乌干达HIV感染者和未感染者中B细胞亚群与亚临床冠状动脉疾病之间的关联 - 心脑血管

摘要

背景：HIV-1感染者（PLWH）的心血管疾病（CVD）风险增加，受慢性炎症、免疫失调和抗逆转录病毒治疗（ART）的影响。B细胞调节免疫反应，但其对HIV相关动脉粥样硬化的贡献尚不清楚。

方法：在一项横断面研究中，我们在乌干达招募了40名PLWH和60名未感染HIV者（PWoH），按年龄和CVD风险1:1.5匹配。通过质谱流式细胞术分析外周血单个核细胞以定义免疫细胞亚群。冠状动脉CT血管造影通过节段狭窄评分（SSS）量化冠状动脉疾病。我们使用多变量障碍回归评估免疫簇、动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）风险评分、HIV状态和性别的效应大小。

结果：中位年龄60岁，HIV状态间无差异。与PWoH相比，PLWH的CCR7-幼稚B细胞比例较低（中位1.5% vs 1.8%；校正P值[padj]=0.03）。在所有参与者中，更高的CCR7-幼稚B细胞（比值=0.55，P=0.02）、CXCR3+CX3CR1+B细胞（比值=0.54，P=0.03）和浆母细胞（比值=0.57，P=0.003）与更低的SSS相关。HIV阳性状态与近3倍更高的SSS相关（P<0.01）。在分层分析中，经典单核细胞（CD14+CD16-）与PLWH中更高的SSS相关。当经典单核细胞固定在中位数时，更高的CCR7-幼稚B细胞在PLWH中具有保护作用（比值=0.55，P=0.02）。

结论：这项探索性研究表明，PLWH中幼稚B细胞频率降低与亚临床动脉粥样硬化的差异有关。但本研究无法推断其机制。

心血管疾病（CVD）是全球发病率和死亡率的主要原因，在HIV-1感染者（PLWH）中负担更高 [1]。这种增加的风险是由传统CVD危险因素、ART相关代谢效应和持续免疫激活共同驱动的 [2]。尽管ART有效，但PLWH仍存在残留炎症和免疫失调，导致动脉粥样硬化 [3]。

虽然T细胞和单核细胞在PLWH动脉粥样硬化中的作用已被广泛研究，但B细胞逐渐被认为是血管炎症的关键调节因子 [4, 5]。幼稚B细胞在慢性HIV感染期间减少 [6-8]，已被证明可分泌动脉粥样硬化保护性IgM抗体，清除氧化脂质并减少泡沫细胞形成 [9]。记忆B细胞和B细胞-单核细胞相互作用也可能促进加速斑块形成的促炎通路 [10]。

大多数研究B细胞在动脉粥样硬化中作用的研究是在小鼠模型中进行的 [9, 11, 12]，人类数据有限。本研究旨在评估乌干达PLWH和PWoH中B细胞亚群与冠状动脉疾病严重程度之间的关联。我们假设PLWH中的免疫失调，特别是幼稚B细胞减少，与CVD风险增加有关。

方法

研究设计与参与者

这是对mUTIMA（乌干达HIV对心肌和动脉粥样硬化影响研究）数据的横断面二次分析，mUTIMA是一项于2017年至2019年进行的前瞻性队列研究。本子分析的参与者包括100名完成冠状动脉CT血管造影（CCTA）的个体，包括40名接受ART的PLWH，与60名年龄相仿且具有共同心脏代谢危险因素的PWoH按1:1.5匹配 [13, 14]。原始队列基线检查的方法和结果已先前发表 [13–15]。

患者知情同意声明

mUTIMA研究获得了克利夫兰大学医院机构审查委员会、联合临床研究中心研究伦理委员会以及乌干达国家科学技术委员会的批准。本研究所有参与者均提供了知情同意，包括对储存样本未来分析的同意。范德比尔特机构审查委员会批准了对去识别样本的质谱流式细胞术分析。

数据收集

收集了人口学数据、临床参数和心血管风险标志物。糖尿病和高血压定义为自我报告或病历诊断或该病用药。10年ASCVD风险使用2013年池化队列方程估算，适用于“其他”种族类别 [16]。

冠状动脉CT血管造影

冠状动脉CT血管造影按先前发表的方法进行 [13]。节段受累评分（SIS）通过计数存在可检测动脉粥样硬化的冠状动脉节段数量来确定，无论管腔狭窄程度如何。使用18节段模型，因技术限制无法评估的节段，若数量不多则假定为正常。节段狭窄评分（SSS）通过根据管腔阻塞程度对每个病变节段分配权重来同时考虑CAD的程度和严重程度。权重范围为1（<25%阻塞）至5（完全闭塞）。SSS通过将所有受影响节段的权重相加计算，最高可能得分为90。这些评分共同提供了CAD负担和严重程度的综合评估 [13]。共有34名参与者的SSS非零，其中PLWH 11/40，PWoH 23/60（见补充图1，分布情况）。

飞行时间质谱流式细胞术

我们使用质谱流式细胞术评估免疫细胞类型（补充表1）。按照先前发表的方法 [17]，将冷冻保存的外周血单个核细胞解冻、洗涤并重悬于染色培养基中，然后用金属偶联抗体面板（补充表1，Standard BioTools Inc）标记。数据在Helios CyTOF（Fluidigm）上采集，根据制造商说明调谐，并用EQ珠进行标准化。

原始CyTOF FCS文件以附加样本运行日期的方式导出。使用五通道亮珠（质量通道140、151、153、165和175）通过premessa R包的标准化工具在不拼接的情况下对一组原始FCS文件进行标记强度标准化。使用CyTOF高斯波形参数去除低质量事件。双联体（包括B细胞复合物）未被排除。对文件进行TIME门控以去除流体堵塞，并修剪以排除不稳定的起始/结束周期。同位素质量重叠（145 vs 146 amu）导致的CD4与CD8拖尾事件被去除，而罕见的+16氧化伪影被忽略。DNA（193/191）门控排除碎片，珠排除确保完全去除校准珠。在FlowJo中门控活的CD45+细胞（补充图2）。

每个亚群输出进行独立分析。排除非信息性标记。文件拼接、转换（asinh[x/5]）并进行批次校正（25个PC，Harmony R包，λ=4，批次=运行日期）。使用均匀流形逼近和投影（UMAP）进行可视化，Leiden聚类（kNN=30，分辨率=3）定义群体。计算聚类丰度并在按HIV状态分层的组间进行比较（补充图3）。

统计分析

使用Wilcoxon秩和检验比较PLWH和PWoH之间的基线特征（连续变量）和Pearson卡方检验（分类变量）。连续变量报告为中位数和四分位距，分类变量报告为频率和百分比。

结局SSS的范围为0至21，66%的参与者得分为0。零值过多和正值的偏态需要使用障碍回归模型。障碍模型将有无任何狭窄（零 vs 非零）的二元过程与正值的条件分布分开。这比标准模型能够更准确和可解释地推断。该方法明确解决了零膨胀和效应大小的异质性，非常适合这种数据结构。

使用多变量障碍回归估计免疫簇、ASCVD风险评分、HIV状态和性别与SSS的关联。对免疫簇进行平方根变换以改善正态性和模型拟合。为评估关联是否因HIV状态或ASCVD风险而异，我们纳入了交互项（簇ASCVD、簇HIV状态和ASCVD*HIV状态）。我们还测试了幼稚B细胞是否修饰其他簇的效应。

连续预测因子的效应估计报告为比较上四分位数（Q3）与下四分位数（Q1）的SSS比值，以及95%置信区间（CI）和来自障碍模型计数部分的P值。使用森林图可视化效应大小，并绘制按HIV状态分层的总SSS预测值与ASCVD风险或免疫簇的关系。

所有P值均为双侧，比较免疫簇按HIV状态时进行多重比较校正。分析（热图、线图和森林图）在R（v4.3.2）中进行，条形图在GraphPad Prism（v10）中生成。

结果

人口学和临床参数

中位年龄为60岁，按HIV状态未观察到显著差异。女性在PLWH中占62%，在PWoH中占57%。糖尿病在PLWH中更常见（82% vs 63%；P=0.04）。他汀类药物使用率低（6%），各组间比例相当。PLWH的中位最低CD4+细胞计数为146 cells/mm³，中位ART持续时间为13年。86%的患者实现了完全病毒抑制（<20 copies/mL），无PLWH的病毒载量>254 copies/mL。约25%的参与者接受了蛋白酶抑制剂，7%接受了整合酶链转移抑制剂，7%接受了阿巴卡韦。PLWH的中位（IQR）CD4+细胞计数为508（380–668）cells/mm³。两组在BMI（P=0.18）和腰围（P=0.39）方面无临床或统计学显著差异。PLWH的中位总胆固醇水平较高但无统计学意义（224 mg/dL vs 195 mg/dL，P=0.10；补充表2）。

幼稚B细胞在PWoH中的比例显著高于PLWH

为确定免疫细胞差异，我们使用UMAP可视化高维数据（图1A和B）。以CD45+细胞为分母，我们从所有参与者的血液样本中区分为CD8+ T细胞、单核细胞、CD4+ T细胞、NK细胞、γδ T细胞、MAIT细胞、ILC、NKT细胞和B细胞（图1A和B）。本研究聚焦于B细胞亚群（图1A）。热图显示B细胞标志物的差异表达。聚类35包含B细胞–T细胞–单核细胞复合物。其余聚类由它们表达的其他标志物定义。浆母细胞高表达CD38（聚类45）。聚类18包含CD27+记忆B细胞，聚类41包含过渡B细胞，聚类25包含CXCR3+CX3CR1+ B细胞，其余为幼稚B细胞（聚类1、16）。按HIV状态分层后，PLWH中CCR7-幼稚B细胞（聚类16，P=0.011）、记忆B细胞（聚类18，P=0.032）、B-T-单核细胞复合物（聚类35，P=0.以及浆母细胞（聚类45，P=0.017）的百分比中位数较低（图1C）。所有免疫簇按HIV状态的差异已列出（补充表3）。

HIV状态和ASCVD风险独立塑造B细胞与SSS的关联

为研究B细胞亚群在冠状动脉疾病严重程度中的作用，我们使用障碍回归模型评估了它们与SSS的关联。对于所有亚群，我们评估了HIV状态和ASCVD风险评分之间是否存在交互作用。我们将性别和糖尿病状态纳入模型，因为PLWH和PWoH之间的糖尿病患病率存在统计学差异。CCR7+幼稚B细胞（聚类1）与SSS的关联取决于ASCVD风险水平，但无统计学显著性（P=0.098），如图2A所示。所有其他B细胞亚群的ASCVD-SSS曲线形状相似，其中CXCR3+CX3CR1+ B细胞（聚类25，P=0.026）和B细胞与T细胞及单核细胞的复合物（聚类35，P=0.042）与SSS存在显著关联。然而，HIV阳性状态和PWoH中的ASCVD风险评分是SSS的强独立风险因素（图2B-H）。

幼稚B细胞簇和浆母细胞与SSS呈负相关，而HIV状态和PWoH中的ASCVD风险评分与SSS呈正相关。具体而言，CCR7-幼稚B细胞（聚类16，比值0.55；P=0.022）呈负相关，而CCR7+幼稚B细胞（聚类1，比值0.76；P=0.23）不显著。有趣的是，浆母细胞（聚类45）也与SSS呈负相关（比值0.57；P=0.003）。存在一小群介于CCR7+幼稚B细胞和记忆B细胞之间的B细胞，即CXCR3+CX3CR1+ B细胞（聚类25）。这些细胞也与显著更低的SSS相关（比值0.54；P=0.031），并表现出ASCVD依赖性关系，ASCVD-SSS关联因HIV状态而异（交互作用P=0.04）。记忆B细胞（聚类18，比值0.85；P=0.43）与SSS无关联。其他亚群，包括过渡B细胞和T-B细胞复合物，也不显著。

总之，HIV阳性状态和PWoH中的ASCVD风险评分是SSS的强独立风险因素。CCR7-幼稚B细胞（聚类16）、浆母细胞（聚类45）与SSS显著负相关，且独立于HIV状态或PWoH中的ASCVD风险。CXCR3+CX3CR1+ B细胞（聚类25）与SSS存在ASCVD依赖性关系。

CD57- GPR56+ CX3CR1+ CD8+记忆T细胞调整增强了记忆B细胞与SSS的负相关性

聚类10（一种CD57- GPR56+ CX3CR1+ CD8+记忆T细胞亚群）以及其他亚群在PLWH中显著高于PWoH（中位数2.1 vs 1.4，校正P<0.01，补充表2）。考虑到抗原呈递细胞（如B细胞和单核细胞）与T细胞之间的相互作用，我们评估了聚类10是否调节记忆B细胞亚群（聚类18）、CD14+单核细胞-B细胞复合物（聚类35）与SSS之间的关联。在所有参与者中，记忆B细胞（聚类18）与更低的SSS相关（比值=0.64；P=0.052），而HIV阳性状态与更高的SSS相关（比值=2.59；P=0.041）。PWoH中的ASCVD评分也与SSS显著相关（比值=1.04；P=0.004）（图3A）。CD14+单核细胞-B细胞复合物（聚类35）与所有参与者中的SSS也存在负相关，但不显著（比值=0.54；P=0.096）（图3B）。

在PLWH中，记忆B细胞聚类18与SSS的关联不显著（图3C；比值=0.58；P=0.086）。然而，在PWoH中，聚类18与更低的SSS相关（图3E；比值=0.49；P=0.032）。矛盾的是，糖尿病在PLWH中与更低的SSS相关，但在PWoH中不相关（图3C、D）。T细胞-单核细胞-B细胞（聚类35）在PLWH中与更低的SSS相关（比值=0.27；P=0.001）（图3D），但在PWoH中不相关（比值=0.49；P=0.236）（图3F）。在ASCVD风险较高的个体中（上四分位数），聚类18比例增加与SSS降低相关（P=0.028），但聚类35无此关联（上四分位数，P=0.997）（图3G）。将CD57- GPR56+ CX3CR1+ CD8+记忆T细胞（聚类10）纳入模型后，揭示了记忆B细胞与SSS之间的显著负关联，尤其是在PWoH中（图3E）。这表明记忆B细胞对血管疾病负担的贡献可能被CX3CR1+ CD8+ T细胞的影响所掩盖，并且记忆B细胞对SSS的效应是情境依赖的。

CCR7-幼稚B细胞（聚类16）与PWoH中更低的SSS相关

在总队列中（图4A），SSS随聚类16增加而降低，这一趋势在ASCVD风险的所有水平上一致，表明ASCVD和聚类16之间无有意义的交互作用（比值=0.42；P=0.84）。森林图显示聚类16与SSS呈负相关（比值=0.35；P=0.031），HIV阳性状态与SSS呈正相关（比值=2.91；P=0.038）。

在PLWH中（图4B），CCR7-幼稚B细胞（聚类16）与SSS降低无显著关联（比值=0.54；P=0.15）。ASCVD风险评分与聚类16之间无交互作用（比值=0.92；P=0.12）。在PWoH中（图4C），幼稚B细胞与SSS显著降低相关（比值=0.22；P=0.003）。将聚类10纳入模型并未改变聚类16与SSS之间的关系（图4A-C）。在PWoH中，CCR7-幼稚B细胞比例增加与SSS显著降低相关，且该关联受ASCVD修饰（交互作用P=0.02）。相反，在PLWH中未观察到显著交互作用（交互作用P=0.07），在总队列中也未观察到（交互作用P=0.41），提示幼稚B细胞的保护作用可能在HIV背景下减弱。

在PLWH中，幼稚B细胞对SSS的保护性关联在经典单核细胞背景下显现

单核细胞和CD8 T细胞均参与动脉粥样硬化性心血管疾病的发病机制。该队列中大多数CD8+ T细胞簇，包括聚类9（CD8 TCM）和11（CD8幼稚），在PLWH中显著高于PWoH（图1B，补充表2）。更高的CD4:CD8比值与PLWH中较低的CAD风险相关[18]。我们研究了CD8+ TCM细胞（聚类9，表型为CXCR3+ NKG2D+ CD27+ CD28+ CD127+ CD8+ T细胞）和幼稚B细胞（聚类16）在不同四分位数比较之间是否存在交互作用。比较每个免疫细胞簇高频率（四分位数3，Q3）与低频率（四分位数1，Q1）时的交互作用。此外，我们评估了幼稚B细胞（聚类16）分类为四分位数（Q1–Q3）的修饰效应。因此，对于3个簇（CD8 T细胞-9和11；以及单核细胞-7），每一行代表T细胞和单核细胞簇以及幼稚B细胞聚类16的特定高/低频率组合。

在所有参与者中，幼稚B细胞（聚类16）比例较高与SSS呈显著负相关。当聚类9（CD8 T细胞）固定在中位数时，幼稚B细胞增加（Q3 vs Q1）与SSS降低45%相关（比值=0.55，95% CI：0.32–0.94，P=0.028），提示更好的临床结局（图5A）。当聚类7（经典单核细胞）固定在中位数时，聚类16水平与SSS无关联（比值=0.64，95% CI：0.35–1.16，P=0.139）。最后，当聚类11（幼稚CD8+ T细胞）固定在中位数时，更高的聚类16水平与SSS降低52%相关（比值=0.48，95% CI：0.27–0.84，P=0.010），再次显示一致的保护作用。

在PLWH中，聚类9（CD8 TCM）细胞在所有四分位数中均与SSS呈负相关。当它们固定在中位数时，幼稚B细胞与SSS之间的关系不显著（比值=0.65，95% CI：0.26–1.64，P=0.36）（图5B）。另一方面，聚类7（CD163-经典单核细胞）的所有四分位数均与SSS呈正相关。当经典单核细胞固定在中位数时，更高的聚类16水平与更低的SSS相关（比值=0.55，95% CI：0.33–0.92，P=0.022）。当幼稚CD8+ T细胞（聚类11）固定在中位数时，幼稚B细胞与SSS无显著关联（比值=0.81，95% CI：0.43–1.53，P=0.51）。然而，幼稚B细胞与幼稚CD8+ T细胞之间的交互作用在PLWH中显著（交互作用P=0.020），表明幼稚B细胞与SSS的关联随幼稚CD8+ T细胞的频率而变化，尽管在中位数时无效应显现。

在PWoH中，高幼稚B细胞与显著更低的SSS相关，除非将经典单核细胞纳入模型（图5C）。总体而言，数据表明较高的幼稚B细胞频率主要与PWoH中的良好结局（更低的SSS）相关。在PLWH中，这种保护性关联仅在考虑经典单核细胞时才显现，而在CD8+ T细胞背景下未观察到。相反，经典单核细胞本身始终与更高的SSS相关。

讨论

在这项探索性研究中，我们观察到PLWH和PWoH之间循环B细胞亚群的差异，并且几个免疫群体与亚临床CAD的测量指标存在关联。尽管进行了长期抗逆转录病毒治疗，但与PWoH相比，PLWH的幼稚、记忆和CXCR3+CX3CR1+ B细胞亚群以及浆母细胞的频率更低。虽然这些发现与先前关于HIV相关B细胞改变的描述一致[6, 19]，但迄今为止尚未研究其对PLWH心血管疾病的影响。几个B细胞亚群与SSS表现出不同的关联。幼稚B细胞和浆母细胞可能具有保护作用，表现为与SSS的负相关。在PLWH中，幼稚B细胞与SSS的负关联在纳入经典单核细胞后更为清晰，提示单核细胞驱动的炎症可能掩盖B细胞的保护作用。总之，我们观察到B细胞亚群与SSS的负关联在PWoH中最强，而在PLWH中，该关联仅在将经典单核细胞纳入模型时才可检测。

幼稚B细胞表达的IgM已被证明参与清除氧化脂质和抑制炎症级联反应[12, 20]。我们发现幼稚B细胞频率与SSS呈负相关，尤其是在ASCVD风险评分较高的个体中。这些发现具有假设生成性质，并促使未来研究确定幼稚B细胞相关免疫特征是否与已确立的心血管危险因素相互作用。

CCR7通过其配体CCL19/CCL21引导淋巴细胞归巢至次级淋巴组织，并在高内皮小静脉上支持B细胞进入淋巴结，与CXCR4/CXCR5共同作用[21]。CCR7+幼稚B细胞可能反映了淋巴归巢、生发中心胜任的表型，而CCR7-幼稚B细胞可能更倾向于循环，并受慢性炎症影响。除经典淋巴归巢外，人类B细胞上CCR7的表达存在差异，慢性HIV感染会扰乱这一轴系；有报道描述了耗竭/组织样记忆B细胞中CCR7降低和更广泛的运输受体破坏[22]。在此背景下，CCR7-幼稚B细胞与PLWH冠状动脉疾病测量指标的负关联可能反映了慢性HIV感染期间B细胞运输的更广泛破坏，但该关系仍处于探索性阶段，需在更大规模研究中验证。

细胞间复合物是动态的细胞相互作用，可能促进炎症，并有报道在合并糖尿病的PLWH中增加，可能参与心脏代谢疾病的发病机制[17]。单核细胞的作用在本研究中值得注意：经典单核细胞在PLWH中与SSS呈正相关，与已建立的单核细胞活化和HIV血管功能障碍之间的联系一致[23, 24]。相反，在PLWH中，涉及B细胞的细胞间复合物与SSS呈负相关；这一观察有趣但其生物学相关性仍不清楚。

传统的ASCVD风险评分仍然有价值，但未能捕捉免疫失调[25]。先前研究表明这些模型可能低估慢性炎症状态下的风险[26, 27]。综上所述，这些发现表明，PLWH和PWoH之间的免疫谱不同，与亚临床冠状动脉疾病测量指标的关联模式也不同。然而，鉴于样本量适中、亚组设计以及对照组的异质性临床特征，这些观察不能确定因果关系或方向性。相反，它们凸显了需要进一步研究的领域，特别是幼稚B细胞、单核细胞驱动的炎症和HIV血管疾病之间的关系。

结论

幼稚B细胞与CAD负担呈负相关，尤其是在高ASCVD风险的PWoH中。另一方面，经典单核细胞与PLWH中更高的SSS相关。这些结果表明，免疫谱分析可以加强预测模型。需要更大规模的纵向研究和详细的机制评估来阐明这些关系，并评估免疫表型是否能够补充HIV中现有的心血管风险分层方法。

局限性

虽然这些发现为PLWH中B细胞亚群变化及其对心血管风险的潜在贡献提供了有价值的见解，但应考虑若干局限性。首先，ASCVD风险评分虽然广泛使用，但可能无法捕捉风险因素的全谱，尤其是在HIV中，传统风险预测模型可能低估心血管事件。尽管我们调整了关键混杂因素，但未测量的因素，如炎症生物标志物、抗逆转录病毒治疗持续时间和生活方式影响，仍可能对观察到的关联有所贡献。相对较小的样本量以及纳入已有心脏代谢危险因素的PWoH，限制了我们从共享合并症中分离HIV状态效应的程度。因此，研究结果应解释为假设生成。此外，本研究为观察性研究，不能做出因果推断。未来需要使用机制方法和纵向设计的研究来进一步探讨免疫细胞亚群在HIV相关心血管风险中的作用。

补充数据

补充材料可在《Open Forum Infectious Diseases》在线获取。包含由作者提供以惠及读者的数据，发布材料未经编辑，完全由作者负责，因此问题或意见应联系通讯作者。

注释

资金支持：本研究部分由美国国家心、肺、血液研究所（资助号：K01 HL147723授予T.M.T.，K23 HL123341授予C.T.L.，K23 HL156759授予C.N.W.）、多丽丝·杜克慈善基金会2021193（C.N.W.）和Burroughs Wellcome基金1021480（C.N.W.）支持。内容完全由作者负责，并不一定代表资助者的官方观点。

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