摘要
高速脑部体积成像对于将各种细胞事件与组织层面功能联系起来至关重要。然而，大脑结构和动态的异质性——跨越微米到毫米以及毫秒到小时——需要具有可调节时空分辨率、灵活的3D采样以及与靶向扰动兼容的成像技术。本文介绍了可调谐贝塞尔光束双光子荧光显微镜（tBessel-TPFM），这是一个紧凑、低成本且多功能的平台，可实现亚细胞分辨率的毫米尺度活体脑成像。tBessel-TPFM通过轴向延伸的贝塞尔焦点，将缓慢的3D体积扫描转换为快速的2D帧扫描，与传统TPFM相比，实现了约100倍更快的采集速率并减少了运动伪影。利用贝塞尔焦点的完全可调性，我们将tBessel-TPFM应用于正常和缺血性中风小鼠的脑血流量和神经血管耦合的定量映射。与现有的贝塞尔焦点生成方法不同，tBessel-TPFM在轮廓调谐期间轴向中心保持固定在物镜焦平面上。利用这一优势，我们将tBessel-TPFM与同时进行的3D靶向光遗传刺激集成，用于体积神经元连接映射。我们还跟踪了单细胞激光消融后的微胶质过程动态，揭示了跨空间和时间尺度的多样化神经免疫反应。通过结合高速、深穿透、可调采样和多模态扰动，tBessel-TPFM为广泛的神经生物学研究提供了支持——从血管生理学到功能连接再到神经免疫相互作用。
引言
大脑的正常功能依赖于多种生物过程之间的动态相互作用。这些相互作用跨越空间和时间尺度，从分级血管网络中的血液流动和形成复杂电路的神经元之间的通信，到胶质细胞对损伤和病原体的持续监视。研究这些过程需要能够观察高度散射脑组织深处的体积动态。此外，每个过程都有其独特的成像需求。例如，血流动力学映射只需要中等的空间分辨率来可视化毛细血管，但需要达到千赫兹范围的采集速率来捕捉动脉和静脉中的快速血流。相比之下，微胶质动态成像需要亚细胞分辨率来识别精细过程，但只需要亚秒级的时间分辨率。一个多功能、经济高效的成像平台，能够在满足这些多样化需求的同时捕获脑内体积生物动态，可能促进神经科学、神经病学、脑免疫学和肿瘤学的发现。此外，将时空模式化的扰动整合到这样的平台中，将能够同时进行靶向干预和体积调查，为开发新型治疗策略提供广泛的影响。
近年来，已出现几种有前景的脑成像技术。功能磁共振成像提供全脑覆盖，但缺乏细胞分辨率。光学相干断层扫描能够在中等穿透深度提供无标记对比，但无法解析亚细胞结构。时间分辨激光散斑成像虽然提供更好的空间分辨率，但深度有限。光声成像可以穿透更深，但其深度依赖的分辨率使数据解释复杂化。
双光子荧光显微镜（TPFM）通过在三维（3D）体积中扫描空间受限的高斯焦点，可以在高度散射的脑组织中实现亚细胞分辨率。因此，TPFM已被广泛用于活体脑成像，揭示了从突触可塑性到胶质细胞-神经元相互作用的见解。然而，在所有三个维度上扫描焦点导致缓慢的体积采集。为解决此问题，已开发了远程聚焦、时空复用和投影成像等策略。值得注意的是，一种优雅的方法——贝塞尔光束TPFM——采用轴向延伸的贝塞尔焦点，将3D体积扫描转换为2D帧扫描，实现了视频速率的体积成像，具有衍射极限分辨率。尽管其优势明显，但当前贝塞尔光束生成方法限制了贝塞尔光束TPFM在生物医学研究中的广泛应用。基于单个锥透镜对的系统缺乏满足多样化脑成像需求的可调性。基于空间光调制器（SLM）的方法提供可调性，但价格昂贵，不兼容同时多波长激发，并且光损失严重。已报道了几种利用锥透镜组合的方法，但它们都在光束轮廓调谐过程中引入了贝塞尔光束的轴向偏移。这些不需要的焦点偏移需要频繁的系统重新校准，并阻止与同时光遗传刺激或激光消融的整合。
本文中，我们通过引入可调谐贝塞尔光束双光子荧光显微镜（tBessel-TPFM）克服了这些限制，这是一个紧凑、低成本、高效且多功能的平台，用于跨毫米尺度的亚细胞分辨率活体脑动力学成像。重要的是，tBessel-TPFM允许自适应调整贝塞尔光束的空间分辨率、体积覆盖和能量约束，以优化特定成像需求。利用这种可调性，我们定量测量了正常和缺血性中风小鼠中从毛细血管中缓慢血流到动脉和静脉中超快流动的脑血流量。通过实现焦点跳跃和横向平铺，我们实时监测了2500×2500×450 μm³皮层体积中毛细血管血流和直径变化，并在清醒小鼠中成像了跨皮层层的神经血管耦合（NVC）。此外，与现有方法不同，tBessel-TPFM在轮廓调谐期间保持贝塞尔光束的轴向中心在物镜焦平面上，从而实现与3D靶向光遗传刺激的整合，用于体积神经元连接映射。最后，通过结合高空间分辨率、快速体积采集和同时双光子扰动，我们跟踪了单细胞激光消融后微胶质过程的动态，揭示了快速的神经免疫反应。
结果
可调谐贝塞尔光束双光子荧光显微镜
与在3D体积中扫描轴向受限高斯焦点的传统高斯双光子荧光显微镜（Gaussian TPFM）不同（图1A，顶部），贝塞尔双光子荧光显微镜（Bessel-TPFM）通过在2D平面上扫描轴向延伸的贝塞尔光束来成像同一体积（图1A，底部）（Lu等，2017）。当贝塞尔光束长度与成像体积的深度匹配时，得到的图像对应于3D堆栈的2D投影，否则使用传统的高斯双光子荧光显微镜需要10–100个连续的z切片，因此通过单帧捕获整个体积，实现了采集速度提高10–100倍（Fan等，2020）。对于血管和神经元保持基本不变的血流动力学和功能成像，采用两步策略：首先，使用传统高斯双光子荧光显微镜获取高分辨率3D结构参考，然后使用贝塞尔双光子荧光显微镜进行动态体积成像（图1A）。贝塞尔双光子荧光显微镜的三个核心成像指标——空间分辨率、时间分辨率和结构重叠——在三角权衡中固有地相关联（图1B）。针对不同应用（如毛细血管流动与神经元活动）优化这些竞争性指标，需要能够独立调整贝塞尔光束特性。
在实践中，这些指标由贝塞尔光束的三个关键参数控制：横向分辨率、轴向光束长度和侧环约束。首先，由贝塞尔光束的数值孔径（NA）设置的横向分辨率决定了分辨精细结构的能力，但以速度为代价，因为更高的分辨率需要更小的扫描步长（图1B，左侧）。因此，最佳空间分辨率取决于任务：精细结构动态受益于更高分辨率，而超快流动测量则偏向更快的帧率。其次，由光束的NA和NA扩展（ΔNA）设置的轴向光束长度控制成像体积的深度覆盖，但以结构重叠为代价：较长的光束扩大深度覆盖但可能混淆紧密排列结构的信号（图1B，右侧）。第三，贝塞尔光束侧环增加了另一个约束：高NA、长贝塞尔光束产生显著的侧环激发，可能导致成像伪影（图1B，底部）（Chen等，2024）。
虽然存在几种可以调整横向分辨率、轴向光束长度和侧环约束的巧妙方法，但它们都存在一个关键限制：调整贝塞尔光束轮廓会使光束轴向位移，从而移动成像体积（图1-补充图1；Dickey和Conner，2011；Lu等，2018；Takanezawa等，2021）。虽然这种不需要的位移在某些成像应用中可以接受，但它迫使重新校准，使实验复杂化，并降低可重复性。此外，当成像与光遗传刺激或激光消融相结合时，它特别成问题，因为需要精确的刺激和成像体积配准（图1C）。因此，在调谐贝塞尔光束轮廓时最小化轴向位移是启用体积扰动-成像研究的核心要求。
为满足此要求，我们设计了一个紧凑的可调谐贝塞尔（tBessel）模块，可以轻松集成到传统高斯TPFM中（图1D）。为了广泛采用和高光效率，tBessel模块仅使用现成组件，避免可编程或衍射元件（图1-补充图2）。光学设计由三个主要部分组成。首先，锥透镜对（A1和L1）将准直光束转换为后瞳共轭平面上的聚焦环形光束——贝塞尔光束的傅里叶变换。其次，为了实现可调性，环形光束的直径和厚度——分别对应NA和ΔNA——需要可调整。我们的tBessel模块通过利用一对锥透镜（A2和A3，图1D）实现NA调谐，其中两者之间的分离控制NA。重要的是，改变此分离引入最小的相位变化（图1-补充图3和附录2），导致可忽略的轴向位移（图1E；图1-补充图2和图1-视频1，以及附录1）。为了实现ΔNA的独立调整，虹膜与物镜焦平面共轭（图1E；图1-补充图4和图1-视频1）。这种NA和ΔNA的解耦控制允许独立调整贝塞尔光束的空间分辨率和侧环约束（图1E和图1-视频1）。
接下来，我们通过实验表征了tBessel模块。首先，通过改变锥透镜对分离，贝塞尔光束的分辨率可以在与数值模拟密切一致的情况下进行调整（图1F）。定量地，空间分辨率与锥透镜对分离成反比，而轴向光束长度相应变化（图1G）。其次，改变虹膜孔径会改变ΔNA，如瞳孔轮廓图像所示，与数值模拟相匹配（图1H）。定量地，ΔNA与虹膜孔径成反比，轴向光束长度和侧环约束半径（定义为包含一半总功率的半径）均随虹膜孔径线性变化（图1I，图1-补充图5）。值得注意的是，在整个调谐范围内，实验和模拟结果在横向分辨率、轴向光束长度和侧环约束方面表现出良好一致性。最后，tBessel模块能够同时进行多波长激发——这是优于SLM方法的优势（Chen等，2014；Lu等，2017）。作为演示，我们同时生成了520 nm和635 nm贝塞尔光束，并观察到在宽NA范围内可忽略的色差（图1-补充图2）。这种最小的色差最小化脉冲激光色散，提高了荧光激发效率。
皮层范围血管动态和神经血管耦合的成像
tBessel-TPFM能够进行快速体积成像，但其轴向光束长度必须优化。过长的光束会导致结构重叠，从而掩盖信号定位，而过短的光束则无法充分利用其体积速度提升（图2A）。为了确定血管成像的最佳光束长度，我们量化了来自3D高斯-TPFM数据的不同皮层深度的轴向血管间距离（AIV）。伽马函数拟合揭示了深度依赖的AIV（图2-补充图1）。这突显了轴向光束长度灵活调谐的必要性。为了覆盖扩展区域，我们将tBessel-TPFM与横向平铺和压电驱动的轴向跳跃相结合。使用0.4 NA、150-μm长的贝塞尔光束，每次扫描覆盖700×700×150 μm³，耗时33毫秒。使用4×4横向平铺和三次轴向跳跃，我们拼接了48个体积，跨度2500×2500×450 μm³（图2B）。深度彩色编码重建显示了大型浅表血管（0–150 μm）和深层（150–450 μm）密集毛细血管网络，穿透性小动脉和小静脉清晰可见（图2C）。时间序列成像使血管舒张和收缩动态可视化（图2C和图2-视频1），为进一步研究神经血管耦合（NVC）提供了可能。
我们使用带有焦点跳跃的tBessel-TPFM研究了清醒小鼠初级视觉皮层（V1）中的NVC（图2D）。NVC将神经元激活与供应营养物质和清除代谢物的快速血流增加联系起来，其破坏与神经和精神疾病有关（Iadecola，2004；Kaplan等，2020；Kisler等，2017；Schaeffer和Iadecola，2021）。在视觉刺激期间，我们同时监测了神经元活动与GCaMP和跨皮层层的血管动态（Niell和Stryker，2008；图2D，图2-补充图2A）。从高斯参考堆栈（260×260×400 μm³）中，我们确定80 μm长、五次焦点跳跃的贝塞尔光束为最佳，平衡了成像速度和轴向重叠（图2-补充图2B，C）。在此配置下，我们在呈现移动光栅的同时，以3 Hz的频率成像神经元钙和血管动态。试验平均钙迹显示强烈的定向选择性（图2E，顶部）。为了评估血管反应，在成像平面上分析了15条跨越小动脉、小静脉和毛细血管的血管（图2D）。线切口的时空图揭示了小动脉中的明显舒张，但邻近小静脉中变化很小（图2E，中部；图2-补充图2E，F）。血管舒张始终滞后于神经元活动（图2E，底部），表明活动引起的血管反应。最大的舒张和最强的神经元-血管相关性出现在浅层（图2-补充图2G，H），尽管在深层穿透性小动脉中仍存在显著相关性（例如线9，图2-补充图2I）。
高速血流映射与可调时空分辨率
跨大范围脑体积空间映射快速血流的能力具有广泛影响（Anderle等，2025；Iadecola，2004；Kisler等，2017；Sweeney等，2018）。在血流动力学成像中应用时，tBessel-TPFM提供了两个关键优势：对抗轴向运动伪影的鲁棒性以及跟踪与焦平面成陡角度血管中血流的能力。首先，清醒小鼠中传统TPFM成像的关键挑战是运动伪影。虽然横向运动伪影可以轻松通过计算校正，但轴向运动——通常振幅为几微米——可以将结构移出高斯焦平面（图3-补充图1A）。我们在400×400 μm²视野内以30 Hz进行距软脑膜60 μm以下的2D时间序列成像（图3A）。代表性图像列的条纹图显示了零星但高振幅的波动，这是轴向运动伪影的特征（图3-补充图1B）。为进一步说明这些伪影，我们对20秒期间捕获的不同时间点的图像进行彩色编码并合并，揭示了高斯焦平面内外的大量结构位移（图3-补充图1C）。相比之下，由于延伸的轴向光束长度，轴向运动在tBessel-TPFM中引入了最小伪影（图3-补充图1D）。我们以30 Hz对相同视野使用0.4 NA贝塞尔光束进行成像，发现条纹图波动很小（图3-补充图1E和图3-视频1）。同样，彩色编码时间序列图像没有显示明显的结构位移（图3-补充图1F）。
接下来，我们证明tBessel-TPFM能够跟踪传统高斯-TPFM无法访问的血管中的血流。使用高斯光束，仅与焦平面几乎平行的血管提供足够的段长，以在约2 μm深度的焦点内测量流动。例如，需要15 μm的段长来解析高达15 mm/s的流动，将可用方向限制在焦平面的约7.6°内（图3-补充图1G）。对小鼠皮层血管方向的分析显示相对均匀的分布（图3-补充图1H），这意味着高斯扫描排除了约90%的血管（图3B，图3-补充图1I）。相比之下，我们具有延伸轴向光束长度的tBessel-TPFM可以捕获大范围方向的血管（图3B）。模拟证实，60 μm贝塞尔光束可以测量高达1.5 mm/s的血流，血管角度高达80°（图3-补充图1L和附录3）。
为评估tBessel-TPFM性能，我们在400×400×120-μm³皮层体积中成像罗丹明B标记的血管（图3C）。使用NA = 0.4以58 Hz，未标记的红细胞在条纹图中显示为暗条纹（图3C，图3-补充图1J和图3-视频2）。为了解决贝塞尔-TPFM的投影性质，我们手动追踪了3D高斯结构数据中的血流血管段，并测量了它们的3D长度（Fan等，2020；图3C，右侧面板；方法）。采集帧率设定了可测量流动速度的上限。在tBessel-TPFM中，降低NA可实现更快的成像，但分辨率降低。我们通过以NA = 0.4、0.6和0.8对同一区域进行成像，量化了这种分辨率-速度权衡。NA = 0.4以58 Hz实现成像，分辨率较粗，如点扩散函数（PSF）和光学传递函数（OTF）所示，而NA = 0.8在29 Hz下提供更高分辨率（图3D）。实际上，高NA、慢速扫描最适合捕获毛细血管，而低NA、快速扫描适合小动脉和小静脉（图3E）。通过使用我们的tBessel模块平衡分辨率与采集速度，我们映射了42条血管中的3D流动（图3F），并确认血流速度与血管直径呈正相关。
缺血性中风前后以千赫兹速率追踪血流
为了能够跟踪单个红细胞，空间分辨率不能无限降低。因此，虽然tBessel-TPFM在体积成像中提供10–100×速度提升，但最大可测量流动速度仍受2D帧扫描速率限制，通常为每秒几十帧（fps）（图3-补充图1K）。为了测量大直径静脉和小动脉中的超快血流动力学，我们以千赫兹速率实施了1D线扫描（图3G；Meng等，2022）。在此模式下，同步的光束-光束扫描将光束沿目标血管段来回驱动，直接生成条纹图（图3-补充图2A）。为验证此方法，我们将1D线扫描贝塞尔和高斯光束在同一血管（约20 μm水平跨度）上测量的流动速度进行了比较。未观察到显著差异（图3-补充图2B和C）。使用1D线扫描tBessel-TPFM，我们测量了小动脉中高达23 mm/s和静脉中11.7 mm/s的速度——比帧扫描限制高20倍（图3H）。值得注意的是，对于类似直径的血管，小动脉中的流动速度是静脉中的三倍。
最后，我们将1D线扫描tBessel-TPFM应用于小鼠缺血性中风模型，以研究光血栓形成前后血流动力学的变化（Labat-Gest和Tomasi，2013）。将玫瑰红腹腔注射，并通过靶向激光照射激活，诱导内皮损伤和血栓形成（图3I；材料和方法）。激光散斑成像证实了靶向皮层区域（约100 μm直径）血流的急剧减少，与已建立的缺血性损伤一致（图3-补充图3）。我们在光血栓形成前（图3J）和后（图3K）映射了1400×1400×140 μm³皮层体积中17条血管段的流动速度。为确保准确的条纹图构建，在每次会话前后获取3D高斯堆栈以提取血管长度（图3-补充图2E-J；材料和方法）。计算每个血管5秒内的中值流动速度。中风前，观察到高达23.0 mm/s的流动。中风后，几乎所有血管都显示出急剧减少，有时高达100倍（图3L）。这些结果表明，tBessel-TPFM具有可调分辨率和高速线扫描，为映射健康和病理状态下不同血管大小和方向的流动动力学提供了一个多功能平台。
与靶向光遗传刺激的体积神经元活动成像
神经科学越来越多地依赖于将靶向光学扰动（如光遗传刺激或微手术消融）与高速体积成像相结合的实验，以研究局部和网络级反应（Yang等，2018）。此类范式的严格要求是扰动光束和成像体积之间的精确定位配准（图4A）。现有贝塞尔模块难以满足此要求，因为调整光束参数会将成像贝塞尔光束的轴向中心相对于扰动高斯焦点移动（图1-补充图1），导致扰动和成像路径之间的错位。相比之下，我们的tBessel模块通过在光束调谐期间保持固定轴向中心，解决了这一挑战，确保贝塞尔成像体积在广泛参数范围内与高斯刺激光束保持对齐（图4B）。在轴向PSF中观察到的一些轻微不对称不是由于tBessel模块，而是由于输入高斯光束中的不均匀性（附录2）。为证明这一优势，我们将双光子光遗传刺激与体积钙成像相结合。高斯1040 nm光束将螺旋图案刺激传递给表达ChRmine的神经元，同时920 nm tBessel光束同时捕获跨越刺激部位上方和下方平面的196×196×80 µm³皮层体积中的钙动态（图4-补充图1；材料和方法）。首先获取高斯参考堆栈以选择刺激平面并校准光束对齐（图4C）。光遗传刺激可靠地引发靶向神经元中强烈的钙升高（图4D，神经元1），确认精确定位激活。重要的是，还观察到位于焦平面上方和下方的神经元中钙尖峰（图4D），反映功能网络反应，这些反应将被传统基于高斯的成像遗漏。交叉相关分析进一步揭示了这些神经元之间的潜在连接性（图4E），突显了tBessel-TPFM将靶向扰动与体内体积网络级读数联系起来的能力。
激光消融后的快速微胶质动态成像
最后，我们应用tBessel-TPFM监测靶向单细胞消融后的神经免疫反应。表达GFP的微胶质小鼠的血管用右旋糖酐-罗丹明B反向标记（图5A；材料和方法）。首先获取3D高斯参考堆栈（200×200×120 µm³），并选择一个平面用于微胶质单细胞的双光子消融（图5B和C）。消融后，使用120-µm长、0.7 NA贝塞尔光束以15 Hz进行10分钟的体积成像，以捕获微胶质过程动态（图5D）。为最大化可解释性同时最小化光损伤（Kong等，2007；Ji等，2008；Icha等，2017；Oracz等，2017），我们在仅足够识别微胶质过程快速扩展和收缩的低信噪比（SNR）下对微胶质动态进行成像。然后，我们基于最近开发的内容感知图像恢复（CARE）方法构建和训练了神经网络，以去噪低SNR图像（Weigert等，2018；图5-补充图1A-C；材料和方法），随后进行Richardson–Lucy去卷积（图5-补充图1D）。
消融后，邻近微胶质表现出快速反应：它们的胞体保持静止，但过程动态地向损伤部位延伸。值得注意的是，观察到两个不同的过程延伸波，第一个在消融后约4分钟到达，第二个在约9分钟时（图5E和图5-视频1）。对过程动态的详细分析显示，微胶质不仅向损伤部位延伸过程（图5F，顶部），还向损伤部位相反方向收缩过程（图5F，底部）。此外，前进的过程表现出探索性运动，探测周围环境而不是遵循线性轨迹。虽然先前的工作表明微胶质向损伤部位延伸过程而不迁移胞体（Davalos等，2005），但这些精细尺度的动态——包括双波反应、协调的延伸-收缩模式和快速局部探测——尚未被报道，因为先前的技术缺乏足够的时间分辨率来观察此类现象。
讨论
总之，我们开发了tBessel-TPFM，一个用于高速体积成像脑动力学的紧凑且多功能平台，具有独立可调的空间分辨率、轴向投影长度和稳定的焦点定位。tBessel模块实现了贝塞尔光束分辨率、成像深度和侧环激发的自适应调谐，优化了其性能，以适应跨越脑区和深度的异质血管结构和动态过程。至关重要的是，它解决了贝塞尔光束TPFM更广泛采用的两大障碍：现有实现的复杂性和缺乏可调性。除了提供对贝塞尔光束轮廓的完全控制外，该模块还具有高效光设计——无需衍射元件或光掩模——并且需要最少的仪器和编程，使其可供广泛用户使用。
与依赖昂贵的可编程SLM或缺乏可调性或引入贝塞尔光束不需要的轴向焦点位移的被动光学的传统贝塞尔系统不同，tBessel-TPFM使用仅现成的折射组件实现了无焦点漂移的完全光调谐。这种适应性使研究人员能够将成像参数匹配到特定结构——从精细的微胶质过程和毛细血管到大型血管和神经元集合——在单一平台上。中心稳定光束设计进一步实现了与光学扰动技术（包括光遗传刺激和激光消融）的整合，其中成像和刺激光束之间的精确配准至关重要。
我们展示了tBessel-TPFM在几个具有挑战性的脑成像应用中的广泛适用性。重要的是，我们tBessel-TPFM的中心稳定可调性使研究人员能够进行传统高斯-TPFM或先前贝塞尔-TPFM实现难以或不可能获得的生物观察。首先，通过根据脑血管结构和分布优化贝塞尔焦点长度，我们在亚毛细血管分辨率下实现了跨毫米尺度皮层体积的体积成像。这些观察使我们能够定量测量微毛细血管、小动脉和小静脉中的血流速度，以及直接观察清醒小鼠中的跨层NVC。扩展的贝塞尔投影与焦点跳跃和横向平铺相结合，实现了对皮层体积中血流和血管直径变化的快速映射。此外，千赫兹速率的高Bessel线扫描捕获了缺血性中风诱导前后大而陡角度血管中的超快血流。此外，该平台支持精确靶向光遗传学与体积读数，用于体积神经元连接映射。由于贝塞尔光束的轴向中心在NA调整期间保持固定，我们在所有光学生理学中实现了体积成像和全息光遗传刺激的稳定共配准，实现了对光诱发钙瞬变的可靠多平面读数。此外，我们执行了单细胞级激光消融后微胶质过程动态的快速跟踪，揭示了在~100 µm深度上精细的两相响应模式，这些模式很难用低速高斯-TPFM捕获。
展望未来，未来的发展可能包括闭环自动化，其中实时图像分析指导贝塞尔光束参数的动态优化。此外，与三光子激发（Wang和Xu，2020）和自适应光学（Hampson等，2021）的整合将扩展高分辨率脑成像到皮层下区域。此外，光学工程的进展——如新型非衍射光束设计——可能进一步缓解贝塞尔光束固有的空间分辨率、轴向覆盖和侧环激发之间的权衡（Chen等，2024）。尽管如此，即使在当前形式下，tBessel-TPFM已证明的能力已经为基础和转化脑科学开辟了重大机会，包括在神经退行性疾病模型中研究血管和免疫功能、调查神经血管和神经免疫耦合，以及开发靶向治疗策略。除了双光子显微镜外，tBessel模块的多功能可调性使其易于适应其他贝塞尔基模态，包括光片显微镜（Planchon等，2011）、光镊（Garcés-Chávez等，2002）和眼科（Khonina等，2020）。
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