肠道微生物组驱动的肿瘤免疫微环境调节优化晚期非小细胞肺癌的双重检查点阻断治疗 - 硒与微生态

研究亮点

高肠道菌群多样性与I-N单药治疗更长的无进展生存期和更高的CD8+ T细胞浸润相关。
产短链脂肪酸（SCFA）细菌在应答者中富集，并与免疫激活通路及PD-1+CD8+ T细胞浸润相关。
I-N联合化疗的疗效与肠道菌群多样性无关。
基线肠道菌群多样性可分层I-N疗效，并辅助判断是否需要联合化疗。
治疗前使用抗生素与显著更短的无进展生存期和总生存期相关。

摘要

背景：伊匹木单抗联合纳武利尤单抗（I-N）联合或不联合化疗的双重检查点阻断对晚期非小细胞肺癌（NSCLC）已显示临床疗效，但获益仅限于部分患者。肠道微生物组影响免疫应答，可能影响免疫检查点抑制剂的疗效，因此值得进一步研究。

材料与方法：这项前瞻性研究纳入50名接受I-N（联合或不联合化疗）治疗的NSCLC患者。治疗前采集粪便样本评估菌群多样性和组成，并使用多重免疫荧光染色评估肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）。分析无进展生存期（PFS）、总生存期（OS）和客观缓解率与肠道菌群特征及治疗方案的关系。

结果：仅接受I-N治疗的患者中，高肠道菌群多样性与更好的疗效及更高的CD8+ TIL（尤其是PD-1+CD8+ TIL）浸润相关。应答者中富集产短链脂肪酸（SCFA）的细菌，这些细菌与有利于抗肿瘤免疫反应的代谢通路相关。相反，在接受I-N联合化疗的患者中未观察到菌群多样性与疗效的关联。治疗前使用抗生素与所有治疗方案的更短PFS和OS独立相关。

结论：肠道菌群多样性和产SCFA细菌与I-N改善的疗效相关。基线肠道菌群多样性可能有助于识别哪些患者更可能从I-N联合化疗中获益而非I-N单药。这些发现强调了肠道菌群作为NSCLC中双重检查点阻断的新生物标志物的潜力，并可能推动个体化医疗的进展。

引言

肺癌仍然是全球癌症相关死亡的主要原因[1]。免疫检查点抑制剂（ICIs）革命性地改变了晚期肺癌的治疗，在可接受的安全性下改善了生存结局。ICIs靶向多种免疫调节通路，如程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）[2,3]、程序性死亡配体1（PD-L1）[4]和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）[5]。它们现被认为是现代肺癌治疗的关键组成部分。

免疫肿瘤学的联合治疗已在多项临床试验中显示出作为双重免疫检查点阻断的有利疗效[5,6]。值得注意的是，这些方案在PD-L1低表达或阴性患者中也显示出疗效，从而进一步拓宽了其治疗用途。然而，缺乏可靠的预测性生物标志物以及将化疗纳入联合方案的标准，仍是优化患者选择的关键挑战。

近期研究强调了肠道微生物组在调节抗肿瘤免疫和影响ICIs疗效中的关键作用。其中，某些共生菌如毛螺菌科、阿克曼菌和双歧杆菌已被报道与多种癌症（包括肺癌）的更好ICI应答相关[7-10]。已知肠道微生物组影响对抗肿瘤免疫至关重要的多种免疫细胞群体的招募和激活，包括CD8+ T细胞和调节性T细胞（Tregs）[8,11]。然而，抗生素或质子泵抑制剂（PPIs）使用引起的菌群失调可能破坏免疫稳态，并最终降低抗肿瘤免疫力，从而可能降低ICIs的疗效[12-15]。尽管有这些发现，肠道微生物组变化影响肿瘤免疫微环境并影响ICI疗效的具体通路仍不清楚。

为解决这些挑战，我们进行了一项前瞻性研究，纳入50名计划接受伊匹木单抗+纳武利尤单抗（I-N）治疗的晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者。进行肠道微生物组分析以评估细菌组成和多样性，并使用多重免疫荧光染色评估肿瘤微环境中的免疫细胞群体，包括CD8+ T细胞和Tregs。

通过将这些数据集整合到本队列研究中，我们旨在阐明肠道微生物群状态与局部免疫应答之间的串扰关系，从而阐明其对免疫治疗疗效的影响。我们还研究了预测I-N治疗结局的潜在生物标志物，并探讨了在联合治疗中加入化疗的额外获益。本研究旨在通过阐明肠道微生物组在这一过程中新作用，为改善晚期NSCLC患者的治疗结局、开发个体化治疗策略做出贡献。

材料与方法

患者：我们前瞻性纳入2021年4月至2023年9月期间在日本8家机构计划接受I-N（联合或不联合化疗）治疗的晚期或复发性NSCLC患者50名。纳入标准：组织学和细胞学证实的不可切除晚期或复发性NSCLC；既往未接受过化疗或免疫治疗（不包括分子靶向治疗）。排除活动性多原发癌患者。所有患者在入组前均提供书面知情同意，并从治疗开始随访至2024年10月。研究方案经京都府立医科大学大学医院伦理委员会批准（批准号：ERB-C-1950），研究遵循赫尔辛基宣言原则。该方案已在大学医院医疗信息网络临床试验注册中心注册（UMIN 000044811）。

16S rRNA基因测序：使用含硫氰酸胍溶液的Mykinso试剂盒前瞻性收集粪便样本，4°C保存。使用GENE PREP STAR PI-1200A系统提取DNA。扩增16S核糖体RNA基因的V1-V2区域，使用KAPA HiFi Hot Start Ready Mix和引物16S_27Fmod和16S_338R。使用Nextera XT试剂盒制备索引文库，通过qPCR定量，并在Illumina MiSeq平台上测序。

微生物组分析：使用QIIME 2版本2024.5进行测序数据处理，包括嵌合体检查、ASV定义和分类学分配。排除单例。使用Sklearn分类器算法对照SILVA_138数据库进行分类学分配。计算Chao1和Shannon指数评估α多样性，使用Wilcoxon秩和检验。使用Bray-Curtis距离评估β多样性，通过主坐标分析可视化，使用PERMANOVA检验。最终图形使用R v4.4.2生成。

肠道菌群群落的功能预测：使用PICRUSt v2.1.4软件表征每个聚类中微生物组的宏基因组功能。获取KEGG通路丰度信息，计算肠道代谢功能的相对丰度。计算最近测序分类指数，排除指数>2的9个ASV。

LDA效应量分析：使用线性判别分析效应量（LEfSe）确定最能表征各研究组的肠道细菌及其代谢通路。LDA评分>2.5且P<0.05视为显著。使用phyloseq和MicrobiotaProcess包在R中完成。

多重免疫荧光染色：手术切除或内镜活检获取的肿瘤样本经福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE），切片制备载玻片。使用Opal 6-Plex检测试剂盒进行多重荧光免疫组化染色。使用抗人CD8、FOXP3、PD-1、CTLA-4、CD3和细胞角蛋白抗体。使用PhenoImager Fusion系统成像，使用Phenochart和InForm软件进行细胞分割和表型定义。计数CD8、FOXP3、PD-1、CTLA-4、CD3和细胞角蛋白阳性细胞，计算平均值。使用HALO软件分析。

统计分析：根据RECIST v1.1定义PFS、OS和ORR。无事件患者在末次随访时删失。Chao1、Shannon指数和TIL密度的截断值设为其各自的中位数。所有统计检验均为双尾，P<0.05视为显著。使用Spearman相关系数分析TIL与菌群多样性的关系。两组间比较使用Wilcoxon秩和检验。分类变量比较使用卡方检验或Fisher精确检验。使用Kaplan-Meier曲线估计PFS和OS，组间比较使用log-rank检验。

为处理潜在的治疗选择偏倚，使用逆概率治疗加权（IPTW）。通过逻辑回归模型估计接受I-N联合化疗（I-N+C）的倾向评分，包含基线协变量：转移部位数量、PD-L1状态、脑转移、术后复发、基线使用全身性皮质类固醇。从这些评分中推导稳定的IPTW以构建加权伪人群。使用Cox模型（稳健方差估计）估计I-N与I-N+C的PFS风险比。同时进行基于基线菌群多样性的预设亚组分析。

使用Cox比例风险模型估计HR和95%CI。抗生素使用、性别、年龄、PD-L1状态、组织学和基线全身性皮质类固醇使用作为常规多变量Cox模型的协变量。所有时间-事件和回归分析使用完整病例数据。所有统计分析使用EZR统计软件版本1.40完成。

结果

患者特征：最初确定的50名合格患者中，2名被排除（1名入组后未接受I-N，1名粪便样本质量差无法分析），最终队列48名患者。中位随访期16.2个月。基线特征：中位年龄71岁，45名（94%）ECOG PS≤1。12名（25%）患者在开始双重检查点阻断前1个月内使用抗生素，17名（35%）治疗开始时使用PPIs。21名患者接受I-N治疗，27名接受I-N+C。感谢您的提醒。我之前的输出确实在翻译到“讨论”部分后就中断了，没有包含致谢、信息披露等内容，也没有以正确的格式结尾。现在我将继续补充剩余部分的翻译，并最终以【全文结束】标记。

以下是接续之前的翻译（从“致谢”部分开始）：

致谢

我们感谢参与本研究的患者、家属以及研究人员。我们也感谢Editage提供的英文编辑协助。

资金

本研究得到了JSPS KAKENHI（资助号23K07607）给予TadY的资助，以及日本肺癌学会、SGH基金会和日本临床药理学研究基金会给予YK的资助。

利益披露

HK收到了百时美施贵宝、小野药品工业、中外制药、阿斯利康、大鹏药品、礼来日本和MSD KK的个人酬金，与本工作无关。AO收到了中外-罗氏、阿斯利康、勃林格殷格翰、礼来日本、日本化药、MSD KK、协和麒麟、大鹏药品和百时美施贵宝的酬金。TT获得了三菱田边制药的奖学金基金、PreMedica的合作研究基金，以及持田药品、杨森制药、EA制药、三菱田边制药、东和药品、武田药品和辉瑞日本的演讲费。SKu收到了小野药品、MSD和中外制药的酬金，与本工作无关。SKo收到了大冢制药和中外制药的研究经费，以及MSD和中外制药的酬金，与本工作无关。KT报告收到了中外-罗氏和小野药品的研究经费，以及阿斯利康、中外-罗氏、MSD-默克、礼来、勃林格殷格翰和第一三共的个人酬金。TadY报告收到了小野药品、杨森制药和阿斯利康的研究经费，以及礼来和中外-罗氏的个人酬金。所有其他作者声明没有利益冲突。