在药物开发流程中，大多数有潜力的肿瘤药物都失败了，即使在体外阶段有令人期待的疗效数据。因此，确定能更好地重现肿瘤生物学的体外模型至关重要。
二维（2D）细胞培养仍然是药物筛选的主要方法，但它在生理相关性上不如三维（3D）培养。
三维细胞建模在测定重现性、可扩展性和成本方面存在问题，这阻碍了其在药物发现领域作为主要筛选方法的广泛应用。
来自 3D 模型的生物学读数通常仅限于一个或少量特征，无法完全捕捉肿瘤样体的复杂生物学性质。
基于图像的表型分析，如细胞绘图测定，在各种应用中越来越常见，以定量捕捉化合物诱导或基因扰动引起的广泛表型变化。
在这项研究中，利用患者来源的 3D 球体（肿瘤样体）进行了筛选。除了细胞活力的读数外，细胞绘图测定也适用于 3D 肿瘤模型。
这些肿瘤样体由从患者来源的肿瘤外植体 TU-BcX-4IC 分离的原代细胞形成。该外植体代表了化生性乳腺癌的三阴性乳腺癌亚型。
用来自美国国立卫生研究院（NIH）批准的肿瘤药物库的 168 种化合物处理肿瘤样体。采用细胞绘图来促进对相关表型变化的评估。
同时还并行进行了基于图像的活力测定的单特征读数以进行比较。
基于表型距离得分共确定了 24 个命中。该得分通过主成分分析（PCA）计算得出。
三分之二的命中与基于图像的活力测定的命中重叠。这些结果表明，细胞绘图是一种可行的额外且重要的 3D 细胞模型分析方法。
方法
细胞培养
生成肿瘤样体和患者来源的异种移植器官样体（PDXO）的方法已经很成熟（Matossian 等人，2021）。在这种情况下，原代肿瘤样本被植入到 SCID/Beige 小鼠中。它显示出快速的肿瘤生长，并在 14 天内达到最大肿瘤体积> 1000 mm³。
然后从该样本生成细胞系，并在 2D 培养中扩增，而肿瘤样体则由在 2D 中扩增的 4IC 细胞形成。将约 2000 个 4IC 细胞分配到每个孔（在 U 形低附着 384 孔板[Corning]中），随后孵育 48 小时，直到它们形成紧密的肿瘤样体。
所得的 4IC 细胞在添加了 NEAA、2 mM 谷氨酰胺、葡萄糖和 120 μg/L 胰岛素、10％FBS（Gibco 12491-015）的 Advanced DMEM 中培养。对于代谢测定，肿瘤样体在含有 DMEM + 10％透析血清（2 mM 谷氨酰胺、5 mM 葡萄糖，不含酚红）的培养基中培养。
球体监测和成像
荧光图像的透射光（TL）在 ImageXpress® Confocal HT.ai 高内涵成像系统（Molecular Devices）上使用 MetaXpress® 高内涵图像分析软件获取。
使用共焦模式的 10x 或 20x 物镜在 TL 中获取肿瘤样体图像，大约偏移 60 µm，而 Z 层叠图像则使用共焦模式获取。使用 MetaXpress 或 IN Carta® 图像分析软件进行分析。
细胞绘图测定和数据分析
对于细胞绘图测定 17a - 20，使用 Bray 等人修改的方案标记 3D TU-BcX-4IC 肿瘤样体。将肿瘤样体与 MitoTrackerDeepRed（500 nM）（目录号）孵育两小时。
样品用 HBSS 中的 4％PFA 固定 1 小时。每个洗涤步骤通过在每个孔中用 HBSS 交换一半体积来进行。这样做是为了尽量减少肿瘤样体从孔中心的位移。
固定后，样品随后用 HBSS 洗涤三次。为了进行透化，样品在室温下与 0.1％Triton X-100（在 HBSS 中）孵育 2 小时，然后用 HBSS 洗涤。
染料在 HBSS 和 1％BSA（wt/vol）中制备，然后与以下终浓度孵育过夜：鬼笔环肽 750（15 μl/ml）、Hoechst（15 μg/ml）、伴刀豆球蛋白 A - 488（250 μg/ml）、Syto14（7.5 μM）、WGA（3.75 μg/ml）。
结果
球体培养和成像
3D 癌症培养从原发性三阴性肿瘤开始。通过在 SCID 小鼠中传代原代组织，然后使其适应 2D 细胞培养来开发细胞系。
将 2000 个细胞在 384 孔低附着板中培养 48 小时形成肿瘤样体。然后用来自美国国家癌症研究所（NCI）批准的抗癌药物库的化合物处理肿瘤样体。使用了五个浓度进行测试（图 1）。
高内涵成像和癌症球体分析
用五种不同浓度的化合物处理肿瘤样体（图 2），然后根据细胞活力进行筛选。还量化了包括总细胞数、肿瘤样体面积和荧光强度在内的表型读数。
基于深度学习的无标记图像分析分割
使用 IN Carta 软件可以调整图像分析程序，以实现对感兴趣对象的稳健检测（图 3）。可以使用深度学习语义分割模块（SINAP）来改进对具有挑战性特征的检测。
开发了一个新模型来分割在透射光下获取的癌症球体图像。然后从超过 200 个特征（来自所有七个成像通道）中导出球体分割掩码。
结果
3D 球体表型分析中的细胞绘图
为了更深入地研究所测定化合物引起的细胞毒性机制，同时进行了其他分析方法，以充分表征已检测到的表型变化。细胞绘图测定适用于 3D 肿瘤样体，以评估化合物对肿瘤表型的影响（图 4）。
数据分析工作流程
通过 IN Carta 软件获得的测量结果随后上传到 HC StratoMineR 进行进一步的数据分析。StratoMineR 是一个基于网络的平台，可以在分析高内涵多参数数据时指导用户完成典型的工作流程（图 5）。
结论
结果表明在患者来源的肿瘤样体等 3D 细胞模型上使用细胞绘图测定的可行性。
在球体水平的表型分析足以识别具有细胞毒性和非细胞毒性作用的化合物。
致谢
由 Molecular Devices LLC 的 Angeline Lim、Prathyushakrishna Macha 和 Oksana Sirenko、Protein Fluidics, Co 的 Evan F Cromwell、Tulane University 的 Margarite D Matossian、Courtney K Brock 和 Matthew E Burow 以及 CoreLife Analytics 的 Victor Wong、David Egan 和 Wienand Omta 最初创作的材料制作而成。
关于 Molecular Devices UK Ltd
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最后更新：2024 年 9 月 24 日 5 时 05 分
