摘要
脑动脉瘤是一种导致严重脑卒中的脑血管疾病。其形成和破裂的特定细胞分子病理学尚不清楚。本研究对总共14个成人人类脑动脉瘤和11个对照血管的227,663个神经血管细胞（包括52,946个动脉瘤细胞）进行了分析。我们的人类脑动脉瘤图谱以及细胞分辨率的空间转录组学分析揭示，病理性脑血管重建伴随着结构支撑性平滑肌细胞的丧失以及活化血管周围成纤维细胞的出现，后者重新填充血管壁并表达多种与动脉瘤风险相关的基因。纤维化变化与成纤维细胞-髓系细胞信号通路相吻合，并有专门巨噬细胞的流入，这些巨噬细胞在非动脉瘤脑血管中很少见，并表达破坏血管结构的细胞程序。因此，我们揭示了疾病进展过程中脑血管纤维化与髓系炎症之间先前未知的相互作用，显著推进了我们对这一破坏性脑血管疾病细胞驱动因素和机制的理解，这将为转化医学发展提供依据。
主要内容
脑卒中是全球第二大死因。动脉瘤性蛛网膜下腔出血（aSAH）是一种尤其严重的脑卒中形式，其发生频率在缺血性脑梗死和自发性脑出血之后位列第三。大多数aSAH由囊状动脉瘤引起，这是大脑底部基底动脉环血管分支点处的囊状膨出。脑动脉瘤的发生是由于支持结构的丧失，如血管平滑肌细胞或细胞外基质（ECM）蛋白，这可能是由遗传因素、环境因素和血流模式引起的。动脉壁进一步的弱化可能导致破裂，造成脑内或蛛网膜下腔出血。来自人类脑动脉瘤样本的分子分析揭示了细胞外基质重塑和炎症参与了疾病发展过程中的共同通路；然而，不同类型细胞在人类脑动脉瘤进展过程中发生的特定分子变化尚未完全理解。
单细胞和单核RNA测序（scRNA-seq和snRNA-seq）技术最近已定义了人类脑血管的细胞类型组成，并阐明了动静脉畸形中的免疫相互作用。在本研究中，我们使用单细胞和空间转录组学技术调查了人类脑动脉瘤中发生的细胞组成和转录程序变化。我们的结果显示了活化的血管周围成纤维细胞和一种特殊的巨噬细胞群在动脉瘤病理进展中的先前未知的作用。这一人类脑动脉瘤图谱和机制研究为理解人类脑动脉瘤提供了重要认识，有望为未来转化医学发展提供指导。
解构人类脑动脉瘤
目前，大多数脑动脉瘤通过血管内治疗处理，不需要组织获取。手术病例中的活检通常仅限于几毫克的组织，这使得单细胞基因组学的应用具有挑战性。我们利用四个高量治疗中心的专业知识，对八名接受神经外科治疗的患者分离的未破裂脑动脉瘤组织进行了scRNA-seq或snRNA-seq分析。我们基于共识建议使用了两种对照组织：手术获取的软脑膜皮层血管（n = 5）和尸检获得的非动脉瘤基底动脉环动脉（n = 3）。新鲜组织通过已建立的技术分离以进行scRNA-seq（n = 2个动脉瘤和n = 5个对照供体）。为扩展对动脉瘤队列的分析，我们对新鲜冷冻动脉瘤组织（n = 6个供体）和非动脉瘤后脑动脉（n = 3个供体）进行了snRNA-seq。经质量控制后，我们从总共八个动脉瘤和八个对照供体中获得了37,560个高质量的动脉瘤转录组（n = 21,531个细胞；n = 16,029个核）。转录组通过Harmony进行计算整合，以考虑样本制备的差异，并与使用类似技术制备的对照脑血管细胞（n = 59,520个细胞，n = 3,329个核）聚类，以指导注释并促进不同条件下细胞特异性比较（n = 100,409个转录组）。
我们确定了19个转录上不同的细胞群体，包括6个脑血管、9个免疫和4个邻近神经胶质-神经元细胞群体。每个细胞群体在多个供体中都有代表。此外，使用10x Genomics Xenium平台进行的基于细胞的空间转录组学，该平台对数百个基因应用高度多重荧光原位杂交，与空间基因组学的最佳实践相结合，用于正交地分割所有分子定义的脑血管细胞群体及其血管周围免疫生态位在独立的非动脉瘤颅内动脉（n = 3个供体，111,868个分割细胞）和未破裂脑动脉瘤（n = 6个供体，15,386个分割细胞）中。我们空间定位了所有六个先前鉴定的脑血管群体，以及四个免疫细胞群体，包括两种血管周围巨噬细胞群体，支持该检测方法能够解决在动脉瘤和匹配的基底动脉环对照中发现的血管和血管周围细胞群体身份的能力。正如预期的那样，我们没有空间定位到任何神经胶质-神经元细胞群体或通常在脑实质中发现的其余五个免疫细胞（小胶质细胞）或循环（例如树突状细胞、B细胞、自然杀伤细胞），因为动脉瘤和基底动脉环对照标本在进行空间转录组分析前已基本清除残留的实质和血液产物。细胞分割和空间引导的簇注释准确识别了细胞，其标志基因表达谱与单细胞分析中最初定义的相符，确认我们的细胞注释捕获了单细胞数据中最初定义的相同转录程序。因此，我们提供了人类脑动脉瘤细胞组成的细胞和空间图谱。
脑动脉瘤中的血管细胞类型特异性变化
环境和遗传因素可通过改变脑血管细胞的组成和基因表达导致脑动脉瘤形成。为了解这些变化的细胞水平，我们首先比较了细胞图谱中对照和动脉瘤组织样本间的细胞组成。脑动脉瘤显示了特定血管细胞群体的显著耗竭，特别是平滑肌细胞。通过原位细胞分辨率空间转录组学和免疫染色进一步证实了脑动脉瘤中平滑肌细胞的减少。相比之下，血管周围成纤维细胞更加普遍，并在动脉瘤中取代了大部分血管壁。这是由于在脑动脉瘤中特异性出现的POSTN+血管周围成纤维细胞导致的，这些细胞在对照脑动脉中很少见。通过严格的批量RNA-seq解卷积分析（n = 16个对照脑动脉；n = 43个动脉瘤），我们同样观察到动脉瘤中POSTN+血管周围成纤维细胞的富集。空间转录组学和定量免疫染色进一步证实，POSTN+血管周围成纤维细胞在脑动脉瘤中显著增加（P < 0.05），并发现它们主要分布在血管壁的中膜层，即血管平滑肌细胞的正常细胞架构位置。
随后，我们分析了对照和动脉瘤中血管细胞的特异性基因表达。通过在扰动图谱中进行转录组范围差异表达分析（TRADE）的刀切抽样，量化了每个血管细胞群体在动脉瘤与对照之间的转录扰动程度。该分析提供了转录组影响评分，这是一个每个细胞的指标，将每个动脉瘤细胞与其最相似的匹配对照细胞进行比较，并总结全局差异表达信号。因此，转录组影响评分提供了动脉瘤病理对细胞相对于对照的扰动影响的估计。使用此框架，血管周围成纤维细胞随后是平滑肌细胞，具有最大的转录扰动，支持血管周围细胞群体在动脉瘤中最受影响。血管周围成纤维细胞上调了促纤维化细胞外基质基因，如胶原蛋白，例如COL3A1和SPARC（编码骨膜蛋白），这些在原位已通过空间基因表达得到验证。纤维化从细胞架构上被定义为细胞外基质成分的过度生产和沉积，我们通过组织学和原位基因表达进一步确认了脑动脉瘤中的纤维化。细胞分辨率通路分析还揭示了与多个血管稳定通路相关的基因同时下调，包括成纤维细胞衍生的平滑肌调节级联、平滑肌收缩蛋白和生长以及屏障促进的内皮Wnt信号。动脉瘤血管细胞也显示与基础炎症相关的基因表达水平升高，如白细胞趋化性、抗原处理和呈递以及趋化因子产生。综上，这些数据表明在脑动脉瘤的血管壁内广泛存在纤维化和炎症，并为脑动脉瘤中血管不稳定提供了细胞类型特异性分子基础。
脑动脉瘤遗传风险的血管细胞贡献者
可遗传的遗传变异是脑动脉瘤形成的重要贡献因素。全基因组关联研究（GWAS）已确定了候选脑动脉瘤风险位点，并将之前确定的几个基因映射到内皮细胞。然而，这些研究使用了不包含其他血管细胞的非动脉瘤细胞数据集，主要来源于小鼠。因此，我们探究了人类中其他血管细胞的潜在遗传贡献是否可能被忽视。
我们整理了GWAS脑动脉瘤风险基因，并在我们的细胞普查中映射其表达。几个脑动脉瘤风险基因显示出细胞特异性表达模式，包括先前发现在内皮细胞中表达的两个基因，SOX17和FDG。值得注意的是，其他脑动脉瘤风险基因在POSTN+血管周围成纤维细胞中表达富集，包括BCAR1、PSMA4和P4HA2，支持这些细胞在脑动脉瘤中的潜在病理作用。为进一步优先排序与GWAS风险位点相关的动脉瘤关联细胞群体，我们采用了两种互补的全基因组方法：MAGMA，测试多基因风险位点是否在每个细胞类型伪批量表达谱中高表达的基因周围富集；scPagwas，通过基因通路在单细胞水平上聚合多基因风险位点。使用来自大规模GWAS研究的汇总统计数据（n = 10,754个动脉瘤和n = 306,882个对照），两种分析都确定了POSTN+血管周围成纤维细胞和平滑肌细胞与脑动脉瘤显著相关（错误发现率（FDR）< 0.05），进一步提名这两种血管周围细胞类型对动脉瘤的遗传易感性极高。scPagwas中识别的顶级特征相关通路包括平滑肌细胞中的细胞衰老（hsa04218；P < 0.001）以及POSTN+血管周围成纤维细胞中的促免疫和纤维化通路，如Toll样受体（hsa04620；P < 0.001）和TGFβ信号（hsa04350；P < 0.001）。总之，我们的数据支持除了内皮细胞外，多种血管细胞类型，包括平滑肌细胞和POSTN+血管周围成纤维细胞，对脑动脉瘤的遗传风险有贡献。
脑动脉瘤中的成纤维细胞活化
成纤维细胞活化发生在其他人类心血管疾病中，最明显的是心脏病。POSTN是已建立的成纤维细胞活化标志物，因此我们探索了活化的血管周围成纤维细胞在脑动脉瘤中出现的血管周围成纤维细胞活化是否有助于脑动脉瘤中POSTN+血管周围成纤维细胞的出现。使用已建立的成纤维细胞活化转录特征，我们在脑动脉瘤的细胞图谱中发现该特征在POSTN+血管周围成纤维细胞中高度富集，而在其他血管周围成纤维细胞群体中则不明显。基因组范围的空间转录组学进一步确认了这种成纤维细胞活化特征的原位表达。对细胞图谱中成纤维细胞群体的富集生物过程比较表明，POSTN+血管周围成纤维细胞具有功能特化。特别的是，POSTN+血管周围成纤维细胞在免疫和伤口反应通路中富集。值得注意的是，还在提示其在血管钙化中的作用方面存在富集，这种现象在许多脑动脉瘤中观察到。相比之下，我们还确定了一个独特的LAMB1+成纤维细胞群体，在平滑肌和收缩基因程序中富集，与伤口愈合和纤维化重塑过程中后期阶段典型的肌成纤维细胞样状态一致。
为进一步了解脑动脉瘤中血管周围成纤维细胞活化的转录程序，我们将细胞图谱中鉴定的三种成纤维细胞状态沿一维伪时间轴排序。对统计上随伪时间轨迹变化的基因的无监督计算支持血管周围成纤维细胞从静止到活化的转录连续体。在这一轨迹的早期，我们发现了一个基因模块，其在免疫反应相关的基因中富集，如SFRP2和FAP，这些已在其他免疫介导疾病中的病理性成纤维细胞转换中得到证实，如系统性硬化症和类风湿性关节炎。相比之下，后期的轨迹基因模块在肌生成和收缩性基因中富集，与伤口愈合的肌成纤维细胞样状态的获得一致。为确定脑动脉瘤中血管周围成纤维细胞活化的调节因子，我们将SCENIC应用于我们的细胞图谱，该工具推断基因调控网络和转录因子，以鉴定POSTN+血管周围成纤维细胞中特异性富集的转录因子。锌指蛋白GLIS2是POSTN+血管周围成纤维细胞中富集最显著的转录因子，该因子也与常染色体显性多囊肾病有关，这种情况的脑动脉瘤风险升高。在人类原代脑血管周围成纤维细胞中（而非平滑肌细胞中）过表达GLIS2，重现了POSTN+血管周围成纤维细胞活化基因特征，包括POSTN、FAP、SFRP4和THY1的表达增加。因此，血管周围成纤维细胞活化与病理性细胞转换相关，这些转换在转录上与其他人免疫介导疾病中的其他人类心血管疾病相似。
我们的数据表明，POSTN+血管周围成纤维细胞可能通过GLIS2的诱导从静止血管周围成纤维细胞衍生而来，GLIS2是一种锌指转录因子，先前已在常染色体显性多囊肾病中得到证实，该疾病具有升高的脑动脉瘤风险。体内谱系追踪研究表明，血管周围成纤维细胞和周细胞谱系细胞可在神经学损伤后对纤维化细胞外基质沉积做出贡献并进行肌成纤维细胞样转换，对病变背景的贡献各不相同。未来使用体内谱系追踪方法的工作将有助于确认POSTN+血管周围成纤维细胞的细胞来源及其在脑动脉瘤中的出现时间。
脑动脉瘤中的炎症和特化髓系细胞
髓系驱动的炎症在脑动脉瘤的形成中起着关键作用。使用我们的人类动脉瘤细胞图谱，我们基于典型基因标志物表达对免疫细胞群体进行了分类。总体而言，我们确定了九个免疫细胞群体。五个免疫细胞群体由髓系细胞组成，包括血管周围巨噬细胞（pvMφs）、常规树突状细胞（cDCs）和单核细胞（Mo）。每个典型免疫亚群的标志物基因谱与它们在神经免疫学中的既定作用相符，例如小胶质细胞调节突触功能和树突状细胞主要组织相容性复合体II类介导的抗原呈递。与之前报道一致，细胞分辨率通路富集分析显示广泛的促炎和效应程序激活，如趋化性、抗原处理和淋巴细胞介导的细胞毒性，同时免疫细胞群体中血管稳定通路（如伤口愈合、细胞粘附和屏障完整性）降低。
值得注意的是，我们确定了一种独特的髓系细胞群，该群体高度共同表达ACP5（编码酒石酸抗酸磷酸酶5（TRAcP））和巨噬细胞（Mφ）标志物CD68。ACP5+ Mφs在人类脑血管中未被发现，这些细胞在脑动脉瘤中更加丰富。免疫染色证实了TRAcP+ Mφs在动脉瘤中的存在，而在对照中原位很少见。值得注意的是，TRAcP+ Mφs由于ACP5的表达而具有与破骨细胞相似的转录特征，但高分辨率免疫染色显示它们不是多核的。因此，我们确定了一种在人类脑动脉瘤或其他脑血管疾病中先前未被认识的ACP5+ Mφ群体。
免疫细胞降解细胞外基质蛋白或促进血管细胞死亡，这有助于脑动脉瘤的生长和/或破裂。因此，我们想知道ACP5+ Mφs是否对这些动脉瘤不稳定细胞程序有所贡献。已确立的细胞外基质降解基因产物或平滑肌细胞死亡的诱导因子，如MMP9和SPP1，是ACP5+ Mφs的前五个细胞标志物基因之一，并且在该细胞群体中的表达高于其他免疫细胞。标志物基因的通路富集分析进一步支持了ACP5+ Mφs的功能特化，包括免疫激活、吞噬和细胞外基质不稳定级联的富集。
动脉瘤破裂和蛛网膜下腔出血
对于某些脑动脉瘤，不稳定的细胞程序进展可能导致动脉瘤变脆，最终破裂，导致蛛网膜下腔出血，称为动脉瘤性蛛网膜下腔出血（aSAH）。50%以上的患者死亡，aSAH是成人突发死亡的重要原因。因此，了解导致动脉瘤破裂的细胞机制具有高度医学重要性。
为探索与动脉瘤破裂相关的细胞病理学，我们利用细胞图谱确定了与动脉瘤破裂相关的有害细胞群体。使用批量RNA-seq解卷积分析对之前报告的未破裂（n = 21）和破裂动脉瘤（n = 21）队列（以下简称"Kleinloog"队列），我们发现破裂动脉瘤中ACP5+ Mφs富集而平滑肌细胞减少（P < 0.01）。作为正交验证，我们对非动脉瘤中脑动脉（n = 4个供体）、未破裂（n = 5个供体）和破裂（n = 5个供体）动脉瘤进行了TRAcP+（TRAcP由ACP5编码）细胞的免疫染色，以量化浸润的TRAcP+细胞数量。与我们的体外预测一致，我们发现随着疾病进展，TRAcP+细胞数量显著增加，TRAcP+ Mφs在破裂动脉瘤中最为丰富（P < 0.01）。因此，ACP5+ Mφs的浸润在破裂脑动脉瘤中变得更为普遍。
接下来，我们应用了一种计算方法，称为Scissor，将批量RNA-seq表型数据与我们的单细胞转录组数据集成，以确定与动脉瘤破裂最相关联的细胞状态。Scissor使用批量RNA-seq数据中的表型信息，并评估单细胞参考中跨细胞的转录相似性，以识别表型相关细胞，而无需作为中间步骤的差异基因表达分析。因此，从Kleinloog等人批量RNA-seq数据（破裂与未破裂动脉瘤）计算了动脉瘤破裂的转录签名，然后映射到我们完全来自未破裂脑动脉瘤的单细胞测序数据。在分析的100,409个细胞中，Scissor算法确定了1,677个与动脉瘤破裂正相关的细胞和4,681个与动脉瘤破裂负相关的细胞，分别称为破裂相关细胞和未破裂相关细胞。如预期的那样，破裂相关细胞在脑动脉瘤中频繁被识别，具有高统计置信度（超几何检验，P < 0.01）。大多数破裂相关细胞在髓系细胞群体中被识别，特别是ACP5+ Mφs（P < 0.01）。相比之下，破裂相关细胞在血管细胞中很少见，仅限于血管周围成纤维细胞群体。随后的差异基因表达分析比较破裂相关和非选择ACP5+ Mφs显示，破裂相关ACP5+ Mφs在促炎信号程序中功能富集，包括趋化因子和细胞因子信号传导以及巨噬细胞激活。总之，这些数据强调了ACP5+ Mφs在动脉瘤破裂中的潜在作用。然而，未来的研究需要更好地确定这些发现是动脉瘤破裂的原因还是结果。
脑动脉瘤细胞改变的自然史
人类脑动脉瘤在其生命周期中经历多个阶段，例如稳定、平滑壁动脉瘤与具有破裂风险的不规则、增大的动脉瘤。因此，我们调查了在此发现的动脉瘤相关细胞，例如POSTN+血管周围成纤维细胞和ACP5+ Mφs，是否在动脉瘤进展过程中发生。我们对Kleinloog队列的批量转录组进行了伪时间分析，以沿疾病严重程度的分子定义的连续谱对样本进行排序（n = 16个对照；n = 21个未破裂动脉瘤；n = 21个破裂动脉瘤）。这种无监督分析基于已知诊断和/或严重程度正确对样本进行排序（P < 0.01）。通过绘制我们发现与动脉瘤相关的细胞类型的关键细胞特征得分，我们观察到与未破裂动脉瘤相关的POSTN+血管周围成纤维细胞的早期峰值，而ACP5+ CD68+ Mφs在疾病轨迹后期增加，与破裂相关。相反，平滑肌细胞在整个疾病轨迹中减少，与之前的报道一致。我们通过免疫染色证实了平滑肌细胞和POSTN+血管周围成纤维细胞的轨迹，在独立队列中（n = 4个对照；n = 5个未破裂；n = 5个破裂）。因此，驱动纤维化和炎症的不同血管周围细胞群体的变化在脑动脉瘤的疾病进展过程中始终存在。
讨论
在此，我们报告了基于100,409个单细胞/核和127,254个空间分割细胞的人类脑动脉瘤细胞景观和转录扰动。我们揭示了病理性脑血管结构转换的细胞决定因素，定义了选择性细胞易损性的分子标志，包括血管周围成纤维细胞中GWAS风险基因的表达和病理性转录程序，并扩展了在脑动脉瘤中被认可的浸润免疫细胞范围，如独特的ACP5+巨噬细胞。综合起来，这些分析揭示了与疾病进展和动脉瘤破裂的潜在联系。数据可通过
脑动脉瘤的形成与内皮功能障碍、平滑肌细胞丢失和炎症相关。尽管纤维化已在脑动脉瘤中观察到，但对纤维化背后的细胞机制及其对动脉瘤病理的贡献在很大程度上未被探索。我们确定了在动脉瘤组织中出现的活化的POSTN+血管周围成纤维细胞，取代了通常由平滑肌细胞构成的细胞架构位置。POSTN+血管周围成纤维细胞表达驱动与脑动脉瘤发病机制相关的过程的基因，如细胞外基质重塑，并与其他人免疫介导疾病中有害的成纤维细胞转换共享分子特征。通过取代收缩性平滑肌细胞，POSTN+血管周围成纤维细胞可能还将动脉瘤壁力学转向胶原主导的负载承载，增加刚度，降低拉伸强度和生理可延展性，最终降低血管爆裂抗性；然而，未来实验研究需要确定POSTN+血管周围成纤维细胞是否促成动脉瘤发展和进展，或只是对平滑肌细胞丢失的继发反应。
我们的数据表明，POSTN+血管周围成纤维细胞可能通过GLIS2的诱导从静止的血管周围成纤维细胞衍生而来，GLIS2是一种锌指转录因子，先前已与常染色体显性多囊肾病相关联，该疾病与脑动脉瘤风险升高相关。小鼠体内的谱系追踪研究表明，血管周围成纤维细胞和周细胞谱系细胞可在神经学损伤后对纤维化细胞外基质沉积做出贡献并进行肌成纤维细胞样转换，对损伤背景的相对贡献各不相同。未来工作将需要使用体内的谱系追踪方法来确认POSTN+血管周围成纤维细胞的细胞起源及其在脑动脉瘤中出现的时间进程。
我们的结果还揭示了血管内皮腔界面以外的血管和免疫细胞类型之间增加的通讯。纤维化通常是由慢性炎症引起的，我们在动脉瘤壁中发现了ACP5+ Mφs的积累，这些细胞在脑血管或动脉瘤性蛛网膜下腔出血以外的其他脑血管疾病（如动静脉畸形）中很少见。转录上相似的巨噬细胞已在其他动脉瘤（如主动脉瘤）中报道。我们将这些细胞识别为分泌性血管不稳定酶的主要来源，并将它们与脑动脉瘤破裂相关联。在其他人类纤维化疾病（如特发性肺纤维化）中，ACP5+细胞也有助于纤维化进展。我们发现血管周围成纤维细胞-髓系细胞通讯轴支持脑动脉瘤中纤维化和炎症之间类似的相互作用。细胞间通讯分析和细胞培养实验验证确定了MIF-CD74信号通路可能调节ACP5+ Mφs在动脉瘤进展过程中的积累，我们推测，一种被忽视的血管周围成纤维细胞-髓系细胞通讯轴可能与脑动脉瘤导致aSAH的风险相关。
本研究并非没有局限性。由于中风风险，无法在术中获取来自基底动脉环的完整皮层动脉段。基于之前对动脉瘤组织基因表达谱的基准实验，我们使用由小型皮层血管和尸检动脉标本组成的对照组。因此，解剖位置或尸检条件的差异可能导致相对细胞丰度和/或基因表达的某些改变。动脉瘤组织活检仅能从接受显微手术治疗的动脉瘤中获取，可能会引入选择偏差，因为某些特性使动脉瘤更适于手术夹闭。最后，动脉瘤组织样本通常只有几立方毫米大小，与单细胞基因组学分析中其他样本相比，细胞输入相对有限。因此，这项研究可能不足以检测稀有细胞群体的病理性细微分子贡献，这强调了未来需要在更大、更多样化的患者队列中进行研究。
尽管如此，我们的结果提供了脑动脉瘤的细胞图谱，目前这种疾病尚无治疗方法，治疗取决于观察或高风险的外科干预。本研究提供的分子蓝图显著扩展了我们对脑动脉瘤的机制理解，并提名了新的细胞和通路，这些具有治疗开发的转化前景，可用于治疗这种通常致命的人类脑血管疾病。
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