摘要
血液生物标志物正迅速成为阿尔茨海默病(AD)诊断的重要工具。然而，目前需要更多可扩展的工具来覆盖99%未在专科医疗服务中就诊的早期认知障碍人群。最近一项研究验证了一种用于检测p-tau217和GFAP生物标志物的毛细血管血液采样技术。在本研究中，我们利用PROTECT研究项目表明，这些生物标志物在使用自测指尖采血方法收集时，与静脉血生物标志物以及174名认知正常、轻度认知障碍或阿尔茨海默病患者的认知和功能表现高度相关。这些标志物可与计算机化认知测试结合使用，以识别阿尔茨海默病最高风险人群。与p-tau217不同，GFAP生物标志物似乎与血管风险相关。患者反馈显示，毛细血管检测方法的接受度和可用性很高，证明了该技术的可行性。研究表明，毛细血管血液生物标志物可用于临床实践和临床试验中对不同阿尔茨海默病风险水平人群的分诊，并可在临床环境之外使用。
引言
血液生物标志物正越来越多地用于痴呆症的检测、诊断和监测。作为诊断标准的一部分，它们对于验证阿尔茨海默病(AD)的关键病理至关重要。最可靠的血液生物标志物是氨基酸217处的磷酸化tau蛋白(p-tau217)，在与淀粉样蛋白和tau PET的验证研究中，它显示出对AD病理的高检测准确性，目前已被FDA批准用于有认知症状并正在接受检查的患者。这些最新进展促进了更精细的概念和诊断标准的发展，如由AD引起的轻度认知障碍(MCI)，这些现在被视为临床试验和研究的黄金标准。其他血液生物标志物已被提议在诊断解释中起辅助作用，并可能提供有关疾病病理生理学的见解。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞增生和潜在神经炎症的标志物，已被证明与Aβ沉积、MCI向AD痴呆的进展、白质高信号的进展以及帕金森病的认知功能下降有关。
由于其相对于神经影像学和脑脊液采样的经济性和可行性，静脉血采样正越来越多地被纳入诊断路径。然而，它仍然需要患者前往专科诊所就诊。这是一个相当大的诊断障碍，也是临床试验中筛选失败的主要原因，因为在英国，目前只有千分之一的早期认知能力下降者能够获得专科医疗服务。这也是一个全球性现象，特别是在农村地区和临床基础设施欠发达的地区。因此，迫切需要能够在专科环境之外大规模使用的生物标志物检测方法。这种方法将具有变革性，能够实现高风险个体的分诊，为诊断流程提供新组件。它也将是支持有效识别适合参与临床前AD治疗试验的患者的宝贵资产。
目前，已开发出自测微流体血液采样技术，用于通过家庭指尖毛细血管血液收集在干血斑卡上测量AD血液生物标志物，包括p-tau217和GFAP。最近发表在《自然医学》上的DROP-AD研究在337名参与者中展示了该方法的可行性与验证，显示毛细血管和静脉血p-tau217之间存在显著相关性(r = 0.79)，并且重要的是，还提供了毛细血管p-tau217与脑脊液Aβ42/pTau181之间的验证(r = 0.86)。该研究还显示了对预先确定的Aβ-PET阈值的个体有较强的区分能力(r = 0.868)。研究表明自测的有效性良好，自测与诊所护士主导的测试之间有很强的一致性。
在这项研究中，我们考察了这种可扩展生物标志物技术作为在家完成并通过邮寄返回的自测毛细血管血液测试的潜在临床效用，以及在远程无人监管环境中用作分诊资源的潜在价值。本研究调查了174名认知正常或患有MCI或AD的人群中远程收集的血液p-tau217和GFAP与认知生物标志物的相关性。我们探讨了GFAP毛细血管生物标志物作为分诊工具的潜在价值，以补充p-tau217来识别AD风险人群和其他原因导致的进行性认知障碍人群。我们还确认了远程收集样本与静脉血测量值的同时效度，并探索了老年人的可接受性数据，以了解未来将其作为常规医疗一部分实施的可行性。
结果
队列特征
本研究共招募了226名患者，其中174名(77%)完成了血液测试套件(146名认知正常，28名痴呆患者)，作为英国PROTECT项目的一部分。参与者的平均年龄为66.03岁(标准差9.17)，93名(54%)为女性。p-tau217数据可用于143名参与者，GFAP数据可用于所有参与者。静脉血样本可用于40名参与者。
毛细血管p-tau217和GFAP与认知和功能的相关性
对整个队列的认知数据分析显示，毛细血管p-tau217和GFAP均与认知显著相关。毛细血管p-tau217与情景记忆(r = 0.299, P < 0.001)、注意力(r = 0.197, P = 0.019)和执行功能(r = 0.191, P = 0.021)显著相关。GFAP与工作记忆(r = 0.183, P = 0.034)和执行功能(r = 0.182, P = 0.046)显著相关。毛细血管p-tau217还与IADL(r = 0.293, P < 0.001)和IQCODE(r = 0.244, P < 0.001)两种功能测量相关，而GFAP与IADL(r = 0.230, P = 0.006)相关，但与IQCODE(r = 0.098, P = 0.243)不相关。在ROC分析中，毛细血管p-tau217和GFAP对有无痴呆的个体实现了显著区分(p-tau217 AUC = 0.656, P = 0.012; GFAP AUC = 0.688, P < 0.001)。
尽管ROC曲线显示了显著差异，但作为单一诊断测试还不够充分。然而，这里的目标是分诊，而非诊断。因此，进行了进一步分析，以确定每个测试预设的85%特异性(35%敏感性)阈值上下的认知差异(毛细血管p-tau217为0.016 pg/ml，毛细血管GFAP为12.45 pg/ml)。这些值分别识别了46名(26%)和29名(17%)参与者。ROC分析显示，血浆p-tau和GFAP能够稳健地区分落在毛细血管p-tau217(AUC = 0.785, P < 0.001)和毛细血管GFAP(AUC = 0.895, P < 0.001)定义的这些阈值上下的人群。
两种生物标志物在85%特异性阈值上下个体的两种功能测量中均显示出显著差异，对大多数认知和功能测量显示出具有强效应大小的显著差异。
为进一步探索毛细血管p-tau217作为分诊工具的潜在效用，p-tau217和记忆表现的分布图说明了双重阈值风险评估方法，识别出需要进一步诊断评估的高风险组(毛细血管p-tau217超过85%特异性阈值并符合标准化协议定义的记忆年龄相关认知衰退标准)和低风险组(低于85%特异性阈值且记忆表现高于标准差1个或以上)。高风险四分位数的个体在注意力速度、准确性和执行功能以及IADL和IQCODE两种功能测量上表现显著更差，与高风险象限外的个体相比，而低风险个体在所有领域表现显著更好。
毛细血管p-tau217和GFAP之间的关系
尽管p-tau217和GFAP均与痴呆和认知障碍显著相关，但在满足阈值标准的个体比较中，只有11名参与者(6%)对毛细血管GFAP和p-tau217均为阳性。
为进一步了解用两种生物标志物识别的个体之间的潜在差异，进一步分析探讨了生物标志物状态与心血管风险因素(心脏病和高血压)之间的关系。与GFAP阴性个体相比，GFAP阳性个体报告心脏病史的可能性几乎是前者的五倍，GFAP阳性个体报告高血压史的可能性增加了69%，但这一差异不具有统计学意义。p-tau217阳性对心脏病(P = 1.0)或高血压(P = 0.13)的可能性没有显著影响。
毛细血管和静脉血生物标志物的相关性
在具有静脉血样本的子组参与者(n = 40)中，静脉血和毛细血管p-tau217及GFAP之间的相关性在痴呆患者(r = 0.711, P < 0.001; GFAP: r = 0.79, P < 0.001)和非痴呆患者(r = 0.743, P < 0.001; GFAP: r = 0.700, P < 0.001)中均显著且稳健。
患者对检测的接受度和可行性
研究参与者对毛细血管血液测试过程的可接受性提供了反馈。他们的回应显示，参与者在家完成测试的依从性和意愿很高，80%的参与者无需任何帮助即可完成测试。78%的参与者表示，他们愿意在没有临床医生监督的情况下，将这些测试作为常规医疗的一部分远程完成。定性回应表明总体意愿较高，主要主题集中在过程的简便性和无痛性、对患者和医疗服务的潜在成本和时间节省，以及监测健康风险的潜在益处。
讨论
本文通过展示p-tau217和GFAP毛细血管标志物与认知和功能结果的积极关联，突显了其潜在的临床效用。该研究还证实了毛细血管和静脉血p-tau217及GFAP之间存在高且显著的相关性，展示了与DROP-AD研究最近报告的静脉血和脑脊液标志物相似的相关性，但将这种同时效度扩展到了远程自采并邮寄返回的毛细血管血液样本。此外，这些发现增强了患者对这项技术的信心，即作为通过邮寄返回的自测工具，在家远程使用是可接受和可行的。
与无痴呆者相比，痴呆患者的毛细血管p-tau217显著更高，并与认知表现和功能显著相关。ROC分析显示的结果与健康人群和痴呆人群之间的区分一致，从而对这种方法提供了信心。p-tau217的85%特异性阈值与DROP-AD研究中的最佳阈值一致，是推荐用于分诊的阈值，显示出对识别具有认知和功能障碍个体的更强区分能力。散点图和双重阈值进一步支持了这一建议，并表明p-tau217与计算机化神经心理学的结合有可能用于识别可能从更详细诊断评估中受益的高风险人群，以及不需要进一步支持的低风险人群。它还可以识别出将从持续监测中受益的中等风险人群。
该图表表明，毛细血管p-tau217 85%特异性阈值与情景记忆表现低于基准标准1个标准差的组合，是一种实用的方法，可用于识别潜在高风险人群，占参与者的9%，这些人群在认知和功能方面也表现出显著更高的障碍。重要的是，情景记忆障碍的这一阈值表明的障碍程度比识别轻度认知障碍(MCI)患者所需的1.5个标准差变化要轻得多，但与升高的毛细血管p-tau217结合，有可能对临床前障碍较轻阶段的人群进行分诊。识别高风险和低风险人群的双重阈值方法将使该技术能够更敏感地应用于分诊具有高优先级风险、需要持续监测以及不需要监测的个体。需要进一步工作来更好地表征中等风险人群，并确定在社区和初级保健中进行持续监测的最有意义的方法。
这项工作提出了提供一种远程分诊方法的潜力，通过简单的家庭测试识别可能生物标志物呈阳性且很可能存在认知和功能障碍的个体。经过进一步验证，这种技术可以改善临床前AD患者的分诊和评估的临床路径。目前，只有千分之一的早期认知障碍者接受专科评估。毛细血管p-tau217测试与计算机化神经心理学的结合提供了一种分诊方法，可能为接触社区中大量原本无法获得诊断或支持的个体提供一种直接、高效且具有成本效益的方法，并优化临床路径，以实现对最高风险个体的早期检测。需要承认的是，该技术的潜在效用是用于分诊，而非诊断，特别是由于风险阈值参数的敏感性较低。此外，还可以利用这种方法作为预筛选分诊步骤，提高针对临床前AD疾病修饰疗法的临床试验的效率，在这些试验中，筛选失败率通常高达90%。对于中等风险人群，建议进行持续的轻触式虚拟监测，这可以通过计算机化神经心理学的家庭监测实现，PROTECT项目在过去十年中已验证了这种方法。
该研究还考察了GFAP作为额外生物标志物筛查的潜在价值。出乎意料的是，尽管ptau217和GFAP都能识别出认知障碍的个体，但GFAP和p-tau217均为阳性的个体重叠很小，GFAP识别出了一组不同的风险人群。进一步分析表明，GFAP阳性与心脏病有关，并且GFAP升高的参与者表现出不同的认知障碍模式，注意力障碍更为明显。这些观察支持了GFAP可能识别出因血管因素和非AD原因的神经炎症而导致认知障碍风险个体的假设。在临床实践中，当临床医生试图识别所有原因导致的进行性认知障碍风险人群时，GFAP可能是一个有用的额外生物标志物。然而，对于专注于临床前AD的临床试验，单独使用p-tau217可能是首选的分诊解决方案。
本研究展示了显著的优势。无人监督的毛细血管测试在该领域是新颖的，这些发现为在健康和认知障碍个体队列中临床环境外的有效性提供了明确证据。关于毛细血管测试可接受性的定性发现进一步增强了这项工作的严谨性，为将其转化为现实世界应用提供了信心。然而，也有一些重要的局限性需要承认。尽管80%的参与者能够成功完成自测，结合PPI开发的视频和书面说明，但重要的是要进一步改进这些材料并提供额外的虚拟支持，以实现更高的完成率。此外，尽管毛细血管和静脉血p-tau217之间存在良好的相关性(>0.7)，但可能有机会简化收集和处理协议，以进一步提高同时效度。在GFAP分析中，心血管风险因素是通过单一自报告项目捕获的。这可以通过临床数据进行扩展，以提高准确性。需要进一步工作来复制和扩展这项工作，验证这些发现在独立队列中的适用性，确定毛细血管生物标志物的纵向预测价值，验证与淀粉样蛋白和tau配体的PET成像，并完善方法以逐步提高敏感性。建立与初级保健对接并整合到临床和临床试验路径中的分诊和监测流程也很重要。特别是，需要研究其单独或与计算机化神经心理学结合用作社区和初级保健中的分诊工具，以及作为改善临床试验招募的有价值方法。
方法
伦理批准和管理
本研究按照赫尔辛基宣言原则、良好临床实践指南和所有适用的监管要求进行。研究方案、参与者信息表和知情同意过程及文件已获得独立的国家卫生服务(NHS)研究伦理委员会批准(NHS REC London Bridge, 编号13/LO/1578; NHS REC Greater Manchester East, 编号24/NW/0151)。研究调查员获得同意，招募参与者，收集数据并遵守伦理标准。赞助方进行了集中监控，实施严格的伦理监督。
招募
痴呆患者通过英国西南部的初级和二级护理站点招募，并根据国家神经疾病和中风研究所及阿尔茨海默病及相关疾病协会(NINCDS-ADRDA)标准满足轻度至中度痴呆的标准，至少在两个认知领域存在损害，影响功能。认知健康的参与者通过全国性的PROTECT-UK老龄化队列使用已建立的在线和数字协议招募。所有参与者在招募时提供了自我报告的人口统计信息。参与者因参与研究未获得报酬。
血液生物标志物收集
所有参与者均在家或无人监督的环境中完成毛细血管血液收集套件。血液使用Capitainer® B50和SEP10 (Capitainer AB, Solna, Sweden)干血斑收集设备收集。参与者按照视频和书面说明，使用一次性采血针从中指或食指获取血液。70微升的毛细血管血液应用于设备并晾干，返回类似血浆的样本。干燥后，卡片在室温下储存，无需温度控制或冷却，邮寄至埃克塞特大学的中央研究团队，然后批量定期发送至瑞典哥德堡的神经化学实验室。卡片使用标准协议(Quanterix, Billerica, MA, USA)处理和提取。40名参与者的子集在诊所就诊时通过静脉穿刺提供静脉血样进行生物标志物分析，由经过培训的工作人员采集。样本在2000 rpm下涡旋30秒，并在20°C下以4000 g离心10分钟，在研究结束时批量分析。生物标志物分析使用单分子阵列(Simoa)技术完成，采用纯净协议(ALZpath Simoa® GFAP Assay)(Quanterix, Billerica, MA, USA)检测校准的p-tau217和GFAP水平。
计算机化认知评估
所有参与者在计算机或触摸屏设备上完成PROTECT认知测试系统。该系统包括记忆测试(延迟图片识别、配对联想学习、自我排序搜索、数字跨度)、执行功能(言语推理)和注意力(数字警觉、简单和选择反应时间)，可组合成四个综合结果，分别用于记忆、注意力准确性、注意力速度和执行功能。参与者在完成完整测试会话之前，依次完成每个测试的简短练习环节，以减少因系统定向而产生的练习效应。
健康和自我报告数据
所有参与者完成了Lawton日常生活活动量表(IADL)和IQCODE量表作为自我报告测量。他们还通过PROTECT平台上的病史问卷提供了关于高血压和心脏病等心血管风险因素的自我报告数据。参与者还在线完成了一份简短的调查，以记录他们在家使用毛细血管血液采样套件的体验，使用李克特量表回答，提供关于易用性、可接受性以及将套件作为常规医疗和监测一部分使用的意愿的信息。
统计分析
未排除任何数据进行分析。使用Spearman's R进行相关性分析，以评估静脉血和毛细血管生物标志物之间，以及认知和功能结果与毛细血管p-tau217和GFAP生物标志物之间的相关性。进行受试者工作特征分析，为每个生物标志物定义85%特异性阈值，确定使用血浆生物标志物区分低于阈值的个体，以及检查毛细血管生物标志物对痴呆的区分。独立t检验分析比较了85%特异性阈值上下个体的认知表现，以及基于p-tau217和记忆定义为高风险和低风险的个体与队列其余部分的比较。使用逻辑回归评估GFAP阳性与心血管风险因素之间的关系，调整年龄和性别。所有分析均使用IBM SPSS Statistics(版本29)和R统计软件(版本4.4.3)进行。所有分析均使用相同方法成功重现。
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