工程化外泌体负载水凝胶在骨和软骨再生中的研究进展

亮点

外泌体负载水凝胶将生物信号传导与结构支撑相结合，显著增强了组织再生能力。
水凝胶提供可调节的、生物相容性基质，有效模拟细胞外环境。
先进系统包括基于亲和力的、响应刺激的以及3D打印的区域支架。
外泌体-水凝胶组合系统在骨和软骨修复方面明显优于单一疗法。
主要挑战包括外泌体异质性、可扩展性、监管障碍和成本问题。

摘要

外泌体负载水凝胶已成为骨和软骨再生的一种有前景的策略，它将外泌体的生物活性信号传导与水凝胶的结构支撑相结合。外泌体是纳米级细胞外囊泡，通过递送蛋白质、核酸和脂质介导细胞间通信。将外泌体整合到水凝胶中可以保护其免受快速降解，并实现损伤部位的持续、局部释放。水凝胶提供生物相容性环境，模拟细胞外基质并具有可调节的物理特性，支持组织修复。最新进展包括基于亲和力的和响应刺激的水凝胶，以及用于骨软骨应用的3D打印支架。临床前研究表明，与仅使用外泌体或仅使用水凝胶的系统相比，该组合系统显示出更优越的再生效果。然而，外泌体异质性、可扩展性和监管障碍等挑战仍然存在。外泌体工程和智能生物材料的持续创新有望加速临床转化。

引言

骨和软骨损伤仍然是全球主要的临床挑战，这是由于它们有限的内在再生能力以及与创伤、衰老和退行性疾病（如骨关节炎）相关的肌肉骨骼疾病负担日益加重。传统的治疗方法包括自体移植、同种异体移植、合成骨替代物和药物干预，虽提供部分解决方案，但存在严重缺陷。自体移植受到供体部位发病率和有限可用性的限制，而同种异体移植则存在免疫排斥和疾病传播的风险。同样，软骨修复技术如微骨折、马赛克成形术和自体软骨细胞植入常常导致纤维软骨而非透明软骨的形成，从而导致机械性能较差和长期效果不佳。这些限制凸显了迫切需要新的再生策略，以提供功能性和持久的组织修复。

近年来，再生医学已转向基于细胞的治疗，特别是使用间充质干细胞(MSCs)，因为它们具有分化为成骨和软骨谱系以及调节免疫环境的能力。然而，干细胞的临床应用受到低植入效率、不受控制的分化风险、致瘤性以及大规模生产和储存挑战等问题的阻碍。越来越多的证据表明，MSCs的治疗益处主要不是通过直接分化，而是通过分泌生物活性因子，特别是外泌体等细胞外囊泡(EVs)介导的。根据国际细胞外囊泡学会(ISEV)发布的MISEV2023指南，当无法明确确认确切的生物发生途径时，建议使用"细胞外囊泡"(EVs)这一通用术语。在许多研究中，"外泌体"这一术语历史上用于描述源自内体途径的小细胞外囊泡(30-150 nm)。在本综述中，术语遵循所引用文献中的用法。当研究根据CD9、CD63和CD81等外泌体标记物特异性表征囊泡时，使用"外泌体"这一术语。否则，使用更广泛的"细胞外囊泡"(EVs)术语来反映囊泡群体的异质性。

生物制造方面的最新进展，包括响应刺激的水凝胶和3D生物打印，已经扩展了外泌体-水凝胶复合物的潜力，实现了对释放动力学的精确定时空控制和针对特定缺陷的定制。在骨再生方面，此类系统在临界尺寸缺陷模型中展示了增强的成骨和血管生成，而在软骨修复中，它们促进了软骨保护和类透明软骨的恢复。尽管这些结果令人鼓舞，但仍存在若干转化障碍，包括外泌体分离和表征的标准化、水凝胶设计的临床应用优化以及监管审批途径。

本综述旨在全面概述工程化外泌体负载水凝胶在骨和软骨再生方面的进展。我们首先总结了肌肉骨骼修复的生物学原理和外泌体的治疗潜力。然后，我们讨论了作为递送载体的水凝胶的设计策略和特性，重点介绍了结合这两种技术的工程系统最新进展。最后，我们探讨了将这些有前景的生物工程平台从实验室推向临床应用的当前挑战和未来展望。

关键信号通路在骨和软骨再生中的作用

骨和软骨中的组织修复受到复杂信号网络的调控，这些网络调节干细胞命运、ECM沉积和血管生成。骨形态发生蛋白(BMP)通路：BMPs是TGF-β超家族的成员，是成骨分化的关键调控因子。BMP2和BMP7刺激MSCs向成骨细胞谱系承诺，增强矿化并促进血管生成。BMP信号传导还在软骨内骨化过程中促进软骨分化。MSCs

外泌体：生物学与治疗潜力

外泌体是由几乎所有细胞类型分泌的纳米级细胞外囊泡(30-150 nm)，作为细胞间通信的天然媒介(图1)。它们起源于内体系统，特别是通过多泡体(MVBs)的向内出芽形成，随后MVBs与质膜融合，将外泌体释放到细胞外空间。结构上，外泌体被脂质双层包裹，携带蛋白质、核酸(mRNAs, miRNAs等)等生物活性物质。

作为递送平台的水凝胶

水凝胶是三维亲水性聚合物网络，能够在保持结构完整性的同时保留大量水分。其高含水量、可调节的物理特性和生物相容性使它们成为生物医学应用的有吸引力候选者，特别是在骨和软骨组织工程中。对于基于外泌体的治疗，水凝胶作为保护性载体，不仅能在恶劣的微环境中稳定囊泡，还能促进它们的

工程化外泌体负载水凝胶：设计策略

将外泌体整合到水凝胶基质中代表了一种增强其在肌肉骨骼修复中治疗潜力的强大策略。虽然单独的外泌体存在快速清除和在损伤部位滞留率低的问题，但工程化水凝胶可以提供保护性环境，实现持续释放，甚至引导封装囊泡的生物活性。已开发出几种设计策略(见表2)来优化外泌体的加载和释放，范围从

骨再生应用的进展

与"软骨与骨再生的独特挑战"部分中描述的生物学特性一致，骨再生策略强调血管化和成骨。骨再生仍然是一个主要的临床挑战，特别是在大缺陷、骨不连以及骨质疏松症或糖尿病等愈合能力受损的情况下。传统的移植策略，包括自体移植、同种异体移植和合成支架，往往无法

软骨再生应用的进展

与骨相比，软骨的无血管特性和有限的再生能力("软骨与骨再生的独特挑战"部分)需要专注于软骨保护和表型维持的策略。由于软骨的无血管性、低细胞密度和有限的内在愈合能力，使其成为独特的再生挑战目标。在骨关节炎(OA)和创伤性软骨损伤中，促炎介质(如IL-1β, TNF-α)驱动软骨细胞

外泌体异质性与标准化问题

最大的科学障碍仍然是EV/外泌体的异质性：囊泡组成随细胞来源、培养条件(氧张力, 血清/xeno-free媒体), 和隔离方法每个转移大小分布, 膜蛋白, 和miRNA货物以改变效力和可重复性的方式。2023年国际细胞外囊泡学会指南(MISEV2023)编纂了关键质量属性(CQAs)和报告标准(身份, 纯度, 载荷, 和功能

未来展望

用于靶向治疗载荷的外泌体基因和化学工程。通过供体细胞的基因编程或化学/肽表面修饰来工程化外泌体，正在迅速提高它们在肌肉骨骼修复中的精确度和效力。表面配体(如肽/适配体)可以增强向骨软骨组织的归巢，而装载策略(电穿孔, 膜融合, 点击化学)使成骨和软骨再生载荷(miRNAs, ...)富集成为可能。遗传和化学工程外泌体用于靶向治疗货物。