对于从事脑血管疾病研究的人员来说，建立一种无手术创伤的实验性脑梗死模型的需求显而易见。以往用于制作脑梗死的手术技术[1-5]未能满足我们认为理想实验模型应具备的标准。为此，我们开发了一种通过眶后间隙、经硬膜外入路到达大脑中动脉的方法，并使用蔡司手术显微镜。本文将详细描述该技术及其在制作脑梗死方面的有效性。
技术方法
实验性梗死的制作。——尽管该技术适用于大多数实验动物，但我们将以猫为例详细描述。动物用戊巴比妥（25 mg/kg）行胸膜腔内注射轻度麻醉。气管插管后，术区剃毛并消毒（用六氯酚）。头部固定在头架上并铺巾。
使用Bovie电刀切割电流，从头部中线至颧弓做线性切口（图1）。用伤口夹将皮肤和浅层头皮肌肉的边缘牢固固定在巾单上，以防渗血。软组织和骨膜从前、后方向与眶骨缘分离。用咬骨钳切除眶缘及部分颧弓。用软骨蜡填塞骨的粗糙边缘，以防轻微出血。
在颞肌上做弧形切口，从眶上缘至颧弓后部。此时可在肌肉浅筋膜内识别颞动脉。电凝该动脉以减少失血。再次使用切割电流分离颞肌的两层。可透过肌肉触及下颌骨冠突的骨性突起，用咬骨钳切除。
向前、向后剥离骨膜。务必确保骨膜确实向前方剥离，因为这层组织与眶周筋膜一起维持眶内容物的连续性，使其可向前移位而不会损伤眼睛，也不会使眶周脂肪组织突入术野。剥离骨膜后，放置自动牵开器。
在颞骨上钻一小孔。扩大骨窗至蝶骨嵴（图2）。骨窗是失血的主要来源；尽量远离中线并频繁使用小块骨蜡可最大限度减少失血。硬脑膜保持完整，但是因为这些动物硬脑膜很薄，可看到其下的皮层浅表血管。
后续操作使用蔡司手术显微镜，物镜焦距200 mm，目镜20倍；下一步将放大倍数调至6。用弯曲咬骨钳切除蝶骨嵴。脑膜中动脉经此骨进入颅中窝。其入口位置多变，但易于识别。分别电凝骨硬膜侧和起源侧（眶侧）的动脉，使用低电流。切除蝶骨嵴直至视神经。在覆盖视神经的硬脑膜上有几支小的脑膜血管，同样应在距视神经鞘起点较远处以极低电流电凝。
然后将手术显微镜放大倍数调至10。用11号刀片在视神经鞘起点处切开硬脑膜。向前延伸切口约1厘米。此时脑脊液涌入术野，用极轻柔的吸引器缓慢吸除。
再将手术显微镜放大倍数调至16。透过硬脑膜切口可见覆盖Willis环主要血管的非常纤细的蛛网膜组织。用11号刀片剥离这层半透明网膜。如果用新刀片，蛛网膜阻力很小，通常不会切到超过所需组织。此步骤无血。
去除蛛网膜组织后，较易抬起大脑中动脉在近中线处发自颈内动脉的袢。颈内动脉和大脑中动脉均沿视神经走行，但方向不同（图3）。用小Mayfield夹（或其他适当大小的动脉夹）完全夹闭大脑中动脉。
通过改变显微镜角度观察夹子中的整条血管，可验证闭塞是否成功。常可看到夹子远端形成白色血栓，并向大脑中动脉第一分支蔓延。通过显微镜透过完整硬脑膜观察皮层浅静脉血流速度减慢，也可验证动脉闭塞的完全性。
术中未牵拉脑组织；眶内容物向前移位。完成操作后，只有Mayfield夹的钳口靠近脑部；夹子其余部分位于硬膜外、眶内软组织内，不会对脑构成硬膜外压迫。此外，避免牵拉Willis环附近的小穿支血管，若夹子放置得当，这些血管不会被闭塞。
如果动物用于短期皮层血流研究，则另行切开并切除覆盖半球凸面的硬脑膜。若用于长期研究，则冲洗伤口并分三层缝合。之后可打开覆盖脑凸面的硬脑膜，观察和拍摄浅表微血管。
梗死体积的估算。——猫在夹闭大脑中动脉后5~7天处死。处死前观察活体脑，并经头臂动脉灌注10%福尔马林。脑在10%福尔马林中固定数天，然后用轮廓式斜切盒切片（图4），获得相当均匀的额状切片。
在照片上（图5）用求积仪测量每张切片中梗死的面积。采用平均端面积法估算梗死体积：将同一切片两面的梗死面积相加，除以2，再乘以切片厚度。然后将各切片体积相加，得到整个梗死的体积。用相同方法计算全部切片的总脑体积。
为了在不同动物间比较梗死大小，需要校正因子，因为照片大小略有差异，且脑体积有微小差异。经计量筒测量，照片中脑切片的排水体积在20~25 ml之间。我们任意选择25 ml作为所有脑的参考标准。将每个标本照片切片的计算总脑体积除以25，得到校正因子。然后将计算出的梗死体积乘以校正因子（通常在0.90~1.10之间）。所得值（立方厘米）称为“校正梗死体积”。
结果
失血和低血压。——该入路在8只猫中开发。在这些动物以及其他用于短期研究的动物中，通过股动脉内置管监测全身血压。平均血压持续在100~120 mm Hg之间，手术过程中未见下降。称量纱布，估算吸引管路中的血量。这些动物最大失血量为5~10 ml。后续动物失血量未超过此值，但仅在初期技术开发后进行粗略估算。
脑梗死的产生。——在16只猫中夹闭了大脑中动脉。所有动物临床检查均显示脑梗死证据：夹闭侧对侧肢体明显无力和痉挛、向同侧转圈、警觉性下降。总体而言，神经功能缺损程度与内囊受累程度有关，而非与后来脑检查确定的梗死大小相关。然而，动物的反应性似乎与梗死大小更相关。
在处死时，肉眼可见脑表面梗死的动物中，梗死周围区域小血管明显扩张。但越接近梗死中心，扩张血管逐渐减少，事实上几乎看不到任何血管。此外，根据血液有形成分聚集物缓慢移动（“颗粒状血流”或“泥流”），浅表血管的血流速度显著减慢。
所有16只动物病理检查均发现脑梗死。梗死大小不一，各动物的校正梗死体积各不相同（表1）。此外，梗死位置也有所不同。有些动物梗死较深，靠近中央和基底节；另一些动物梗死扩展至浅表皮层。
表1：16只猫的校正梗死体积
| 动物 | 梗死体积 (cm³) | 动物 | 梗死体积 (cm³) |
|---|---|---|---|
| C1C | 3.89 | C10C | 3.10 |
| C2C | 0.86 | C11C | 2.02 |
| C3C | 1.31 | C12C | 2.98 |
| C4C | 2.90 | C26C | 1.63 |
| C6C | 6.50 | C27C | 5.04 |
| C7C | 3.04 | C28C | 0.53 |
| C8C | 3.47 | C52C | 5.85 |
| C9C | 1.08 | C53C | 8.60 |
讨论
实验模型的标准。——为了使实验动物的脑梗死尽可能接近临床情况，应满足以下标准：
- 梗死的产生应无明显失血或低血压。
- 脑不应受到牵拉或操作。
- 硬脑膜应保持完整，以防止对伴随脑水肿的人工减压。
- 大脑中动脉的穿支以及其他可能作为侧支供血来源的小血管不应受损。
- 对除被闭塞产生梗死的大血管之外的其他大血管，操作应尽量减少。
我们认为我们的入路满足了这些标准。在所有动物中，即使没有低血压，在动脉上放置夹子后都产生了梗死。因此，这可能比某些已报道的方法[3,6]更有效。本文仅提及16只猫的结果；我们已在另外60只猫中使用该技术评估不同治疗方案。稍加改动，该技术很容易适用于狗；我们已在45只松鼠猴和5只猕猴的脑梗死研究中使用了该技术。
梗死大小和位置的变异性。——每只动物在夹闭大脑中动脉后都出现了梗死，但梗死的大小和位置在动物间差异很大。这与全身血压变化或术中失血无关。差异可能归因于血管解剖结构的差异，以及通过侧支通道流到被夹闭动脉正常供血区的潜在和实际血流量不同。梗死很可能发生在侧支灌注不足的区域，而较小的梗死则出现在侧支血供更发达的动物中。由于变异性，使用该实验模型评估治疗方案时需要统计学分析并比较各组动物的梗死体积。
与临床情况的比较。——显然，没有一种依赖于暴露和操作大脑主要供血动脉来产生脑梗死的手术技术能与人类临床情况完全一致。该实验模型与患者之间不可避免的差异包括：
- 在人类的非栓塞性血管疾病中，主要或次要血管狭窄通常经过数年缓慢发展。这导致(a)大量侧支通道的形成和(b)受累血管血流逐渐减少。而在我们的研究中，是在一个其他方面无病变的血管系统中突然急性闭塞血管。
- 不同物种之间，脑表面和脑内血管的吻合程度以及Willis环模式存在显著差异。
- 不同物种之间，脑血管的神经源性控制可能存在显著差异，导致对一条血管突然阻塞的不同反应。
- 不同物种之间，凝血机制和血液本身对血流速度减慢的反应可能存在显著差异。
这些困难不易克服。然而，尽管存在差异，我们相信我们的技术确实提供了一个适合研究脑梗死发展自然史以及研究脑梗死治疗和调节的实验模型。
总结
尽管实验性脑梗死无法完全复制临床情况，但合适的实验模型至少必须满足某些标准，包括无明显失血和低血压、无脑组织牵拉和操作、保持硬脑膜完整、无对血管的不必要操作或损伤。本文描述的经硬膜外入路使用手术显微镜到达大脑中动脉的方法满足了这些标准。暴露后，用夹子或钳子夹闭动脉。在猫、松鼠猴和猕猴中，总能产生大小和位置不等的脑梗死。该技术也应适用于狗和其他动物。可对由此产生的梗死的发展、调节和治疗进行短期或长期研究。
参考文献
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