摘要
背景/目的：作为生物活性细胞外囊泡，外泌体参与细胞通讯和疾病机制，但其结构复杂性持续挑战标准分析方法。本综述总结了报告健康个体血浆、血清和富血小板血浆中外泌体浓度的已发表研究，并强调方法学差异。方法：通过PubMed数据库进行全面检索（1986年-2025年8月31日），使用与外泌体及其定量相关的术语，排除癌症和疾病相关研究。符合条件的文章使用粒子计数技术（如纳米粒子追踪分析、流式细胞术或可调电阻脉冲传感）报告血浆、血清或富血小板血浆中外泌体浓度。结果：22篇文章（含167名健康供体）符合纳入标准。报告的平均浓度范围如下：血浆（n=18），4.50×10^8至6.70×10^11 particles/mL，不同定量方法存在差异；血清（n=10），5.30×10^8至2.13×10^11 particles/mL；非激活富血小板血浆（n=1），7.52×10^9 particles/mL；激活富血小板血浆（n=3），4.87×10^10至7.16×10^10 particles/mL；经光热生物调节预处理的富血小板血浆（n=2），2.53×10^11至2.99×10^11 particles/mL。结论：分离和定量方法表现出高度变异性，强烈影响外泌体总体数量和质量。开发验证方法时必须考虑货物组成、纯度和外泌体完整性等特性。新兴证据表明光热生物调节预处理可增加细胞外泌体释放。严格标准化方案对推进外泌体疗法的科学理解和临床潜力至关重要。
关键词：外泌体；细胞外囊泡；定量；分离方法；富血小板血浆；光热生物调节
1. 引言
细胞外囊泡（EVs）是大小在30至2000纳米之间的球形磷脂双层结构。几乎所有细胞类型都分泌EVs，它们存在于大多数生物流体中，包括血液、尿液、唾液、母乳、支气管灌洗液、脑脊液和羊水。根据大小、来源、组成和功能，EVs可分为外泌体、微囊泡（MVs）和凋亡小体。外泌体参与正常生物功能和疾病过程，直接促进细胞通讯、免疫反应和肿瘤扩散。
外泌体含有生物活性物质，包括蛋白质、脂质和遗传信息，如mRNA和非编码核糖核酸（RNAs），包括微RNA（miRNAs），其外层还显示额外的蛋白质。生物发生和外泌体递送的过程发生在多泡体与质膜融合时。然而，这一过程背后的分子机制仍不清楚。外泌体释放受多种物理和化学因素以及细胞条件的影响，包括脂多糖、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ、低氧水平、钙、化疗药物暴露、温度和氧化应激。
1.1 外泌体临床应用
由于其生物相容性、低免疫原性和能够穿越血脑屏障，外泌体在临床应用方面引起广泛关注。研究的主要领域之一是再生医学，在组织修复和再生方面取得有希望的结果，包括癌症、骨科、肺再生医学、眼科、毛发再生和脑部疾病领域。外泌体在癌症、心血管、神经、自身免疫和传染病的诊断和预后方面也具有潜力，通过微创程序实现。此外，它们能够递送特定生物标志物货物和调节免疫反应，使其成为潜在治疗剂。外泌体可将靶向治疗递送到特定细胞或组织，克服传统递送方法的局限性。例如，它们正被探索用于开发基于外泌体的疫苗。
尽管取得进展，仍存在若干挑战。关键问题包括优化分离和纯化方法，以及关于外泌体货物稳定性和生物利用度的担忧。此外，与基于外泌体的诊断和治疗相关的监管环境仍在发展中。
鉴于这些考虑，准确检测和定量至关重要。然而，其大小和结构的复杂性即使对黄金标准方法也构成挑战。分离和RNA纯化技术的变异性常导致不一致数据，阻碍研究结果可比性。
1.2 外泌体分离方法
当前外泌体分离方法包括超速离心（UC）、超滤（UF）、沉淀、基于免疫亲和的捕获（IAC）和微流体技术。
超速离心（UC）：UC通过顺序离心，基于大小和密度从生物样本中分离外泌体。初始低速旋转去除细胞和碎片，随后超速离心（>100,000× g）沉淀外泌体用于进一步分析。
超滤（UF）：UF使用具有定义孔径的膜基于大小分离外泌体。通常，较大孔径去除碎片，而较小孔径（50-200纳米）保留外泌体并排除较小分子。
沉淀：该技术使用聚合物（如聚乙二醇）降低外泌体溶解度，诱导聚集。在4°C下孵育后，通过低速离心收集外泌体。
基于免疫亲和的捕获（IAC）：IAC使用针对特定外泌体表面蛋白的抗体，能够选择性、高纯度地分离细胞类型特异性亚群，包括肿瘤来源的外泌体。
微流体技术：这些方法基于大小、亲和力或两者组合分离外泌体。基于大小的分离包括微过滤技术，使用微孔将较大颗粒与外泌体分离；尺寸排阻色谱，通过微流体通道分离外泌体；以及粘弹性，利用流体弹性特性分离颗粒，将较大碎片推离外泌体。
1.3 外泌体定量方法
外泌体快速高效定量的主要方法包括纳米粒子追踪分析（NTA）、流式细胞术（FCM）、可调电阻脉冲传感（TRPS）、电子显微镜、动态光散射（DLS）、基于微流体的检测、表面等离子共振（SPR）和单粒子干涉反射成像传感器（SP-IRIS）。
纳米粒子追踪分析（NTA）：NTA通过追踪激光照射液体样本中外泌体的布朗运动来量化外泌体。记录散射光，软件根据单个轨迹计算粒子大小和浓度。
流式细胞术（FCM）：FCM使用专门的流式细胞仪分析荧光标记的外泌体和微囊泡，实现多参数检测和定量。
可调电阻脉冲传感（TRPS）：TRPS测量单个外泌体通过纳米孔时电阻的变化，确定粒子大小、浓度和电荷。
电子显微镜（EM）：特别是透射电子显微镜提供高分辨率图像以计数单个囊泡并评估其形态。TEM确认样本纯度和结构完整性，通常与其他技术结合使用。
动态光散射（DLS）：DLS通过用激光照射样本并测量由囊泡布朗运动引起的散射光波动来量化外泌体。
基于微流体的检测：微流体设备使用集成的芯片上分析从少量液体样本中分离和分析外泌体。分离可使用尺寸排阻色谱、免疫亲和或介电泳进行，实现对30-150纳米囊泡的选择性检测。
表面等离子共振（SPR）：SPR通过检测当外泌体结合固定化抗体时折射率的变化来量化外泌体。
单粒子干涉反射成像传感器（SP-IRIS）：SP-IRIS使用带有功能化抗体的特殊芯片从流体样本中捕获单个囊泡来量化外泌体。
在选择外泌体分离或定量方法时，必须考虑成本、所需时间和每种方法的特定优缺点。例如，某些方法可能在其计数中包括非外泌体粒子，影响结果准确性。
表1. 外泌体分离和定量技术的潜在缺点，包括获得的粒子数量、完整性和特异性。
| 分离方法 | 缺点 |
|---|---|
| 超速离心（UC） | 高速可损伤外泌体。UC可导致机械损伤，难以维持外泌体的生物活性和形态完整性。 |
| 超滤（UF） | 外泌体纯度中等。外泌体可能因膜损伤而丢失，损害其与靶细胞结合和通讯的能力。 |
| 沉淀 | 与非外泌体污染物（包括蛋白质和聚合材料）共同沉淀。常见污染物包括残留蛋白质、脂质和聚合物，可能保留生物活性，导致关于外泌体介导过程的错误结论。 |
| 基于免疫亲和的捕获（IAC） | IAC可能损害外泌体的功能能力。 |
| 微流体技术 | 由于生物样本复杂性、外泌体与其他EVs的尺寸重叠以及外泌体异质性，该方法敏感性较低且分离的外泌体纯度较低。 |
| 定量方法 | 缺点 |
| --------- | ------ |
| 纳米粒子追踪分析（NTA） | 该方法也测量非外泌体污染物。NTA无法区分EVs与其他粒子（如脂蛋白）。 |
| 流式细胞术（FCM） | 当样本中较小囊泡浓度高且散射或荧光信号超过检测限时，较小囊泡被计为单个粒子。 |
| 可调电阻脉冲传感（TRPS） | 对较小外泌体不敏感，较小囊泡被计为单个粒子。 |
| 动态光散射（DLS） | 该技术无法分析异质性外泌体群体。 |
| 表面等离子共振（SPR） | 难以区分特异性和非特异性相互作用，存在质量敏感性和传感器区域限制。 |
| 单粒子干涉反射成像传感器（SP-IRIS） | CD81的检测限为3.94×10^9，CD63为5.07×10^9 particles/mL。 |
除了外泌体的自然生物发生外，还研究了改变其产生的不同方法。这些方法基于电刺激、药理剂、电磁波、声波、剪切应力、细胞饥饿、酒精、pH值、热量和基因操作。然而，这些策略中的许多可能改变外泌体特性和功能性，且导致这种增加的确切机制通常未知。提高外泌体生产和生物功能对促进其临床应用至关重要。
鉴于健康个体人类血浆、血清和富血小板血浆中外泌体浓度报告的变异性，本综述旨在总结可用数据并突出方法学差异，这些差异突显了标准化操作程序和准确协议的必要性。
2. 材料与方法
文献搜索在PubMed数据库中进行，涵盖从1986年（人类外泌体第一篇文章发表年份）到2025年8月31日的研究。搜索查询包括"外泌体"或"细胞外囊泡"等关键词，与"粒子"或"particles/mL"（以识别定量数据）以及"浓度"或"定量"和样本类型描述符（"血浆"，包括富血小板血浆，或"血清"）组合。为专注于健康供体，排除了与"癌症"或"转移"等相关记录。纳入标准限于来自健康供体的人类样本数据，血浆、血清或PRP中外泌体定量，以particles/mL表示。
3. 结果
"外泌体"或"细胞外囊泡"的搜索产生35,044篇文章。在将"血清"、"血浆"或"富血小板血浆"、"浓度"或"定量"以及"粒子"或"particles/mL"的搜索结果与"外泌体"或"细胞外囊泡"的搜索交叉后，共获得126篇文章。在直接Google搜索中，包含三篇文章。移除超出范围标题的文章后，选择84篇文章进行最终审查。深入分析正文后，选择22篇文章，涉及约167名健康供体，其中18篇文章中有29次血浆中外泌体定量，4篇文章中有10次血清中，1篇文章中有1次非激活PRP中，1篇文章中有3次用不同激活剂激活的PRP中（葡萄糖酸钙、凝血酶和凝血酶加葡萄糖酸钙），以及2次预处理PRP中（蓝光467纳米，1.0 J/cm²，37°C；以及蓝光467纳米，2.0 J/cm²，37°C）。
血浆中外泌体的平均浓度范围为4.50×10^8至6.70×10^11 particles/mL。按定量方法分层，平均浓度范围为FCM的3.50×10^6至1.50×10^10 particles/mL，NTA的4.50×10^8至6.70×10^11 particles/mL，以及TRPS的9.05×10^8至4.36×10^10 particles/mL。血清中通过NTA评估的平均外泌体浓度范围为5.30×10^8至2.13×10^11 particles/mL。非激活PRP的纳米流分析外泌体平均浓度为7.52×10^9 particles/mL。激活PRP样本（包括所有激活方法）的外泌体平均值范围为4.87×10^10至7.16×10^10 particles/mL，预处理PRP为2.53×10^11至2.99×10^11 particles/mL；所有评估均通过NTA进行。
表3. 健康供体人类血浆样本中报告的外泌体浓度。
| 作者年份 | 样本类型 | N | 分离方法 | 定量方法 | 平均浓度 (Particles/mL) |
|---|---|---|---|---|---|
| Božič 2019 | 血浆 | 3 | — | FCM | 3.50×10^6 |
| Woud 2022 | 血浆(供体组) | 36 | NA | FCM | 1.26×10^8 |
| Yim 2023 | 血浆 | 6 | — | nFCM | 1.50×10^10 |
| Marić 2024 | 血浆 | 20 | UC | NTA | 3.95×10^10 |
| Wang 2024 | 血浆(对照组) | — | EXODUS | NTA | 4.82×10^10 |
| Kong 2023 | 血浆 | 5 | 无分离 | NTA | 1.78×10^11 |
| 5 | SEC-PF | NTA | 9.02×10^10 | ||
| 5 | DGUC-SEC | NTA | 1.51×10^9 | ||
| Weber 2023 | 血浆(健康供体) | 10 | SEC | NTA | 1.15×10^9 |
表4. 健康供体人类血清样本中报告的外泌体浓度。
| 作者年份 | 样本类型 | N | 分离方法 | 定量方法 | 平均浓度 (Particles/mL) |
|---|---|---|---|---|---|
| Zhang 2022 | 血清 | 6 | UC | NTA | 4.23×10^10 |
| Małys 2021 | 血清 | 3 | Exo-spinTM | NTA | 4.98×10^10 |
| 3 | DUC | NTA | 9.90×10^10 | ||
| Soares 2018 | 血清 | — | TEI | NTA | 5.30×10^8 |
| — | ExoQ | NTA | 5.40×10^8 | ||
| — | ExoS | NTA | 6.90×10^8 |
表5. 健康供体人类富血小板血浆样本中外泌体定量的数据。
| 作者年份 | 样本类型 | N | 分离方法 | 定量方法 | 平均浓度 (Particles/mL) |
|---|---|---|---|---|---|
| Cordero 2025 | 预处理自体PRP(蓝光467nm,1.0J/cm²,37°C) | 3 | UC | NTA | 2.99×10^11 |
| 预处理自体PRP(蓝光467nm,2.0J/cm²,37°C) | 3 | UC | NTA | 2.53×10^11 | |
| Rui 2021 | PRP加生理盐水 | 3 | UC | 纳米流分析 | 7.52×10^9 |
| PRP经葡萄糖酸钙激活 | 3 | UC | 纳米流分析 | 5.85×10^10 | |
| PRP经凝血酶激活 | 3 | UC | 纳米流分析 | 4.87×10^10 | |
| PRP经凝血酶和葡萄糖酸钙激活 | 3 | UC | 纳米流分析 | 7.16×10^10 |
4. 讨论
外泌体分析仍然具有挑战性。虽然浓度常被强调，但它并非外泌体质量或生物相关性的可靠指标。其他参数如样本纯度、外泌体完整性和货物的功能意义可能更为关键，且在样本类型和方法学方法间差异很大。这种变异性使研究间比较复杂化，强调了标准化操作程序的必要性，这些程序不仅定义分离和定量策略，还定义评估外泌体质量的标准。
确定治疗性EVs的最佳剂量对最大化治疗效果至关重要。剂量定义策略必须考虑囊泡浓度和制备的定性属性，包括分离技术、粘度、温度及样本收集时间等。确保一致的生理产生和适当储存对临床应用至关重要，特别是当患者来源的外泌体质量或数量可能随疾病进展而下降时。
现有外泌体分离和定量方法具有优势，如高纯度（尺寸排阻色谱）、快速处理（聚合物沉淀、微流体技术）、灵敏度（动态光散射、表面等离子共振）和直接计数（纳米粒子追踪分析、流式细胞术），但也存在技术限制或高成本。这些限制可能导致计数低估或高估，甚至导致准确计数但外泌体功能完整性受损。例如，在血浆样本中，纳米粒子追踪分析通常报告的计数高于可调电阻脉冲传感或流式细胞术。纳米粒子追踪分析和流式细胞术计数粒子，而动态光散射测量光散射强度。因此，在解释外泌体定量报告时需谨慎。
最小化研究间定量变异的一种方法是结合不同技术，利用各自优势并减轻弱点。例如，结合超速离心与尺寸排阻色谱可改进结果。各种方法的组合可有效减少纳米级污染物，提高纯度而不改变外泌体天然特性。其他研究者提出新策略，如二分尺寸排阻色谱，用于外泌体分离，获得更高产率。外泌体也可通过CD9-HPLC-IAC和未触动分离来分离。尽管如此，纯度、产量和回收率仍是持续挑战，协议应保留外泌体的天然物理化学环境。
除了方法学优化外，还可通过细胞激活或预处理技术（如光生物调节和光热生物调节）在外泌体分离前增强外泌体产生。关于间充质干细胞来源外泌体的研究证实，蓝光增强血管生成，可能通过调节特定miRNAs。经光热生物调节处理的预处理PRP样本暴露于455-470纳米范围（蓝光）有效增加外泌体分泌率，与PTBM PRP样本数据一致，这些样本表现出最高外泌体浓度，特别是与激活PRP相比。研究表明光生物调节增强毛乳头中外泌体分泌、促进内皮细胞再生并显著增加EV产量。较低通量（1.0 J/cm²）显著增加外泌体计数。这些干预突显了在保留囊泡特性的同时最大化产量的潜力。
解释这些发现时需考虑几个局限性。首先，目前无健康人类血浆、血清或PRP中外泌体浓度的参考值。其次，所包括研究在方法和技术上表现出高度异质性。即使使用相同方法（如超速离心），具体协议也不同，使研究间比较复杂化。第三，研究数量相对较少且样本量有限，降低结论稳健性。第四，可能存在发表偏倚。最后，仅包括英文发表并在PubMed中索引的文章，可能遗漏相关研究。
5. 结论
分离和定量方法表现出高度变异性，强烈影响外泌体总体数量和质量。开发验证方法时必须考虑货物组成、纯度和外泌体完整性等特性。新兴证据表明光热生物调节预处理可增加细胞外泌体释放。严格标准化方案对推进外泌体疗法的科学理解和临床潜力至关重要。
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