细胞衰老与侧群干细胞的相互作用 - 干细胞与抗衰老

摘要

干性与细胞衰老(CS)是细胞可塑性的基本且看似对立的表现形式。近年来获得的证据表明，由山中因子(OSKM)诱导的多能性可能会促进CS，反之亦然。由定义的小分子(SMs)诱导的细胞重编程是否也会伴随CS的加速，目前尚未得到解答。侧群(SP)干细胞已在迄今为止检查的所有细胞培养物和组织中被发现。SP的存在本身为研究CS与干细胞之间的联系提供了一个自然模型。然而，SP与CS之间的关系，特别是CS过程中SP丰度的变化，尚未建立。在本研究中，我们使用人类肺成纤维细胞(HPFs)的原代培养物来探索这些关系。本研究的主要发现是：(a) CS过程中SP丰度呈现双相变化，在衰老前期HPF培养物中SP显著增加，随后在衰老阶段急剧减少；(b) 用于细胞重编程的小分子(SMs)诱导SP干细胞和衰老细胞的积累，从而提醒山中因子的效果；(c) 通过间充质干细胞衍生的细胞外囊泡修饰CS与HPF培养物中CS过程中的SP动态高度一致，并进一步加强了衰老细胞和干细胞之间的定量关系。

引言

干性与细胞衰老(CS)是细胞可塑性的基本且看似对立的表现形式。最近，诱导多能性与CS之间联系的证据已得到证明(由参考文献1综述)。一个意外发现是，通过定义的山中因子(OSKM：Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)诱导多能性伴随着体外和体内衰老细胞的大量积累²,³。反过来，衰老细胞支持多能性诱导并提高其功效⁴。换句话说，通过定义因子的细胞重编程可以促进CS，反之亦然。此外，CS被建议是细胞重编程的重要甚至必要组成部分²,³,⁵,⁶。然而，这些关系是代表"实验室现象"还是反映基本生理联系，研究甚少。

侧群(SP)细胞最初由Goodell等人(1996年)发现，是一组具有干细胞标志物和增强药物抗性的独特细胞池⁷。此后，已证明SP细胞是在迄今为止检查的每个细胞培养物或组织中发现的干细胞⁸–¹⁰。SP的干细胞特性已通过其分化成各种细胞类型和表达干细胞标志物的能力得到广泛认可⁹,¹¹,¹²。SP干细胞代表一个非常小但功能上有意义的细胞池，参与各种需要组织修复和再生的生理和病理过程⁹,¹³。此外，SP干细胞最近已纳入临床试验¹⁴。从某种意义上说，SP可被视为一个自然模型，使我们能够探索干性与CS之间的相互作用。然而，尽管有广泛的科学兴趣，该模型尚未应用于研究干细胞和衰老细胞之间的假定联系。成纤维细胞是研究CS的经典模型¹⁵。此外，成纤维细胞(或至少其特定亚群)与间充质干细胞(MSCs)非常相似甚至无法区分(由参考文献16综述)，而MSCs被认为是SP细胞的主要来源¹⁷。考虑到这一点，我们使用人类成纤维细胞的原代培养物来探索干细胞和衰老细胞之间的假定联系。

材料与方法

细胞培养与计数

人类肺成纤维细胞(HPFs)的原代培养物(购自ScienCell Cat.#3300；美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)和MCF-7癌细胞(购自ATCC Cat.#HTB-22；美国弗吉尼亚州马纳萨斯)在标准条件下(37°C，5% CO₂)生长于Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Cat.#01-055-1A)中，补充10%胎牛血清(Cat.#04-121-1A)、1% L-谷氨酰胺(Cat.#03-020-1B)和1%青霉素/链霉素(Cat.#03-031-5B)。所有细胞培养产品均来自以色列贝特哈埃梅克的Biological Industries。使用倒置相差显微镜(Primo Vert, Zeiss, 德国奥伯科亨)每天检查培养物，并在达到75%-80%汇合度时以1:2比例传代。使用台盼蓝排除法计算活细胞的数量和浓度。

复制性CS模型

通过连续传代实现CS。根据(a)细胞增殖的显著抑制或分别的细胞生长停滞；(b)典型的CS形态；以及(c)包括衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)、细胞周期抑制剂P16**INK4a、P21**Cip1/Waf1和衰老相关分泌表型(SASP)相关的IL-6在内的CS标志物的表达，将细胞定义为衰老前期或衰老。

SA-β-gal检测

按照制造商协议(Senescence Cells Histochemical Staining Kit Cat.#CS0030；美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich)，在六孔板(每孔50,000个细胞)上进行SA-β-gal检测。细胞在37°C下与染色混合物孵育四小时。使用倒置相差显微镜(Primo Vert, Zeiss, 德国奥伯科亨)观察SA-β-gal染色。

mRNA分离和定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)

使用Blood/Cell Total RNA Mini Kit(Geneaid Cat.#RB300；中国台湾新北市)从细胞沉淀中提取RNA，并使用qScript cDNA Synthesis Kit(Agantek Cat.#95047；以色列亚孔)将1 μg总RNA在20 μl反应中转录为cDNA。使用SYBR Green Gene expression assays qPCRBIO SyGreen Blue Mix在MIC 2通道qRT-PCR系统(Bio Molecular Systems；澳大利亚上库梅拉)上进行qRT-PCR，按照制造商说明。为了检测衰老相关基因的表达，使用Primer-BLAST在线工具设计了多个引物对，并在分析时使用GAPDH或PUM基因作为归一化对照(表S1)。

荧光激活细胞分选分析和细胞分选

荧光激活细胞分选(FACS)用于确定感兴趣培养物中类干细胞(SP)的存在和定量。染色按照已建立的协议¹⁸,¹⁹进行，稍作修改。每次SP分析，将10⁶个细胞重悬于1 ml补充2% FBS和10 mmol/L HEPES(pH 7.4；DMEM+)的细胞培养基DMEM中。细胞用5 μg/ml Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific Cat.#H3570, 美国沃尔瑟姆)染色，并在37°C水浴中避光孵育90分钟，每20分钟涡旋混合一次。为确认SP信号的特异性，将重复样品与钙通道阻滞剂和ABC阻滞剂维拉帕米(Holland Moran Cat.#329330010, 以色列耶胡德-莫诺松)在终浓度100 μM下孵育²⁰。为评估活力，在孵育结束前30分钟加入7AAD(Biolegend Cat.#BLG-420403, 美国圣地亚哥)。使用Canto II或CytoFLEX系统进行FACS分析，使用FlowJo软件V10分析结果。Hoechst 33342染色强度在两个通道中测量—Ex. 405 nm, Em. 410–490 nm (Hoechst-Blue)和Ex. 405 nm, Em. 590–630 nm (Hoechst-Red)。使用图S1中说明的策略对细胞进行门控。SP评估的门控基于用作阴性对照的维拉帕米处理(图S2)。具体而言，SP门控包括Hoechst-Blue和Hoechst-Red通道中最低荧光强度区域，直到并排除最暗的经维拉帕米处理的Hoechst染色细胞。还排除了Hoechst-Red高/Hoechst-Blue低荧光的碎片场。对于细胞分选，收集约8 × 10⁶个细胞，按照上述方法染色，并使用MA900细胞分选仪(索尼，日本东京)分选。细胞分选使用100-μm喷嘴尺寸进行，细胞直接分选到含有5 ml DMEM+培养基的15 ml管中，以最小化细胞应激。SP和主群体(MP)的细胞以2500个细胞/秒的速度分选。分选后的SP和非SP部分立即接种到六孔板上进行进一步检查。对于用MSC或造血干细胞(HSC)标志物进行免疫染色，定义为SP的细胞(即按照上述方法用Hoechst 33242染色)随后按照制造商推荐协议与适当的荧光抗体(表S2)进一步孵育。

小分子混合物

HPF培养物用包含用于细胞重编程的小分子(SMs)²¹的混合物处理：0.5 mM丙戊酸、5 μM咖啡酸和10 μM LiCl(Cat.##1069-66-5, C-0625, 和7447-41-8，分别为；Sigma-Aldrich, 美国密苏里州圣路易斯)，2 μM RepSox(BDL Beit Dekel Cat.#R0224-25MG, 以色列拉阿纳纳)(VCLR混合物)。

MSC衍生的细胞外囊泡

如我们先前所述²²，从小鼠骨髓中分离出ICR小鼠的MSCs并进行表征。所有实验程序均按照美国国家卫生研究院指南进行。从第13-15代MSC培养物的条件培养基中分离出细胞外囊泡(EVs)。简而言之，70%汇合的培养物与补充2 mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的DMEM(低葡萄糖)孵育48小时。条件培养基在300g下离心5分钟以去除漂浮和死亡细胞，然后在3000g下额外离心10分钟以去除碎片。然后将上清液在4°C下以100,000g超速离心70分钟。然后将EV沉淀重悬于PBS中，并在4°C下以100,000g进行第二次超速离心70分钟。分离的EVs在使用前储存在-80°C的PBS中。使用NanoSight NS300(Malvern Panalytical, 英国马尔文)的纳米颗粒跟踪分析对EVs进行表征和定量。EV大小主要在48至165 nm之间，并通过扫描电子显微镜确认一般形态。将处于衰老前期(群体倍增时间[PDT] 6天)或衰老(PDT > 3周)阶段的HPF培养物接种在六孔板上，并用每1 ml DMEM 10⁶个EVs处理72小时，随访一周。

统计评估

使用双尾Student's t检验评估实验组和对照组之间的差异。P值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

在HPF原代培养物中识别SP细胞

为了评估HPF原代培养物是否含有干细胞，进行了使用Hoechst染料的FACS分析。由于肿瘤细胞培养物以其相对较高的SP而闻名，我们使用MCF-7人乳腺癌细胞作为检测干细胞的阳性对照。FACS分析显示，在正常HPF和MCF-7癌细胞培养物中，都存在一小群对维拉帕米敏感的细胞，它们排除了Hoechst染料，以及一大群不排斥Hoechst染料的细胞(图S2)。根据Goodell等人⁷，对维拉帕米敏感和不敏感的细胞池分别代表干细胞的SP和非干细胞的MP。在指数生长的HPF培养物中，SP值在0.03%至0.15%之间变化(平均值±SE：0.07±0.02%；见图S2)。值得注意的是，这些值特别接近报道的总肺组织中SP细胞的百分比(0.03%-0.07%)²³。

HPF培养物的细胞分选

接下来，我们检查了细胞分选后SP和MP的行为。细胞在优化用于成纤维细胞培养的DMEM培养基中生长。SP细胞迅速附着在烧瓶表面，形态类似于早期传代的成纤维细胞(长而细的纺锤形)。孵育三周后，分析从SP和MP衍生的细胞培养物排除Hoechst染料(干性表型)的能力。FACS分析显示，在两种培养物中，SP/MP的比例都趋向于恢复到细胞分选前观察到的水平(图1)。因此，这些观察表明(a)SP干细胞分化为成熟成纤维细胞的能力，以及(b)一小部分分化成纤维细胞经历自发细胞重编程的能力。

图1. 分选的侧群(SP)/主群体(MP)细胞恢复其异质性。 培养细胞的流式细胞术分析：(A) 人类肺成纤维细胞(HPF)培养物分选到SP细胞后三周；(B) HPF培养物分选到MP细胞后三周；以及(C) 对照HPF培养物。细胞培养物单独用Hoechst 33342(−)或与50 μg/ml钙通道阻滞剂维拉帕米(+)组合染色，如材料和方法部分所述。SP细胞的百分比计算为(−)维拉帕米和(+)维拉帕米之间的差异。基于用作阴性对照的维拉帕米处理选择SP评估的门控(另见图S2)。(D) 分选和未分选HPF培养物中的SP丰度。数据表示为至少三个独立实验的平均值±SEM。

分选的SP细胞表达间充质而非HSC标志物

肺SP细胞可分为两个主要亚组：具有HSC潜能的CD45阳性部分和具有MSC表型的CD45阴性部分²⁴。为了进一步评估存在于HPF培养物中的干细胞类型(造血或间充质)，我们分析了通过FACS分选的SP细胞中相应标志物的表达。使用不同标志物的FACS分析显示，SP培养物对HSC标志物如CD45、CD34和CD133呈阴性(图2A)。相反，SP细胞对包括CD90、CD105和CD44在内的MSC标志物呈阳性(图2B)。FACS分析的结果得到了HPF培养物qRT-PCR数据的支持，这些数据显示与年轻的培养物相比，衰老前期细胞培养物(具有明显更高的SP比例；见下一节)中MSC标志物的表达要高得多(图2C)。

图2. SP细胞中表达间充质和造血标志物。 通过流式细胞术分析成纤维细胞培养物的SP细胞，细胞表面表达(A)间充质CD90、CD105、CD44，或(B)造血CD45、CD34、CD133干细胞标志物。(C) 从HPF培养物中提取RNA；通过qRT-PCR测定THY1(CD90)、ENG(CD105)和CD44的转录水平，并相对于看家基因PUM的水平进行归一化；值是三次独立实验的平均值，每个实验重复两次。"年轻"，17-20代的HPF培养物；衰老前期，40-45代的HPF培养物。数据表示为平均值±SEM。*p < 0.05; **p < 0.01。

复制性CS过程中的SP动态

HPF原代培养物的细胞生长模式、形态和CS标志物的表达与 elsewhere(例如，参考文献25)中描述的相似。早期传代(P.12-18，"年轻")的肺成纤维细胞显示典型的纺锤形，并每天倍增其群体。大约20-25次传代后，成纤维细胞培养物获得了更异质的形态，其中一小部分细胞表现出SA-β-gal酶活性，并开始增殖变慢，大约在第45-50代显著减慢其生长(PDT 3-4周)或停止分裂(图3A)。晚期传代的成纤维细胞培养物具有异质形态，具有不规则形状的大细胞，并被CS标志物SA-β-gal染色(图3B)。它们表达了高水平的其他CS标志物，包括细胞周期依赖性激酶抑制剂P16**INK4a、P21**Cip1/Waf1和主要SASP成分之一IL-6(图3C)。

图3. 细胞衰老(CS)过程中的原代HPF培养物。(A) HPF生长曲线；(B) "年轻"(P.15)、衰老前期(P.42)和衰老(P.51)HPF培养物的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色，比例尺为200 μm；(C) "年轻"(p.15)和衰老前期(p.42)HPF培养物中与CS相关的P16**INK4a和P21**Cip1/Waf1基因以及SASP相关的IL-6基因的表达。数据表示为平均值±SEM。*p < 0.05; **p < 0.01。(D) CS过程中SP丰度的变化。在面板(A)和(D)中，均值是从几次独立实验(n ≥ 3 for each point)计算得出的，为清晰起见未显示SEM。

我们在人类HPFs的复制性CS过程中观察到SP的双相变化。如图3D所示，SP的这些变化以传代依赖性方式发生，因此SP随着传代增加而逐渐增加，并在CS的初始阶段(衰老前期培养物)达到最大值。此后，SP急剧减少，在衰老培养物中甚至下降到低于在"年轻"成纤维细胞中观察到的水平。

VCLR小分子混合物对HPF原代培养物中SP和CS的影响

如上所述(见引言部分)，由定义的转录因子诱导的细胞去分化伴随着衰老细胞的积累²,³。在应用用于细胞重编程的SMs后，这些过程是否也耦合尚未确定。为了澄清这一点，我们用SM混合物(VCLR)处理HPF培养物。与对照(未处理)HPF培养物相比，VCLR处理的细胞培养物显示出SP丰度的显著增加，这在六周的处理后达到峰值(图4A)。

图4. VCLR小分子混合物对HPF原代培养物的影响。(A) VCLR处理的培养物与对照中SP细胞的变化；(B) 未处理和VCLR处理的HPF培养物的细胞生长曲线；(C) 未处理和VCLR处理的HPF培养物的SA-β-gal染色(比例尺：200 μm)；(D) 未处理和VCLR处理的HPF培养物中与CS相关的P16**INK4a和P21**Cip1/Waf1基因以及SASP相关的IL-6基因的表达。数据表示为平均值±SEM。*处理vs对照，p < 0.05；**处理vs对照，p < 0.01；***处理vs对照，p < 0.001。

如图3A所示，未处理的HPF的原代培养物在第40-45代之前没有显示出细胞生长的减慢，平均每天或每两天倍增其群体。相比之下，VCLR处理的HPF培养物减慢了细胞生长(图4B)，并从第18-19代开始更早地开始显示细胞形态的变化。如图4C所示，早期传代(P.14)的HPF培养物，无论是对照还是VCLR处理的，都没有显示任何SA-β-gal酶活性。对照培养物直到晚期传代都显示相同的画面。然而，在VCLR处理的HPFs中观察到了相反的趋势。用VCLR混合物孵育四周后，许多细胞对SA-β-gal呈阳性染色，这比对照培养物早得多(P.29)达到峰值。为了进一步确认VCLR处理的HPFs中加速的CS，我们检查了P21**Cip1/Waf、P16**INK4a和IL-6基因的表达。如图4D所示，向HPFs补充VCLR混合物导致所有这些CS标志物的表达增加。结果清楚地表明VCLR混合物诱导了HPF培养物的过早CS。

MSC衍生的EVs对CS和SP丰度的影响

越来越多的证据表明，MSC衍生的EVs可以影响CS²⁶。它们对SP干细胞的影响尚未确定。考虑到这一点，我们应用MSC衍生的EVs来评估它们对HPF培养物在CS和SP方面的影。如图5A所示，处于早期衰老前期阶段(PDT 6天)的EV处理的HPF培养物同时显示SP丰度和SA-β-gal阳性细胞的增加。在EV处理的衰老HPF培养物(PDT ≥ 3周)中获得了明显不一致的结果。在这种情况下，观察到SP干细胞百分比增加的明显趋势(p < 0.06)，同时SA-β-gal阳性细胞数量显著减少，这对应于晚期衰老前期阶段的水平(图5B)。总体而言，这些发现与HPF培养物中CS过程中SP的动态高度一致(见图3D)，再次指出衰老细胞和干细胞之间的定量关系。

图5. 细胞外囊泡(EVs)对HPF培养物中SP丰度和SA-β-gal阳性细胞百分比的影响。(A) 未处理和EV处理的衰老前期HPF培养物(P.39)。(B) 未处理和EV处理的衰老HPF培养物(P.51)。数据表示为平均值±SEM。*p < 0.05; **p < 0.01。

讨论

细胞培养物中干细胞小池SP的存在提供了一个自然但仍未被探索的模型，用于研究衰老细胞和干细胞之间的关系。我们使用这个模型来阐明干性与CS之间的联系。为此，我们监测了复制性CS过程中的SP丰度变化，另一方面，应用了细胞重编程和/或CS修饰剂。本研究的主要发现包括：(a) 衰老前期HPF培养物中SP的显著增加，随后在衰老阶段急剧减少；(b) 用于细胞重编程的SMs诱导SP干细胞和衰老细胞的积累，从而提醒山中因子的效果；(c) 通过MSC衍生的EVs修饰CS与HPF培养物中CS过程中的SP动态高度一致，并进一步加强了衰老细胞和干细胞之间的定量关系。

几行证据表明，CS可以支持多能性诱导并在体外和体内提高其功效(由参考文献27综述)。据认为，这种现象主要归因于衰老细胞释放的IL-6²⁸,²⁹。向胰腺β细胞或软骨细胞培养物补充IL-1β、IL-6和/或TNFα进一步支持了SASP成分在促进体细胞去分化中的作用³⁰,³¹。同时，与CS相关的p53–p21通路被认为是iPSCs生成的障碍³²,³³。Ink4/Arf位点(包含p16**Ink4a、p19**Arf和p15**Ink4b基因)也是如此：该位点的瞬时抑制可显著改善iPSCs的生成³⁴,³⁵。HPFs在CS过程中IL-6与P21Cip1/Waf1/P16**Ink4a之间的平衡可能在一定程度上解释了本研究中观察到的SP丰度的双相变化。实际上，衰老前期培养物中IL-6的优势导致SP百分比增加，而衰老培养物中较高的P21**Cip1/Waf1/P16**Ink4a表达导致SP下降(见图2)。有趣的是，当衰老细胞的增加未伴随IL-6表达的升高时，这也伴随着卫星细胞扩增和损伤后肌肉再生的抑制³⁶。或者，细胞损伤和基因毒性应激，特别是，可以同时促进CS和SP的增加。这两个池的伴随积累可能是因为与活跃分裂的分化细胞相比，衰老细胞和干细胞对凋亡更具抗性。

衰老前期HPF培养物中SP的增加可归因于干细胞的增殖或来自MP的细胞的去分化，或两者兼而有之。我们对HPF培养物细胞分选后单独培养SP细胞和MP细胞的实验表明，两个分选培养物中的SP/MP比值都得到了恢复。实际上，在孵育3周后，两种培养物中SP的百分比达到了细胞分选前观察到的水平。我们的结果表明SP细胞分化为成熟成纤维细胞的能力，以及来自MP的成熟成纤维细胞去分化为SP的能力，从而恢复干细胞池。换句话说，我们可以推测，一种特殊的调控回路保持成熟细胞和SP细胞之间的平衡处于相对恒定的水平，因此一定比例的成熟细胞永久去分化为SP细胞，反之亦然。维持这种平衡的能力可能是任何细胞群体的基本特征，确保维持细胞稳态。

我们的体外观察在体内似乎也具有功能意义。在小鼠上进行的实验显示，与年轻小鼠相比，老年小鼠中SP细胞频率大幅增加(超过25倍)。作者还表明，老年小鼠中的SP细胞并未失去其干性，尽管与来自较年轻小鼠的SP细胞相比，它们的归巢效率较低³⁷。考虑到与年龄相关的衰老细胞积累³⁸,³⁹，推测SP干细胞的增加是对这种积累的反应，以维持组织中的细胞稳态，这是很有吸引力的。从这个角度来看，值得一提的是，衰老前期培养物中衰老细胞的浓度与老年动物组织中的浓度相当³⁹。

如上所述，通过定义的转录因子(例如，OSKM)实现的诱导多能性和细胞重编程通常伴随着衰老细胞的积累(由参考文献1综述)。在这里，我们将这一重要观察扩展到细胞去分化的另一个诱导剂——用于细胞重编程的SMs。实际上，VCLR处理的HPF培养物显示SP细胞和SA-β-gal阳性细胞百分比同时增加(见图4)。与山中因子的数据一起，这意味着去分化和衰老细胞池的升高独立于细胞重编程诱导剂的性质而发生。MSC衍生的EVs影响的观察(图5)进一步支持了衰老细胞和干细胞之间的关系。这些影响可能在短寿命和长寿命物种之间有所不同⁴⁰。当考虑到植物细胞时，CS与细胞重编程之间的联系更为明显。实际上，经历CS的黑暗暴露的Nicotiana tabacum叶片表现出去分化细胞的特征，包括染色质去凝集、核仁破坏和rRNA基因凝集⁴¹,⁴²。据建议，细胞去分化也可能是哺乳动物极端应激条件的结果之一⁴³。总的来说，这些观察指向对立的细胞分化过程、细胞重编程和CS之间深层次的关系，表明它们之间的相互作用可能是一种普遍的生物现象。