心脏重塑涉及心肌肥厚和纤维化，这会损害心脏功能，最终导致心力衰竭（HF）和死亡。纤维化主要是由于过量的基质沉积和赖氨酰氧化酶依赖的胶原交联引起的。特别是赖氨酰氧化酶样蛋白2（LOXL2）在疾病进展中起关键作用，是开发新型高效LOXL2抑制剂的有前景的治疗靶点。本文介绍了作为抗纤维化药物的小分子LOXL2抑制剂的临床前验证及其临床适用性，在一期临床试验中，高靶点结合率得以持续维持且耐受性良好。
我们发现，由于高血压或主动脉瓣狭窄引起的心力衰竭患者的血浆LOXL2浓度升高。血浆LOXL2浓度与左心室质量指数相关。一种新型LOXL2抑制剂SNT-5382被表征，包括体外和体内对其效力和作用机制的评估，显示出有益的药物特性。在临床前研究中，SNT-5382在心肌梗死（MI）小鼠模型中减少了纤维化并改善了心脏功能。一期临床研究显示，每日一次口服给药后具有良好的安全性和药代动力学特征，能够引发高且持久的LOXL2抑制。我们的研究结果强调了LOXL2在心力衰竭发展中的关键作用。SNT-5382在MI模型中表现出强大的抗纤维化效果，并实现了持续的临床靶点结合。
心血管疾病（CVD）是心力衰竭（HF）的主要风险因素，也是全球范围内死亡的主要原因。主动脉瓣狭窄（AS）和高血压（HT）的特点是慢性压力超负荷，导致左心室重塑。最初，心脏重塑和肥大作为补偿机制以维持心脏功能。然而，随着时间推移，它们会导致心脏功能障碍和心力衰竭的发展，除非进行治疗干预。
心脏纤维化是心脏重塑的主要标志，也是HF的预后因素。它可以是对急性（如心肌梗死）或慢性条件（如心脏压力或容量超负荷）的初始适应性应激反应。它导致心脏腔室的僵硬和心脏功能障碍的发展。纤维化中主要的细胞外基质成分是纤维状胶原，其沉积水平增加和交联加重了心脏组织的僵硬度。高度交联的胶原对降解酶更具抵抗性。在HF患者中，胶原交联程度增加，并与恶化的心脏舒张功能障碍、较高的左心室充盈压力和增加的僵硬度相关，同时也增加了因HF再次住院的风险。此外，左心室质量指数（LVMI；衡量伴随纤维化发展的左心室肥厚指标）升高的HT患者有很高的HF和全因死亡风险。尽管标准护理药物已被证明对HF治疗非常宝贵，但仍然存在对特定阻止纤维化进程治疗干预措施的明确未满足临床需求。
赖氨酰氧化酶（LOXs）是一组催化胶原交联形成的酶，从而在纤维化进程中起关键作用。先前在急性和慢性心脏纤维化实验模型中的研究表明，赖氨酰氧化酶样蛋白2（LOXL2）这一特定家族成员在左心室功能障碍中发挥作用。在缺血性或非缺血性扩张型心肌病以及射血分数保留型HF患者中发现了LOXL2表达增加。此外，有HF高风险的HT患者血清LOXL2水平升高，这与已建立的CVD生物标志物（如氨基末端脑钠肽前体（NT-proBNP）、肌钙蛋白I）和心脏功能障碍呈正相关。
在临床前和临床环境中，LOXL2抑制作为抗纤维化疗法的原理已经确立。在CVD动物模型中，通过基因删除或药物干预降低LOXL2活性，可减少纤维化、减弱相关心脏功能损害并提高生存率。小分子GB2064初步证明了LOXL2抑制的抗纤维化疗效，在治疗9个月的骨髓纤维化患者中，60%的骨髓胶原纤维化等级降低。这一成功是在涉及simtuzumab（一种变构选择性LOXL2抗体）的几次高调临床试验失败之后取得的。最初，simtuzumab在临床中的令人失望的结果归因于目标不合适，但现在很明显，该抗体并未抑制LOXL2的酶活性，重新确立了LOXL2作为高度相关的抗纤维化靶点的地位。
在此，我们进一步提供支持LOXL2作为HF患者重要治疗靶点的证据。我们还描述了一种临床候选物SNT-5382的开发，该候选物充分利用了对决定效力和选择性的结构-活性关系的深入理解。此外，我们证明了在临床中每日一次重复口服给药后的良好安全性、药代动力学特性和高持久的靶点结合。
LOXL2在慢性心力衰竭中上调
在许多纤维化疾病中，血浆LOXL2浓度被提议作为诊断生物标志物。使用数字ELISA分析测量LOXL2血浆浓度。与对照组相比，患有HF的AS患者血浆LOXL2水平增加。在控制年龄、性别、体重指数和估算的肾小球滤过率后，这种差异仍然具有统计学意义。
为了进一步证实LOXL2与HF之间的正相关关系，分析了有或无HF的HT患者的血浆LOXL2水平。同样，患有HF的患者血浆LOXL2浓度高于没有HF的患者。在控制年龄和性别后，这种差异仍然具有统计学意义。血浆LOXL2水平与LVMI之间存在正相关关系，LVMI是评估左心室肥厚的参数。
开发有效的LOXL2抑制剂SNT-5382
基于先前发表的吲哚和氮杂吲哚类抑制剂，我们开发了SNT-5382，这是一种具有优良开发性质的有效、选择性LOXL2抑制剂。SNT-5382表现出快速的时间依赖性LOXL2抑制，并竞争性地结合到目标酶的活性位点。
类似于其他含卤代烯胺的胺氧化酶抑制剂，氟的存在对于实现不可逆抑制至关重要。SNT-5382假定的LOXL2抑制机制如图所示。SNT-5382最初结合到酶口袋内的赖氨酸酪氨醌（LTQ）辅因子，形成席夫碱并随后氧化。活性位点内的氨基酸亲核攻击导致共价结合的酶-抑制剂复合物形成。虽然经典共价抑制剂具有能与脱靶蛋白形成加合物的反应性官能团（可能导致不良副作用），但SNT-5382仅在结合到LOXL2活性位点内的LTQ辅因子时才被激活。
为了评估SNT-5382的选择性，我们测试了它对其他赖氨酰氧化酶、胺氧化酶和大分子的作用。在治疗相关浓度下，SNT-5382还抑制LOXL3，并在较小程度上抑制LOXL4。这两个家族成员越来越被认为是多种纤维化条件的重要驱动因素。相比之下，SNT-5382对所谓的管家家族成员LOX和LOXL1表现出良好的选择性。SNT-5382在其他胺氧化酶和大分子靶标上也有极好的选择性。
在一系列标准测定中评估了SNT-5382的体外和体内ADME特性。SNT-5382在人体、狗和大鼠中的血浆蛋白结合率较低。SNT-5382在跨物种中表现出高血浆和代谢（微粒体和肝细胞）稳定性。该化合物不会显著倾向药物-药物相互作用。在治疗相关浓度下，SNT-5382不会阻断转运蛋白或表现出对细胞色素P450（CYP）酶的显著不可逆抑制，尽管观察到对CYP2C9和2C19的中度抑制。
在大鼠中，SNT-5382在口服给药后吸收良好，并在约3小时后达到峰值血浆浓度。组织浓度在口服给药后从1小时增加到4小时，SNT-5382在所有器官中分布良好。
SNT-5382在心肌梗死模型中表现出有意义的抗纤维化活性
众所周知，LOXL2在心脏纤维化模型中表达上调。此外，LOXL2抑制剂的抗纤维化效果之前与心脏功能改善相关。为了评估SNT-5382的治疗效用，使用了心肌梗死（MI）小鼠模型。该模型涉及永久结扎左冠状动脉，并通过视觉和超声心动图（ECHO）确认缺血。MI后，每天通过口服灌胃给予SNT-5382（14 mg/kg），连续28天。Losartan（一种血管紧张素II受体拮抗剂，剂量为15 mg/kg）作为阳性药理学对照。SNT-5382显著减少了梗死邻近区域的胶原体积分数（反映纤维化）与对照组和losartan治疗组相比。此外，与对照组相比，SNT-5382减少了成熟胶原交联（吡啶诺林（PYD）），而胶原含量（通过羟脯氨酸（HYD）测量）在此急性模型中不受影响。重要的是，SNT-5382显著改善了MI模型中的心脏功能（通过ECHO测量左心室射血分数（LVEF）和缩短分数（LVFS）），在配对分析中（第1天 vs 第28天）以及在28天时与对照治疗组相比。此外，SNT-5382治疗也显著改善了左心室收缩末期直径（LVESD）。在这个实验中，losartan对纤维化或肥厚没有显著影响，可能是由于对心脏功能的损伤严重性。
健康受试者中的SNT-5382药代动力学和药效学特征
HF患者血浆LOXL2浓度升高，加上临床前有前景的抗纤维化疗效和有利的非临床PK、药理学安全性和毒性研究，为将SNT-5382推进至临床研究提供了强有力的理由。在健康受试者中进行了随机、双盲、安慰剂对照的单次递增剂量（SAD）和多次递增剂量（MAD）一期研究。
在SAD研究中，SNT-5382耐受性非常好，没有报告严重不良事件。口服胶囊形式给药后，血浆水平随剂量增加而上升。峰值浓度发生在给药后3小时，随后缓慢消除。单剂量100 mg达到了平均Cmax 143 ng/mL，相当于0.37 µM，这是人LOXL2 IC50值的10倍以上。SNT-5382显示出约24小时的长终末半衰期。使用基于活性的生物探针检测血浆LOXL2抑制情况。在100 mg口服剂量后，血浆LOXL2抑制的峰值水平（>85%）迅速（2小时后）达到。重要的是，SNT-5382维持了高水平的靶点结合，在24小时后仅有26%的酶活性恢复。
在MAD阶段，SNT-5382每日一次给药14天，包括最后7天的无药期直至最后一次访问，耐受性良好。在所有三个剂量队列中，共报告了31例治疗出现的不良事件，其中29例为轻度（2例为中度）。在第1天，SNT-5382血浆水平在给药后3小时达到峰值，终末半衰期范围为29.5至34.0小时。在重复给药期间发生了预期中的积累。与高血浆浓度SNT-5382一致，高血浆LOXL2抑制水平（≥85%）得以实现并维持。尽管LOXL2的快速再合成率很高，但在最后一次给药后24小时测量时，酶活性的恢复可以忽略不计（仅6%）。PK-PD关系分析表明，当SNT-5382血浆浓度接近或超过体外IC50（10 nM）时，理想的高靶点结合水平得以实现。总之，这些数据表明，每日一次100 mg剂量的SNT-5382满足了持续高LOXL2抑制水平的要求，并具有良好的安全性。
讨论
心脏纤维化是HF患者不良临床结局的预测因子。与HF相关的高死亡率和发病率突显了针对纤维化的治疗需求，但很少有抗纤维化方法在临床上进行了测试。在此，我们将HF患者（包括AS和HT患者）血浆LOXL2的增加与左心室肥厚的恶化联系起来，并提出LOXL2抑制作为一种有前景的治疗策略。为此，我们开发并表征了一种小分子、基于机制的LOXL2抑制剂SNT-5382，具有优异的药物特性。临床前研究证实，SNT-5382是一种抗纤维化药物，并改善心脏功能。此外，一期研究展示了良好的安全性和药代动力学特征，并确认了在每日一次重复口服给药后持续高水平的靶点结合。所有这些特性确立了SNT-5382在降低CVD患者HF风险方面的治疗效用。
在这项研究中，HF患者的血浆LOXL2浓度升高，表明循环LOXL2可能代表心肌纤维化的诊断和/或预后生物标志物。尽管循环纤维化生物标志物可以改善早期检测、疾病进展监测并指导治疗干预，但目前用于HF诊断和风险评估的金标准血清生物标志物是NT-proBNP，这是心脏负荷变化而非纤维化的衡量标准。因此，循环LOXL2可能是CVD发展中心室重塑的早期指标，但需要在更大队列中进行更多研究。
当胶原交联数量增加时，纤维化进展，增强胶原纤维。这与左心室僵硬度增加有关，最终导致HF住院风险更高。SNT-5382抑制LOXL2活性，防止进一步交联形成。MI模型数据显示，LOXL2抑制通过减少心室生物力学僵硬度来改善心脏功能。此外，随着细胞外基质积累减少，随着时间推移，内源性蛋白酶可能会解决现有的纤维化并恢复正常状态。这与之前使用LOXL2抑制剂GB2064的临床研究一致，尽管该化合物具有更适度的LOXL2靶点结合，需要每日两次高剂量1000 mg，但仍显示出纤维化减少。
最近解释LOXL2抗体simtuzumab失败的研究结果重新激发了对LOXL2作为抗纤维化靶点的兴趣。高LOXL2水平与纤维化组织和血浆中的HF及其他纤维化疾病的关联，加上SNT-5382作为一种安全有效的LOXL2抑制剂在人类中的可用性，现在可以全面评估其全部临床潜力。
结论
我们的研究提供了强有力的证据，表明LOXL2抑制是一种有前景的治疗策略，可用于减少患者的纤维化介导的心力衰竭。HF患者血浆中升高的LOXL2水平可能作为心肌重塑的潜在早期指标。小分子LOXL2抑制剂SNT-5382在临床前模型中减少了纤维化并改善了心脏功能。在一期临床试验中，SNT-5382显示出良好的安全性，并维持了高水平的靶点结合。后续研究将对SNT-5382在HF患者临床试验中的治疗效果评估至关重要。
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