摘要
在衰老和应激过程中，骨髓(BM)微环境的重塑会损害造血干细胞(HSC)的维持，导致外在的HSC衰老表型。尽管生态位来源的Notch信号对骨髓抑制性损伤后的造血再生至关重要，但调控这种应激响应信号的上游表观遗传机制仍未被充分理解。在此，我们确定染色质重塑因子BRM(SMARCA2)是骨髓窦状隙生态位的关键调控因子，可维持血管完整性和造血再生。通过双向骨髓移植实验，我们证明BRM缺乏的微环境会损害HSC的重建能力，并导致类似衰老的髓系偏移，表现为粒细胞-单核细胞祖细胞扩增。在5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导的骨髓抑制后，Brm基因敲除(BrmKO)小鼠表现出窦状隙再生缺陷，伴有内皮退化。从机制上看，BRM缺乏通过损害窦状内皮细胞(SECs)中应激诱导的Notch2表达而减弱内皮Notch信号，同时通过持续消耗SECs和损害应激诱导的Jag2生产型瘦素受体(LepR)阳性基质细胞扩增，减少Jag2配体库。这些改变削弱了内皮Notch信号，导致窦状隙再生缺陷、间充质生态位支持丧失，以及HSC从窦状血管网络中进行性移位。值得注意的是，BRM表达在衰老的野生型SECs和LepR阳性基质细胞中生理上减少。总体而言，我们的研究发现BRM是骨髓生态位完整性的关键表观遗传调控因子，并表明与年龄相关的BRM下降导致生态位功能障碍和造血衰老。
关键要点
- BRM维持骨髓生态位以保持HSC重建能力和预防与年龄相关的髓系偏移
- BRM维持骨髓生态位中的应激响应Notch信号，从而保持窦状隙完整性和HSC定位
引言
造血干细胞(HSCs)通过其自我更新和分化为多种谱系的标志性能力，维持终生的血液和免疫细胞产生。这一过程主要受骨髓(BM)微环境(即生态位)调控，该微环境为HSC维持提供了必不可少的结构和分子线索。生态位包含各种非造血成分，包括小动脉内皮细胞(AECs)、窦状内皮细胞(SECs)、间充质基质细胞(MSCs)和成骨细胞谱系细胞。在这些成分中，SECs和血管周围基质细胞构成了窦状隙生态位，这是一种特殊微环境，维持HSC的静止状态、定位和再生能力，同时在衰老过程中优先保留以维持残余HSC功能。随着衰老和慢性应激，骨髓微环境的系统性重塑——以血管改变和基质细胞功能障碍为特征——严重损害HSC稳态并驱动造血功能下降，然而上游机制在很大程度上仍未被探索。
生态位与HSCs之间的一个关键通信轴是Notch信号通路，其中内皮和间充质来源的配体调控成人骨髓稳态和再生。具体而言，Notch配体Jagged-2(Jag2)——主要由SECs和表达瘦素受体(LepR)的基质细胞表达——作为不可或缺的空间协调器，确保HSC正确锚定到支持性血管网络。除了直接的生态位-HSC串扰外，一种新范式表明，在骨髓抑制性损伤后恢复期间，自分泌/旁分泌内皮-内皮Notch信号对于血管结构的再生是必需的，从而实现造血再生。因此，基质微环境中Jag2的动态诱导对于损伤后生态位修复至关重要，但驱动这种应激响应配体激活的分子开关仍未知。
包括我们在内的最新研究已确定染色质重塑因子BRM(SMARCA2)是应激造血的关键调控因子。BRM通过维持应激响应的染色质可及性，在再生应激期间保持HSC功能并预防与年龄相关的造血下降。这些观察引发了BRM也可能通过骨髓微环境协调造血的应激适应的可能性。因此，我们假设BRM转录激活窦状隙生态位再生所需的基质程序。
在此，我们证明BRM是应激造血期间窦状隙生态位再生的基本表观遗传调控因子。使用Brm缺陷小鼠，我们显示BRM维持窦状血管完整性和支持骨髓抑制性损伤后的HSC重建活性。从机制上看，BRM促进SECs和LepR⁺基质细胞中的应激响应Jag2诱导，从而维持Notch信号、血管再生和HSC在窦状隙生态位内的锚定。总之，这些发现将BRM确定为通过染色质重塑将环境应激与生态位再生耦合的主调控因子，揭示了一种将环境应激与生态位衰老和造血系统再生失败联系起来的表观遗传机制。
材料与方法
小鼠和骨髓抑制应激模型
所有动物实验均获得神户大学机构委员会批准。8至12周龄的Brm基因敲除(BrmKO)小鼠(CD45.2⁺)由筑波大学的T. Arinami和Y. Iijima博士慷慨提供。通过单次腹腔注射250 mg/kg的5-氟尿嘧啶(5-FU；协和麒麟)诱导骨髓抑制应激。
骨髓细胞制备
从右侧股骨和胫骨冲洗出的骨髓(BM)细胞在25°C下用Accumax(Invitrogen)酶解45至60分钟，过滤，并在红细胞裂解后悬浮于0.5% BSA-PBS中。
细胞分选和流式细胞术分析
为分离生态位细胞，骨髓细胞首先通过MACS使用抗CD105微珠(SECs的阳性选择)或CD45/Ter-119微珠(用于LepR⁺基质细胞的阴性选择)进行预富集。进行Fc阻断后，用荧光染料偶联抗体混合物染色(SECs：Ter119、CD31、CD105、Sca1、CD45.2；LepR⁺细胞：Ter119、生物素-抗LepR/链霉亲和素、CD144、CD45.2、CD31、CD105、CD140a、Sca1)，并使用FACS Fortessa X-20、FACS Melody(BD Biosciences)和FlowJo软件进行分选或分析。
整体胸骨免疫染色和股骨H&E染色
切除的胸骨在4% PFA中固定，进行细胞膜通透性增强处理，然后与一抗(抗CD144、抗LepR、抗Jag2和谱系抗体混合物)和二抗一起孵育。使用FV4000(EVIDENT)采集共聚焦图像。股骨经石蜡包埋，并用苏木精和伊红(HE)染色。使用Fiji测量工具量化窦状隙直径和空间距离。
窦状隙强度定量
为量化VE-钙粘蛋白(CD144)表达，使用相同的共聚焦设置捕获整体胸骨图像。使用ImageJ软件计算单位面积的平均灰度值和原始积分密度，并从非血管区域减去背景噪声。
骨髓移植和嵌合体分析
对于骨髓移植，将Ly5.1(CD45.1⁺)供体骨髓细胞(2×10⁵个细胞)移植到致死剂量照射(8.5 Gy分次照射，间隔3小时)的CD45.2⁺野生型或BrmKO受体小鼠中。使用c-Kit、Sca-1、CD34、CD150、CD48、Flt3、CD41、CD45.1和CD45.2鉴定HSC/MPP组分；使用c-Kit、Sca-1、CD34、FcgR、CD45.1和CD45.2解析髓系祖细胞(包括GMPs)。通过FACS Fortessa X-20分析重建和祖细胞嵌合体。
电子显微镜
冲洗的骨髓组织在2.5%戊二醛中预固定，在1%四氧化锇中后固定，脱水，并嵌入Epon 812树脂中。70 nm的超薄切片用醋酸铀和铅染色溶液双重染色，并在透射电子显微镜(TEM)下检查。
定量PCR(qPCR)
使用RNeasy Micro Kit(Qiagen)提取总RNA，并用SuperScript III(Invitrogen)进行反转录。使用THUNDERBIRD Next SYBR qPCR Mix(TOYOBO)在QuantStudio 5 System(Applied Biosystems)上进行实时定量PCR，表达水平归一化至Gapdh。
结果
微环境BRM维持HSC重建能力并防止髓系偏移
为确定BRM是否对骨髓(BM)微环境的造血支持功能必需，我们采用了专门研究受体生态位的骨髓移植(BMT)模型。将野生型(WT；Ly5.1/CD45.1⁺)骨髓单核细胞移植到致死剂量照射的Brm缺陷(BrmKO)或WT受体小鼠(Ly5.2/CD45.2⁺)中，从而能够独立于供体造血细胞评估微环境中BRM对HSC维持和再生的贡献。
移植后4至16周，外周血中供体来源(CD45.1⁺)嵌合体在BrmKO受体中逐渐减少。这种缺陷在骨髓中也显而易见，在移植后16周，骨髓中的供体嵌合体显著降低，伴随着骨髓总细胞数量的明显减少。尽管再生能力受损，但供体来源的表型HSCs和多能祖细胞(MPP1–4)的频率在两种基因型之间相当。相比之下，下游髓系祖细胞在BrmKO受体中表现出明显的谱系失衡，表现为粒细胞-单核细胞祖细胞(GMPs)比例增加和巨核细胞-红系祖细胞(MEPs)比例减少，而共同髓系祖细胞(CMPs)未受影响。
这些发现确立了微环境BRM对高效HSC重建和移植后髓系分化平衡的必要性。
BRM在衰老和再生应激过程中差异调控血管生态位种群
为直接检查BRM的再生作用，我们使用了无照射的5-氟尿嘧啶(5-FU)模型，该模型选择性地清除增殖性造血细胞，同时诱导快速的窦状隙再生。这种方法使我们能够在没有辐射诱导组织损伤的混杂因素的情况下评估血管生态位修复。我们重点关注三种主要的窦状隙生态位细胞群——AECs、SECs和LepR⁺基质细胞——并通过流式细胞术量化它们的丰度。
在稳态条件下，SECs频率在BrmKO小鼠中显著降低，并在造血再生过程中(5-FU治疗后第4天和第30天)保持较低水平。与先前报道一致，在生理衰老过程中，SECs频率下降，使得WT和BrmKO小鼠之间的差异在老年动物中不再明显。
相比之下，LepR⁺基质细胞表现出短暂的应激依赖性缺陷。在稳态条件下，两种基因型之间的频率相当，但在早期再生阶段(第4天)，BrmKO小鼠中的频率显著降低，并在第30天恢复到WT水平。
AECs在稳态条件下在BrmKO小鼠中略有减少，但在再生或生理衰老过程中没有基因型依赖性差异，这与它们对窦状血管再生的有限贡献一致。
这些发现表明BRM缺乏导致细胞类型特异性反应：SEC区室持续减少，LepR⁺基质细胞再生应激反应短暂缺陷，而对AECs的影响最小。
BRM维持再生和衰老过程中的窦状血管完整性
鉴于在SECs中观察到的主要缺陷，我们接下来检查了窦状血管再生。股骨切片的苏木精和伊红染色显示，在5-FU治疗后第4天，BrmKO骨髓中就已经出现明显的血管紊乱和窦状隙扩张。
整体胸骨CD144⁺窦状隙的免疫荧光图像进一步显示，即使在稳态条件下，BrmKO小鼠也表现出扩大的窦状血管。5-FU治疗后，WT小鼠逐渐在第30天恢复精细的窦状网络，而BrmKO小鼠则表现出持续的窦状隙扩张，这种现象在第120天仍然明显。在骨髓移植后和生理衰老的BrmKO小鼠中也观察到类似的血管扩张。由于这些异常在移植WT造血细胞后仍然存在，它们可归因于受体微环境的缺陷。
为定义这种结构缺陷的细胞基础，我们使用透射电子显微镜(TEM)检查了骨髓生态位细胞的超微结构。在稳态条件下，SEC形态在两种基因型之间基本相当。相比之下，在5-FU治疗后第30天，BrmKO SECs表现出核膜扩张、细胞器破坏和细胞质稀疏。这些异常在LepR⁺基质细胞中未观察到。同样，内皮连接和VE-钙粘蛋白表达在整个再生过程中似乎保持完整。
这些发现表明SEC退化是BrmKO窦状隙生态位再生缺陷的结构基础，而非内皮连接完整性问题。
BRM差异调控窦状隙生态位细胞中的Jag2表达
为定义BRM依赖性生态位缺陷的分子基础，我们聚焦于Notch信号。因为Jagged-2(Jag2)是骨髓抑制性损伤后造血再生所需的关键内皮配体，我们通过整体免疫荧光检查了其表达。在不同的造血应激背景下——包括稳态、5-FU治疗后的再生、骨髓移植和生理衰老——BrmKO骨髓中的Jag2免疫荧光始终降低。然而，在5-FU治疗后第120天，Jag2表达已恢复到WT水平，表明再生相关的Jag2缺陷在再生完成后是可逆的。
为确定这种减少的细胞来源，我们接下来检查了主要骨髓生态位种群中的Jag2表达。直方图分析显示BrmKO SECs中Jag2荧光强度有轻微左移，表明尽管整体荧光强度无统计学差异，但Jag2诱导受损。相比之下，在稳态和再生条件下，LepR⁺基质细胞中的Jag2表达在两种基因型之间相当。AECs在所有条件下均表达低水平的Jag2，与对Jag2依赖性窦状再生的有限贡献一致。相比之下，CD45⁺造血细胞在早期再生过程中暂时上调Jag2，但WT和BrmKO小鼠之间的细胞频率或Jag2表达没有差异，这排除了造血区室对BRM依赖性表型的主要贡献。
因为Jag2激活Notch信号，我们接下来检查了FACS分离的骨髓SECs中Notch1和Notch2的表达。在稳态下，两种受体的表达在WT和BrmKO小鼠之间相当。然而，在5-FU治疗后的早期再生阶段，Notch2(而非Notch1)在BrmKO SECs中显著降低。与Jag2和Notch2表达减少一致，下游Notch靶标Hes1在BrmKO SECs中显著降低。尽管Hes1表达在稳态条件下已经较低，但在再生过程中的诱导在第4天进一步受损，并持续降低至第30天，表明在窦状再生过程中Notch信号持续减弱。Notch1表达在5-FU治疗后第30天反而增加，表明对受损的Jag2–Notch2信号产生延迟的代偿反应。这些发现证明了在BrmKO SECs再生过程中Jag2–Notch2–Hes1信号轴的持续损伤。
因为BrmKO生态位重现了生理衰老的几个特征，我们接下来检查了从年轻(2月龄)和老年(≥24月龄)WT小鼠中分离的生态位细胞中的BRM表达。Brm转录本在老年小鼠的SECs和LepR⁺基质细胞中显著减少，确定了与年龄相关的BRM下降作为窦状隙生态位的共同特征。这些发现将BRM确定为再生窦状内皮细胞中Jag2–Notch2–Hes1信号轴的上游调控因子。
BRM缺乏延迟HSC在窦状再生和衰老过程中的定位恢复
为确定受损的窦状再生是否影响HSC生态位的空间组织，我们在整体胸骨骨髓制备中测量了CD150⁺Lineage⁻ HSCs与CD144⁺窦状隙之间的距离。在稳态条件下，WT和BrmKO小鼠之间的HSC到窦状隙距离相当。在再生的早期阶段(5-FU治疗后第4天)，BrmKO小鼠中HSC到窦状隙的距离有增加的趋势，尽管差异未达到统计学意义。然而，到第30天，BrmKO小鼠中的HSC位于比WT对照显著远离窦状血管的位置。到第120天，这种差异已基本解决，不再具有统计学意义。在生理衰老的BrmKO小鼠中，HSC到窦状隙距离增加的趋势持续存在。
这些发现表明，在BrmKO小鼠中，血管生态位再生和生理衰老过程中HSC定位的恢复受损。
讨论
在本研究中，我们确定BRM是骨髓微环境的关键表观遗传调控因子，可维持窦状再生并支持骨髓抑制性应激后的造血恢复。BRM并非通过造血细胞本身发挥作用，而是维持内皮和基质生态位功能，从而支持正常的HSC再生和谱系输出。
我们的双向移植实验表明，BRM缺乏的微环境足以将髓系偏向性造血强加于原本健康的野生型HSCs。这些发现直接证明了生态位内的表观遗传改变，独立于HSC内在缺陷，导致造血衰老。
从机制上讲，我们的数据将Jag2–Notch轴确定为BRM在窦状内皮细胞中的下游效应器。Jag2可用性降低，加上Notch2的暂时抑制和Hes1的持续减弱，为骨髓抑制性损伤后内皮再生受损提供了分子解释。我们的数据进一步表明BRM协调多个生态位成分。除内皮细胞外，LepR⁺基质细胞在再生的早期阶段也表现出Jag2供应受损，表明BRM在造血再生过程中同步内皮和血管周围反应。尽管小动脉内皮细胞已涉及维持HSC静止和血管稳态，但我们的数据表明BRM依赖性生态位再生主要通过窦状内皮区室介导，这与Jag2在SECs中的优先表达一致。
与生态位重塑受损一致，HSC在再生和衰老过程中逐渐从窦状血管网络中移位。这种表型类似于先前在老年骨髓中观察到的现象，并表明BRM有助于维持血管生态位的空间组织。
BRM表达在老年SECs和LepR⁺基质细胞中下降的观察结果，建立了与生理衰老的直接联系，并与本研究中确定的分子通路相关联。这些发现表明BRM的进行性丧失可能有助于与年龄相关的骨髓生态位退化。
本研究的一个局限是使用系统性Brm基因敲除小鼠，这阻止了生态位特异性效应与造血细胞内在功能的完全分离。尽管如此，我们的双向移植实验证明，微环境中的BRM缺乏足以损害造血再生并促进髓系偏向性造血。未来使用生态位特异性条件性敲除模型的研究将进一步定义各个生态位细胞群的相对贡献。
总之，我们的研究确定BRM是维持骨髓生态位完整性的表观遗传调控因子，通过在再生过程中维持Jag2依赖性Notch信号。这些发现确立了染色质重塑作为连接应激适应、血管生态位维持和造血衰老的核心机制，并表明治疗性恢复BRM活性可能代表一种改善骨髓抑制后造血恢复和造血衰老的策略。
作者贡献
H.S.、H.M.、H.N.、N.Y.、T. Shiina和E.N.进行了实验；H.S.、H.N.和E.N.分析了数据；H.S.和E.N.设计了研究；H.S.准备了图表；H.S.和E.N.撰写了论文；S.K.、H.E.、H.N.、N.Y.、A.I.、T. Shiina和T. Suda审阅了论文；H.S.、E.N.和R.N.获取了资金；E.N.管理了项目。
利益冲突声明
作者声明无竞争性财务利益。
致谢
作者感谢T. Setsu、Y. Sakihama和T. Shimizu提供技术援助；T. Arinami和Y. Iijima博士提供BrmKO小鼠(CD45.2⁺)；以及Nitta实验室所有成员的有益讨论。本工作得到了JSPS KAKENHI转化研究领域(A)资助(21H05254至R.N.)、科学研究(B)(26K02192至R.N.)、科学研究(C)(24K11539至E.N.)、JST SPRING资助(JPMJSP2148至H.S.)、JST登月研究与开发计划资助(JPMJMS2024-7至R.N.)、Kento成像科学COI-NEXT支持单元以及兵库科学技术协会(
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