信息可在在线补充材料中获取。
生物样本分析
由训练有素的采血师在基线和8周随访时收集非空腹血清和血浆血液样本，并测量氧化应激（例如，血清总抗氧化能力）和炎症（例如，血浆高敏C反应蛋白）血液标志物的变化，由独立实验室（墨尔本病理学，澳大利亚）进行。
向参与者提供自我管理的粪便收集套件，并指示他们在家中在基线和随访时收集样本。样品通过预付特快专递使用包含DNA稳定剂的套件返回，以在运输过程中保存微生物完整性。在收到Microba（布里斯班，澳大利亚）后，样品立即存储在-80°C，直到进行DNA提取。使用DNeasy 96 PowerSoil Pro QIAcube HT试剂盒（Qiagen）和PowerBead Pro珠进行机械裂解提取DNA。使用Illumina DNA Prep (M) Tagmentation试剂盒（Illumina，20018705）和IDT for Illumina DNA/RNA UD Index Sets A-D（Illumina 20027213-16）构建文库，遵循制造商指南。使用NovaSeq6000（Illumina）进行鸟枪法宏基因组测序。使用Microba基因和通路分析仪进行基因和通路丰度的量化。详细的肠道微生物组方法见在线补充材料。
功效计算
基于先前的工作，R2为0.3，每组的常见标准差为0.15，流失率为15%，估计总样本量为40，以80%的功效检测主要结局中平均水平变化的有意义差异。这种先验功效计算基于旨在评估整体组间差异的多元方差分析(ANOVA)框架。此功效分析仅针对主要结局进行，未考虑对次要结局进行多重比较校正。因此，该研究在多重比较校正后可能不足以检测这些次要结局上的小到中等效应，这些结果应解释为探索性的。
随机化和分配隐藏
参与者在提供同意后并在基线访问之前，以1:1的比例随机分配到干预组或安慰剂组，使用包含每块四个观察值的区组随机化程序。分配序列由与研究团队和程序分开的统计学家生成。一名未盲的研究助理进行组分配。结果评估者和包括统计学家在内的所有其他研究调查员在主要结局数据分析完成之前对组分配保持盲法。
统计方法
进行仅包括完成基线访问并接受研究干预的参与者的改良意向治疗分析。对于脑成像结果，具有不良质量成像数据（无法分析）的参与者被排除在分析之外。
对于主要和大多数次要结局，我们使用广义估计方程(GEE)模型来估计从基线到第8周随访的组间差异变化。GEE模型包括组分配、名义时间点以及干预组和时间点之间的交互作为固定效应。组分配和名义时间点之间的双向交互估计了第8周从基线开始的组间差异变化。
对于基于体素或基于顶点的分析，包括功能MRI和全脑FreeSurfer分析，采用协方差分析(ANCOVA)模型，名义时间和组为主要因素以及它们的交互作用（时间×组）。
为了评估肠道微生物组α多样性在组间的差异，我们使用香农指数和丰富度指标。过滤掉在少于5%的样本中存在的低流行度分类群。肠道微生物组β多样性的组间差异是在完整病例上计算的。鉴于微生物组相对丰度数据的组成性和非正态性质，在进行β多样性统计测试和差异丰度统计测试（物种、属、科和门）之前进行了中心对数比(CLR)转换。我们创建了CLR转换的成分变化分数（基线减去第8周），并使用vegan包中的adonis2函数进行置换方差分析，进行999次置换。R2统计量被报告，表示模型中分组因素（即干预或安慰剂组）解释的方差比例。
对观察到显著干预效应的结果进行了事后Pearson相关分析。
对所有具有缺失随访数据的结果进行了多重插补。插补模型包括基线协变量以提高插补精度，并指定了50次插补，假设数据随机缺失。
对于体素/顶点水平的成像结果，应用了簇水平的错误发现率(FDR)校正，初始阈值为p<0.0010。显著成像发现的阈值定义为FDR校正p值<0.05。对于所有其他结果，应用了家庭范围内的Benjamini-Hochberg校正来控制多重比较，结果表中同时呈现了调整后的p值（q值）和未调整的p值。
使用GraphPad Prism V.9.0开发图表。肠道微生物组结果使用lme4 R包进行分析。所有其他统计分析均使用Stata V.14进行。
结果
总共筛选了102名可能符合条件的参与者，其中43名符合资格。3名符合条件的参与者未完成基线访问，留下40名参与者进行登记，并有资格进行我们的改良意向治疗分析。所有完成基线访问的参与者都完成了干预。
基线数据
样本由40名成年人组成（平均年龄32±12岁），其中18名参与者分配到干预组，22名分配到安慰剂组。大多数参与者（98%）已完成高等教育。大多数人自认为是大洋洲人（70%），其次是东南亚人（25%），东亚和南欧背景的代表较少（各3%）。基线特征在各组之间通常相似；然而，干预组的膳食补充剂使用水平高于安慰剂组。最常报告的膳食补充剂是多种维生素（27%）和维生素D（27%）。最常报告的药物是避孕药（44%）。各组之间的基线饮食摄入量在所有宏量营养素方面相似。
磁共振波谱
从基线到第8周，左海马谷胱甘肽浓度存在显著的组间差异变化（变化的平均差异：-0.49；95% CI -0.95至-0.04），负值表示干预组的增加更大。干预组中左海马谷胱甘肽浓度增加，安慰剂组变化最小。然而，这在对所有感兴趣代谢物的多重比较测试后（即NAA、Cr、胆碱、肌醇和谷氨酸/谷氨酰胺）并未维持。在任何其他测量的代谢物中均未发现显著差异，在计算为Cr比率时也未发现显著差异。
功能连接
左海马的种子分析发现从基线到第8周，左海马和左额极之间的功能连接存在显著的组间差异变化（pFDR校正<0.001，k=188，T=5.86，（-22，42，12）），在FDR校正后仍保持显著（变化的平均差异：-0.21；95% CI -0.11至-0.31）。这两个区域之间的功能连接在干预组中增加，在安慰剂组中以相似幅度发生相反变化。
大脑结构结果
从基线到第8周，左海马体积存在显著的组间差异变化（平均差异：-126.84；95% CI -225.46至-28.22），干预组增加，安慰剂组减少。在右伏隔核中观察到类似的组间差异（平均差异：27.78；95% CI 0.92至54.63），但有利于安慰剂组而非干预组。左海马体积的变化在对海马区域内的多重比较进行调整后（即左和右海马）仍然显著；然而，在对所有双侧大脑区域应用多重比较调整后，左海马和右伏隔核的差异均不再显著。
没有观察到DTI相关结果（例如，分数各向异性，平均扩散率）在全脑水平或感兴趣区域水平在多重比较校正后的显著干预效应，包括连接到海马的两个感兴趣的束（例如，穹窿和扣带回的海马部分）。进一步分析显示，厚度在全脑水平或其他皮下区域的变化在多重比较校正后无显著差异。
基于任务的fMRI
在基线时，记忆编码阶段的大脑激活在各种皮层区域和双侧海马中显而易见。在记忆检索阶段观察到类似的激活模式。然而，我们没有发现8周内行为结果上的时间与组交互作用，即成功率。进一步的全脑成像分析显示，无论是记忆编码阶段还是记忆检索阶段，均无显著的时间与组交互作用。
肠道微生物组结果
我们未观察到8周时平均物种水平丰富度或香农指数变化的统计学显著组间差异。然而，我们确实观察到β多样性（Aitchison距离；r2=0.038，p=0.010）变化的统计学显著组间差异，表明3.8%的群体整体结构变化可能归因于干预。我们还观察到13种细菌物种变化的统计学显著组间差异（CLR转换丰度；p<0.05）。值得注意的是，双歧杆菌动物种和嗜热链球菌（干预产品中均存在）在干预组中增加，而在安慰剂组中变化最小。双歧杆菌动物种是唯一在多重比较调整后接近统计学显著的物种。MetaCyc组α多样性变化或任何功能MetaCyc通路变化无组间差异。
MRI结果的相关性分析
左海马体积与左海马和额极之间功能连接的变化总体呈中度正相关（r=0.325，p=0.047）。左海马谷胱甘肽浓度变化与左海马和额极之间功能连接的变化也呈中度正相关（r=0.394，p=0.019）。双歧杆菌动物种变化与左海马和额极之间功能连接的变化呈中度正相关（r=0.38，p=0.026）。
临床结果
在任何临床、认知或血液生物标志物结果中均未观察到显著的干预效应。
参与者依从性和不良事件
90%的参与者消耗了超过90%的干预/安慰剂。在干预期间自报告了三个不良事件。安慰剂组中一名参与者在两个时间点报告了轻度腹胀或胀气，干预组中一名参与者报告了轻度噩梦。此外，基线MRI扫描发现安慰剂组中一名参与者存在异常脑生长，已转介给该参与者的医生进行随访。
讨论
我们的研究表明，与接受安慰剂酸奶的人相比，接受8周发酵益生菌酸奶干预的人在与海马相关的功能连接方面存在显著的组间差异。此外，我们发现接受干预产品的人海马体积和谷胱甘肽浓度有所增加的证据；然而，这些结果在多重比较测试后并未维持。这些结果与先前调查大脑成像结果的益生菌干预一致，其中最一致报告的显著效应是功能连接终点，而对其他终点（如脑区体积）的证据有限。
据我们所知，这是第一项提供初步证据的研究，表明发酵益生菌酸奶干预可能增加海马内的谷胱甘肽浓度。谷胱甘肽是主要的抗氧化剂之一，负责减轻氧化应激，因此这些结果对神经精神疾病特别相关。然而，由于这些结果在多重比较校正后未维持，因此需要谨慎考虑。因此，未来的研究应在更大样本中调查发酵乳制品干预对谷胱甘肽状态的影响。我们的研究还提供了关于发酵益生菌酸奶对脑体积终点影响的初步但不一致的数据。左海马体积的组间差异变化表明发酵益生菌酸奶对涉及包括抑郁症和精神分裂症在内的几种主要精神疾病的脑区具有有利影响。在安慰剂组中观察到右伏隔核体积增加是一个意外发现。由于这一结果在多重比较校正后未维持，并且不是先验假设的，因此应谨慎解释。此外，伏隔核的测量已被证明仅具有中等的重测可靠性（组内相关系数~0.70-0.80），这增加了这一结果可能归因于测量变异性而非真实结构变化的可能性。需要在更大样本中进行复制，以确定这一效应的可靠性和重要性。
左海马和额极之间功能连接的变化可能应用于神经疾病人群，如阿尔茨海默病、与年龄相关的认知下降和创伤性脑损伤，与健康对照相比，这些疾病中这些区域之间的功能连接减少已被记录。我们的结果与两项先前的益生菌干预研究结果一致，这些研究表明额极连接的变化；然而，这些先前的研究报告称变化是在区域之间，如额中皮层（减少）和枕极皮层（增加），分别，而不是与海马，如我们在研究中报告的。
尽管观察到海马连接和谷胱甘肽水平的初步神经生物学变化，但重要的是要强调，在8周干预期间，临床症状学或认知表现方面未检测到显著改善。这表明，尽管干预可能影响与大脑相关的途径，但这些效应并未转化为可测量的心理或行为结果。这可能是由于招募了基线抑郁和焦虑症状水平较低的健康参与者群体，这最小化了组间结果的分离可能性。这与先前益生菌干预荟萃分析中包括的亚组分析一致，这些分析报告称，情绪的改善通常由抑郁症临床诊断或症状严重程度更高的研究驱动，在健康个体中未观察到显著结果。这表明未来的研究应关注临床人群或抑郁症状升高的人群，以评估益生菌干预可能的认知、神经结构和抗抑郁作用。或者，诱导参与者压力源的研究设计方法也可能增加健康参与者组间结果的分离，正如先前使用冷加压或社会排斥范式压力源的益生菌干预研究中所证明的。
同样，组间肠道微生物组β多样性（Aitchison距离，R²=0.038，p=0.010）的变化表明，约3.8%的微生物群落结构变化可归因于干预。虽然这种效应大小与先前的微生物靶向干预一致，但在缺乏微生物代谢途径或α多样性变化的情况下，这些结果的临床相关性尚不清楚。需要进一步研究以明确观察到的微生物组成变化是否转化为临床上有意义的生物或精神结果。
我们的试验结果应在以下限制条件下考虑。虽然我们的样本量与具有类似研究设计的近期研究一致，但需要更大规模的试验来确认这些结果。这对于左海马体积和功能连接等结果尤其重要，因为观察到基线组间差异。同样，左海马与伏隔核体积变化的差异可能反映了样本量限制，多重比较调整后失去统计学显著性表明需要更大规模的研究来确认这些初步发现。此外，氧化应激结果为阴性可能是由于许多参与者在收集时未空腹，因此可能受到饮食抗氧化摄入的影响。在这项研究中，由于MRI时间安排限制，空腹并非总是可行，因为一些预约在下午进行。未来关注生物标志物的研究应考虑在血液收集前标准化空腹状态，以减少变异性并提高敏感性。
我们的研究仅招募了健康个体。虽然这使我们能够在一般人群的背景下研究发酵乳制品的作用，但进一步研究这些相同结果在精神或认知障碍或症状升高的临床人群中的作用可能会为疾病条件下的作用机制提供有意义的见解。据我们所知，只有一项由Schaub等人进行的研究，该研究调查了4周益生菌补充对重度抑郁症患者大脑成像结果的影响，报告了益生菌干预后对中性面孔的壳核激活减少以及抑郁症状的改善。然而，需要进一步研究来复制这一点并扩展到其他精神和认知障碍。此外，我们仅包括女性以减少生物异质性，基于证据表明微生物组-大脑相互作用（包括影响海马的相互作用）可能因性别而异。未来的研究应包括男性参与者，以评估性别特异性反应并提高跨人群的普遍性。
最后，益生菌-微生物组文献中常见的一个不足是对菌株特异性作用机制的了解有限。我们使用了一种包含常见酸奶培养物嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌以及添加的双歧杆菌动物亚种乳酸（BB-12）的益生菌酸奶，后者是一种具有大量先前文献的益生菌菌株。然而，目前尚不清楚某些菌株或发酵食品配方是否可能提供与其他不同的治疗效果。此外，尚不清楚我们观察到的结果是否可归因于发酵酸奶产品中含有的益生菌细菌、产生的发酵产物，或者确实是发酵乳制品的一般特定因素。需要更多研究来了解可能对我们观察到的结果负责的生化机制。
我们的研究也有几个优点。首先，我们的研究使用了在体积、味道、外观、质地和香气方面与干预相匹配的安慰剂对照。鉴于在有效盲法食品干预中通常无法获得匹配的安慰剂，这是一个显著的优点。我们的研究与许多最近调查大脑成像结果的益生菌研究相比，持续时间更长。使用8周的时间框架使我们能够调查大脑成像结果，此前曾报道该时间框架更可能显示精神病结果的变化。最后，我们的研究扩展了目前关于发酵乳制品干预的有限文献，为除益生菌和益生元补充之外的额外微生物组靶向干预提供了信息。
结论
本研究的结果表明，8周发酵益生菌酸奶干预可能会调节健康女性的海马功能连接；我们还提供了对GSH水平和体积有益影响的初步证据。需要在更大样本和海马相关病理相关的临床人群中进一步研究以复制这些结果，例如在精神疾病和认知障碍中。
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