摘要
与疾病相关的小胶质细胞状态被认为促进了阿尔茨海默病(AD)的进展，但表征这些状态及其与病理的关系仍具挑战性。本文介绍了一种名为CODEX-CNS的多重蛋白质成像技术及配套的自定义数据分析流程，用于人类脑样本分析。我们对8名阿尔茨海默病患者和8名健康对照者额叶皮层样本中的704,706个细胞进行了分析，并在同一组织切片中绘制了包括血脑屏障、脑膜组分和细胞-细胞相互作用在内的特征图谱。在我们识别的小胶质细胞群体中，发现了一种与年龄相关的边界相关巨噬细胞样小胶质细胞亚群。通过基于空间邻域的小胶质细胞亚群分类，我们确定了一种与致密β-淀粉样蛋白斑块显著相关的边界相关巨噬细胞样小胶质细胞亚群，我们将其称为人类斑块相关小胶质细胞(human plaque-associated microglia, HPAM)。本研究为阿尔茨海默病中的小胶质细胞异质性提供了新见解，并提供了一种在单细胞蛋白质水平上表征脑细胞的空间分析新方法。
主要内容
理解与脑疾病相关的微环境、细胞和分子特性的复杂性对于识别神经系统疾病驱动因素至关重要。阿尔茨海默病(AD)是一种异质性疾病，其特征是存在细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成的老年斑块、过度磷酸化tau蛋白在细胞内积聚形成的神经原纤维缠结以及炎症反应，这些最终导致神经退行性变。AD病理生物学涉及在分子、细胞和组织水平上展开的复杂相互作用，几乎涉及所有主要脑细胞类型。
先前的比较研究表明，早期AD阶段患者与年龄和性别匹配的对照组相比，疾病相关转录变化具有细胞类型特异性。因此，理解单个细胞类型（如它们的形态、分子表型和与其他细胞的通信）对于开发阿尔茨海默病实验模型和治疗至关重要。
最近的单细胞基因组和蛋白质组分析揭示了脑细胞类型的广泛多样性。通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)方法，已在AD中识别出几种小胶质细胞亚群或活化状态。在阿尔茨海默病小鼠模型中，两项使用scRNA-seq的研究识别出一种小胶质细胞表型，称为小胶质神经变性表型或疾病相关小胶质细胞(DAM)，与Aβ斑块相关。然而，虽然转录组数据表明此类小胶质细胞亚群存在于动物模型中，但关于人类AD中是否存在类似的小胶质细胞群体尚未达成共识。此外，跨物种单细胞分析表明，神经退行性疾病的风险基因在人类小胶质细胞中显著过表达。因此，需要超越基因表达的全面表征，例如空间解析分析和蛋白质组学，以深入了解小胶质细胞亚群在人类AD病理生理学中的作用。
我们对阿尔茨海默病中小胶质细胞多样性的理解受到现有技术的限制。传统的单细胞方法需要组织解离，例如流式细胞术、飞行时间质谱流式细胞术(CyTOF)或scRNA-seq，无法评估细胞-细胞相互作用或细胞与AD病理特征（如异常细胞外蛋白聚集体）的相互作用。虽然下一代空间转录组技术有价值，但它们不能在单细胞水平上提供深入的蛋白质组学信息。由于蛋白质聚集体是AD的关键特征，在单细胞分辨率下识别蛋白质特异性特征并同时将其与疾病脑微环境整合起来特别有意义。
共检测索引(CODEX)方法结合了单细胞技术的高参数能力与空间分辨率。CODEX是一种多重免疫荧光(IF)成像技术，依赖于对DNA偶联抗体的互补荧光标记DNA探针的循环添加和去除，已用于在体内可视化多达100种蛋白质。此方法使所有主要细胞类型和亚结构能够在单个组织切片中得到标记。迄今为止，CODEX技术主要部署在癌症研究中，而用于神经科学应用的使用有限。这是因为脑组织具有高自发荧光和复杂的细胞形态学，难以进行分割等挑战。
本研究中，我们通过修改现有CODEX技术以研究中枢神经系统(CNS)组织，定义了阿尔茨海默病患者和健康人脑组织样本中髓系细胞的异质性。CODEX-CNS方法包括脑组织特异性组织制备方案、能够检测复杂细胞形态的细胞分割方法，以及适用于细胞表型和空间分析的自定义分析流程。应用CODEX-CNS，我们基于形态、蛋白质表达和空间邻域特征对小胶质细胞异质性进行了表征。我们证明脑微环境与小胶质细胞表型相关，这是仅基于蛋白质表达的传统聚类分析无法检测到的，并确定了一种在阿尔茨海默病患者大脑中积累且与致密Aβ斑块密切相关的特殊小胶质细胞亚群。这些发现为小胶质细胞亚群在人类AD病理中的作用提供了见解，表明细胞身份可能由局部微环境决定，并展示了CODEX-CNS技术在人类脑组织空间蛋白质组研究中的应用。
结果
CODEX-CNS技术用于研究人类大脑
为克服人类脑组织样本中高自发荧光的限制——这是脑库中最常见样本类型，我们开发了CODEX-CNS工作流程。我们通过添加预处理步骤修改了标准CODEX协议，该步骤涉及将福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织切片在4.5% H₂O₂浴中孵育，同时暴露于广谱LED光下。处理后，组织切片中的强烈自发荧光和可见脂褐素颗粒显著减少。在处理样本与未处理相邻切片之间，使用相同抗体、成像通道和曝光时间检测到信噪比提高。本研究中所有数据均使用CODEX-CNS协议在FFPE额叶皮层样本上获取。本研究共分析了16个样本：首先分析了8个样本(4名AD患者与4名健康对照者)，随后使用CODEX-CNS在另外8个独立样本中验证了发现。为进一步确认结果，我们在两个独立实验室对35个样本进行了常规IF分析。总体而言，本研究包括51个样本，其中26个AD样本和25个健康对照样本。
我们设计了一个包含32种抗体的面板，用于检测神经元、神经胶质细胞、脑血管、外周免疫细胞以及与AD相关的病理特征。作为概念验证，神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞、小胶质细胞、血管和Aβ斑块在同一个组织切片中被识别，证实CODEX-CNS可以在存档FFPE脑组织样本中同时检测几种细胞群体和非细胞结构。与已知人类大脑皮层解剖学一致，我们的图像数据清晰区分了灰质(GM)和白质(WM)区域，以及不同皮层的分层。我们还能够通过星形胶质细胞终足与血管接触的存在，详细可视化血脑屏障成分。此外，同时对血管、免疫细胞和星形胶质细胞的标记物进行成像，使我们能够可视化脑膜膜：软脑膜和蛛网膜，以及与软脑膜表面接触的浅表神经胶质限制膜。这些数据充分说明CODEX-CNS提供了足够高的成像分辨率，可以可视化CNS细胞结构。
本研究中，我们使用机器学习分割方法，可以检测每个脑细胞的胞质和突起。使用ariadne.ai SPATIAL平台中预训练的基于深度学习模型进行细胞实例分割。此分割方法基于神经元核(NEUN)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、钙结合适配器分子1(IBA1)和OLIG2表达分别捕获神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和少突胶质细胞/少突胶质细胞前体细胞。在初始CODEX-CNS数据集中，共分割了471,181个细胞，其中267,970个位于GM，192,545个位于WM，10,666个位于脑膜。我们使用GM和WM中分割的细胞进行后续分析。
AD大脑特有的细胞-细胞相互作用
使用CODEX-CNS，我们通过同时在单细胞分辨率下可视化Aβ和主要脑细胞类型，捕获了AD脑微环境的病理特征。在AD中已描述了弥散性和致密核Aβ斑块。我们观察到载脂蛋白E(ApoE)和Aβ染色在致密(图2a-c，红箭头)和弥散(图2a-c，虚线圆圈)Aβ斑块中共定位，这与ApoE在Aβ斑块形成中的报道作用一致。高表达GFAP和Vimentin的反应性星形胶质细胞主要定位于致密Aβ斑块周围(图2d,e)。除了星形胶质细胞外，小胶质细胞和潜在的浸润巨噬细胞被检测到围绕Aβ斑块(图2f-i)。与人类AD大脑中先前报道一致，围绕Aβ斑块的一些IBA1⁺细胞(小胶质细胞和巨噬细胞标记物)表达了CD163(图2i)——一种主要由边界相关巨噬细胞(BAMs)表达的标记物，这表明BAMs已浸润到脑实质或一些小胶质细胞已响应局部微环境获得BAM表型。
此外，除了胶质反应外，我们发现一些Aβ斑块附近区域缺乏正常的突触后密度蛋白95(PSD95)和突触素斑点染色，但含有突触素和神经丝蛋白的异常球状积聚(图2j-l，箭头)。这些观察与致密Aβ斑块附近突触和神经突营养不良一致。
接下来，我们利用不同细胞类型的同步检测分析了健康人脑中细胞-细胞相互作用及其在AD中的变化。分析显示，在健康人额叶皮层GM区域中，神经元和少突胶质细胞/少突胶质细胞前体细胞之间、小胶质细胞和星形胶质细胞之间存在优先接触。少突胶质细胞在靠近神经元胞体周围的位置，也称为周边神经元少突胶质细胞，为神经元提供代谢支持。然而，小胶质细胞和星形胶质细胞在生理条件下相互作用的生物学作用则探索较少。小胶质细胞和星形胶质细胞也与血管频繁相互作用。在WM中，少突胶质细胞/少突胶质细胞前体细胞相互作用的频率高于与其他细胞类型的相互作用，这与少突胶质细胞沿神经元轴突的线性排列特征以及少突胶质细胞形成的髓鞘对轴突的支持功能一致。
我们进一步探索了AD与健康大脑之间不同细胞相互作用频率的差异。在AD大脑的GM中，小胶质细胞-小胶质细胞接触比对照大脑中更丰富，这可能是由于它们倾向于围绕Aβ斑块聚集。在AD大脑的GM中，我们检测到相互作用小胶质细胞中CD163和人类白细胞抗原DR同种型(HLA-DR)表达更高，而增殖细胞核抗原(PCNA)表达没有显著差异，这表明AD大脑GM中微胶质细胞的积累是由于迁移而非细胞增殖。我们还观察到在AD大脑GM中，星形胶质细胞与神经元和少突胶质细胞/少突胶质细胞前体细胞之间(反之亦然)的相互作用有增加的趋势。同时，我们发现与星形胶质细胞相互作用的神经元呈现出更高水平的γH2A.X（DNA损伤标记），表明星形胶质细胞在AD背景下可能与受损神经元通信。
综上所述，该分析加深了我们对人类额叶皮层中细胞通信的理解，并确定了AD与健康人脑之间特定细胞-细胞相互作用的差异。
小胶质细胞形态随组织微环境的变化
虽然先前研究已在小鼠模型中对小胶质细胞形态进行了复杂计算分析，但需要对人类小胶质细胞进行详细的形态计量学特征分析。为了对人类大脑(使用健康对照和AD样本，每组n=4)中髓系细胞的形态表型进行分析，我们对所有IBA1⁺分割细胞基于12个形态特征进行无监督聚类，这些特征通过细胞、胞体、突起、分支和细胞凸包(测量细胞坚实度)的掩膜计算(图4a和附图4a)。我们的初始分析确定了三个主要聚类，我们注释为圆形(高细胞圆度和缺乏突起)、中间型(少数粗突起)和分支型(大量突起和分支)(图4b,c和附图4b,c)。为了探索分支聚类中的异质性，我们进行了子聚类分析，进一步将这些小胶质细胞分为三个子聚类(分支型1-3)，主要通过细胞和胞体大小、胞体圆度、突起数量和分支以及突起长度区分(图4b,c和附图4b)。
值得注意的是，细胞圆度和坚实度与单核细胞和巨噬细胞标记物CD14和CD163的表达高度相关，而与细胞分支相关的特征则与小胶质细胞标记物跨膜蛋白119(TMEM119)的表达相关。这些形态学上不同的细胞群在额叶皮层的不同区域有不同比例，中间聚类在WM区域更普遍，而分支型2和分支型3聚类在GM区域更普遍。在AD和对照脑之间，形态学聚类的比例未观察到统计学显著差异。
作为变化的小胶质细胞形态可能源于其微环境变化，我们进一步检查了额叶皮层所有8个样本中5种形态定义的髓系细胞群的细胞邻域。我们进行了定制邻域分析，量化每个髓系细胞质心30μm半径内存在的不同标记物的丰度(图4f和方法部分)。在GM和WM中，圆形形态与血管标记物和PCNA显著相关。这种形态也与ApoE相关，除了在AD患者GM中，ApoE高水平与Aβ斑块共定位。此外，分支型3形态与微管相关蛋白2(MAP2)表达显著相关，无论疾病状态如何，表明小胶质细胞高度分支与树突相关。分支型3形态在对照大脑GM中还与NeuN相关，但在AD大脑中则不相关。值得注意的是，分支型2形态与Aβ、ApoE和NeuN的空间关联仅在AD患者GM中显著。相比之下，在对照大脑GM中，或AD大脑WM中(其中Aβ斑块较少见)，这种形态与神经丝蛋白相关。这一结果表明，具有大型胞体的高度分支细胞可能与AD的病理特征相关。总体而言，这些数据表明，人类老年大脑具有定义明确的小胶质细胞形态表型，这些表型在GM和WM以及周围组织微环境中差异分布。
脑髓系细胞形成5种基于蛋白质的聚类，具有特定空间分布
除形态特征外，区分脑髓系细胞表型及其在脑组织中的空间组织对其在疾病中的多样性与功能的理解至关重要。使用CODEX-CNS，我们在8个阿尔茨海默病患者和年龄匹配对照者的额叶皮层样本中，对63,873个IBA1⁺分割细胞进行Leiden无监督聚类(图5a)。
基于IBA1、TMEM119、CD74、CD14、CD163、CD68、CD11b、CD11c、HLA-DR和CD45等10个标记的表达，我们确定了两种髓系群体(A和B)(图5b和附图5a-c)。群体A表现出单核细胞/巨噬细胞表型，群体B表现出小胶质细胞表型，基于CD163(BAM标记物)和TMEM119(小胶质细胞标记物)的存在与否(图5b)。为进一步探索这两个群体的异质性，我们进行了子聚类分析，得到5种髓系细胞群体(图5b)。5个聚类基于TMEM119和/或CD163的表达以及它们在组织中的位置进行注释(方法部分)。注释的聚类包括：单核细胞(MO)、血管周围巨噬细胞(PVMs)、BAM样小胶质细胞(BLM)、小胶质细胞1(MG1)和小胶质细胞2(MG2)。BLM亚群体中的大多数细胞同时表达CD163和TMEM119蛋白，表明一种独特的表型，跨越小胶质细胞和PVMs。这些5种髓系聚类在组织样本中被映射回原位并验证(图5c和附图5)。
我们接下来评估了基于形态学和蛋白质表达定义的聚类之间的对应关系。单核细胞和PVMs主要属于圆形形态聚类，而BLM、MG1和MG2表现出形态学异质性(图5d)，表明每种蛋白质基础的小胶质细胞亚群中存在形态学多样性。髓系细胞的分割映射显示，这些亚群在GM和WM区域中的比例不同(图5e,f和附图5e)。对于所有样本，MG1和MG2聚类最丰富，而单核细胞最稀少(图5f)。然而，MG2是GM中主要的聚类，而MG1是WM中主要的聚类(图5f)。MG1中CD74、CD68、CD11c和HLA-DR的表达与在小鼠和人类衰老过程中WM区域中报告的活化小胶质细胞表型一致。此外，我们观察到PVMs和单核细胞在GM中比例显著高于WM。在AD和健康大脑之间未检测到聚类比例的统计学显著差异。
随后，我们探讨了确定的蛋白质基础亚群是否与特定微环境特征或邻域相关。PVMs与血管标记物和PCNA显著相关(图5g,h和附图7a,b)。值得注意的是，当考虑细胞掩模作为其邻域时，单核细胞与血管标记物特异性相关，这是由于单核细胞与血管的共定位。在GM区域，MG1与神经元标记物相关(图5g,h)。BLM亚群体在AD脑GM中与Aβ、ApoE和GFAP显著相关(图5g,h)。这表明BLM迁移到AD脑中的Aβ斑块。值得注意的是，在对照脑中，PVMs而非BLM与ApoE相关(图5g和附图7b)。这可以用血管平滑肌细胞和周细胞在生理条件下表达ApoE来解释。
这些数据表明脑组织中髓系亚群存在不同的邻域偏好，突显了AD与对照受试者之间的差异。
BLM亚群体与致密Aβ斑块形成最强关联
观察到某些形态学(分支型2亚群体)和蛋白质基础的小胶质细胞亚群(BLM亚群体)与邻域中Aβ表达显著相关，我们接下来使用CODEX-CNS了解它们与不同类型Aβ斑块的关系。我们训练了一个机器学习模型来识别Aβ斑块并将其区分为致密和弥散类型(图6a,b)。对于每个IBA1⁺分割细胞，我们测量了从其质心到最近Aβ斑块的距离(图6c)。由于髓系群体在GM和WM区域中基于其形态和蛋白质表达存在差异，我们仅在Aβ斑块占主导的GM中分析它们与Aβ斑块的距离。结果显示，形态学聚类在致密和弥散Aβ斑块附近均存在异质性，其聚类比例基于距Aβ斑块的距离有细微变化(图6d，左图)。这表明形态学聚类与Aβ斑块之间的关联较弱。
检查基于蛋白质的髓系细胞亚群与Aβ斑块距离，我们发现BLM亚群体在接近(0-5μm)致密Aβ斑块(~40%)的细胞中比例最高，且随着与斑块距离的增加，此比例降低(图6d,e，上右图)。在接近(0-5μm)弥散Aβ斑块的细胞中，仅~20%是BLMs，且该比例基于距斑块的距离变化不大(图6d,e，下右图)。为进一步证实这些发现，我们对10名AD和10名健康对照者的FFPE切片进行了常规IF标记。与CODEX-CNS分析结果一致，重现蛋白组BLM亚群体关键特征的CD68⁺HLA-DR⁺髓系细胞在致密Aβ斑块附近频繁出现(图6f)。此外，CD68⁺HLA-DR⁺髓系细胞也在健康对照者的脑实质中存在(附图6a)，这已由CODEX-CNS分析指示(图5f)。因此，我们在AD患者大脑中确定了致密Aβ斑块与BLM聚类之间的强空间关联。
由于在BLM亚群体中微胶质细胞和巨噬细胞标记物共表达，我们对5种蛋白质基础的髓系聚类进行了拟时分析，以预测可能的发育轨迹。结果显示从PVM到MG2的轨迹，表明PVM群体可能代表BLM亚群体分化轨迹中更早的谱系，反之亦然(图6g)。与它们的血液起源一致，我们的数据表明单核细胞群体不属于PVM和MG2之间获得的轨迹(图6g)。接下来，我们绘制了沿推断轨迹的邻域分析得分与拟时得分的关系，以探究细胞邻域如何跨轨迹变化。该分析显示，当细胞从PVM过渡到MG2时，它们与血管(闭合蛋白-5、平滑肌肌动蛋白、IV型胶原)的关联减少，同时与神经元(NeuN)和AD样本中Aβ的关联增加(图6h)。这些结果表明，取决于脑微环境，PVMs和小胶质细胞之间可能存在表型转变，而单核细胞与所有其他细胞分离。
基于蛋白质的聚类邻域分析表明，BLM细胞比其他两个小胶质细胞群体受到血管更广泛的包围(图6i)。此外，距离分析显示BLM是最近的实质髓系亚群体到血管(图6j)。这通过IF标记实验得到进一步验证，其中CD163⁺髓系细胞与AD中的致密Aβ斑块和血管相关，而在健康人脑中仅与血管相关(附图6b)。总体而言，我们的数据显示BLM不仅与脑血管系统紧密相关，还与致密Aβ斑块相关。
BLM与致密Aβ斑块密切相关的观察可能的一种解释是PVMs浸润脑实质并获得类似微胶质细胞表型。为探索这一假设，我们评估了当暴露于Aβ时，源自人诱导多能干细胞(iPSCs)的微胶质细胞是否上调CD163表达。分析几个已发表的scRNA-seq数据集，我们未检测到在Aβ刺激的iPSC衍生微胶质细胞中或移植到表达Aβ斑块的AD小鼠模型中时，CD163基因上调(附图6c-e)。因此，鉴于人类iPSC衍生微胶质细胞对Aβ无CD163上调反应，这些结果表明人类中BLM亚群体的一种可能来源是浸润的PVMs，应在未来探索。
脑微环境驱动人类AD皮层中特定髓系表型的积累
鉴于微环境是小胶质细胞和巨噬细胞表型的有力决定因素，我们接下来使用CODEX-CNS基于周围微环境对髓系细胞进行聚类。在AD大脑GM的13,444个IBA1⁺分割细胞中，我们基于每个细胞质心30μm半径内表达的不同蛋白质的百分比，使用Leiden聚类。我们基于邻域获得16个聚类(0-15聚类)(图7a,b和附图7a以及附图8a)。值得注意的是，应用20μm至50μm的不同半径进行邻域分析，为BLM和微胶质细胞聚类提供了可比结果(附图8b)。相比之下，单核细胞和PVMs对血管的关联随着应用更大半径而减少，而单核细胞越来越表现出与神经元标记物的关联(附图8b)。我们进一步探索了构成这些基于邻域聚类的细胞的蛋白质和形态特征(图7c,d)。
大多数聚类在邻域中有神经元成分，对应于这些聚类的髓系细胞表现出相似的蛋白质和形态模式(图7b-d)。然而，3类和11类与MAP2和神经丝蛋白的显著表达相关(图7b)。4类、8类和10类在邻域中显示出GFAP和/或Vimentin的升高表达，表明这些髓系细胞亚群与星形胶质细胞相关(图7b)。值得注意的是，4类细胞周围几乎只有GFAP，表现为CD74高表达，表明星形胶质细胞与CD74⁺微胶质细胞/巨噬细胞之间存在特定相互作用(图7b,c和附图8c)。这与在脑转移瘤中报道的pSTAT3⁺反应性星形胶质细胞和CD74⁺微胶质细胞/巨噬细胞之间的串扰一致。4类细胞位于脑组织边缘，可能表明微胶质细胞向星形胶质细胞呈递来自脑膜的抗原，因为CD74在抗原呈递中起着关键作用(附图8c)。在高度与血管标记物相关的聚类(1类和12类)中，12类特征是巨噬细胞相关蛋白(14、CD163和CD11b)高表达、TMEM119缺失和圆形形态(图7b-d)，与PVMs一致。
我们发现三个与Aβ显著相关的小胶质细胞亚群：0类、9类和15类。0类细胞特征是在邻域中Aβ含量较低而ApoE表达较高，与其他Aβ相关细胞聚类相比(图7b)。相比之下，9类细胞处于缺乏ApoE的Aβ沉积附近(图7b)。15类包含邻域中Aβ含量最高的细胞。除了Aβ外，15类细胞还被GFAP和Vimentin显著水平以及ApoE(程度较低)包围(图7b)。这些数据表明15类与ApoE⁺ Aβ斑块和反应性Vimentin⁺星形胶质细胞相关。此聚类细胞表现出特定表型，特征是CD68、CD11c、HLA-DR和CD45高表达，以及继血管相关12类之后第二高的CD163表达(图7c)。此外，15类中CD163⁺细胞比例与12类相当(附图8d)。此外，15类细胞表现出最大细胞和胞体大小以及最厚突起(图7d)。小胶质细胞与Aβ沉积的关系异质性促使我们进一步探索它们与不同Aβ斑块类型的关系。值得注意的是，我们的距离分析显示9类最接近弥散Aβ斑块，而15类最接近致密Aβ斑块(图7e)。
我们随后询问16个基于邻域的髓系细胞聚类是否与先前基于蛋白质表达(图5)或形态学(图4)获得的聚类相关。虽然基于邻域的聚类和基于蛋白质的聚类之间存在异质性，但我们发现4类(星形胶质细胞相关)主要由MG2聚类的细胞组成，12类(血管相关)主要由PVMs组成，15类(Aβ相关)主要由BLMs组成(附图9a)。基于蛋白质表达的BLM和15类细胞之间的关键区别是BLMs是TMEM119⁺CD163⁺细胞，而15类细胞特征是TMEM119表达水平较低。关于形态学聚类，我们观察到16个基于邻域的细胞分布在所有形态学聚类中，圆形聚类在12类中特别代表(附图9b)。
进一步探索Aβ相关邻域聚类(0、9和15)，我们发现15类——与致密Aβ斑块相关的聚类——是BLM群体中的一个子聚类(图7f)，在与健康对照(n=4)相比的AD(n=4)人额叶皮层样本中富集(图7g)。由于其与小胶质细胞(BLMs)相比独特的表型(CD163⁺CD68⁺HLA-DR⁺CD11c⁺CD45高表达TMEM119低表达)，以及与人脑中Aβ斑块的关联，我们将这个聚类命名为人类斑块相关小胶质细胞(HPAM)(图7f,g)。值得注意的是，在比较AD病例中属于HPAM聚类的髓系细胞和在健康对照中检测到的极少数时，我们在两种条件下观察到相似的形态特征，而AD中的HPAM在邻域中表现出Aβ和反应性星形胶质细胞相关标记物(如GFAP)的富集(附图8)。类似地，AD中的HPAM表现出TMEM119降低和CD68表达升高的蛋白组签名(附图8)。
为验证我们的发现，我们使用CODEX-CNS分析了另一组4名AD患者和4名健康对照者的额叶皮层样本(附图9)。与原始CODEX-CNS分析一致，基于蛋白质表达的髓系细胞聚类重述了先前确定的髓系细胞聚类，包括BLM(附图9a)。这些髓系细胞亚群还显示出与原始聚类相似的蛋白质表达签名(附图9b)。此外，BLM聚类在邻域中与Aβ相关标记物表现出紧密关系(附图9c)。同样，将邻域聚类与蛋白质表达和形态学特征相结合，为最终细胞聚类提供与原始CODEX-CNS分析可比的结果，包括HPAM(15类)的识别(附图9d)。这通过HPAM相关标记物(如CD11c、CD163和HLA-DR)与Aβ距离之间的最强逆相关得到进一步支持，表明表达这些标记物的细胞与Aβ紧密相关(附图9e)。
最后，我们使用IF标记对另一组8名AD和7名健康对照者脑样本进行了HPAM群体的验证。我们发现，靠近致密Aβ斑块的髓系细胞显示出CD11c表达上调，而与这些斑块无接触的髓系细胞在相同样本中为CD11c⁻(图7h)。类似地，致密Aβ斑块相关的髓系细胞也特征为低表达家庭稳态微胶质细胞标记物TMEM119(IBA1⁺TMEM119低表达)，而未与致密Aβ斑块相互作用的髓系细胞为IBA1⁺TMEM119高表达细胞(图7h)。相比之下，健康对照人脑额叶皮层中的髓系细胞不表达CD11c，并表现出更均匀的TMEM119表达模式和形态(附图10a)。
我们随后使用机器学习工具经验性确定了髓系细胞特征(形态学、蛋白质表达和邻域)预测Aβ斑块存在能力。我们的发现表明，致密Aβ斑块可以由附近的髓系细胞预测，而弥散Aβ斑块更难以预测(附图10b)。髓系细胞的邻域是致密Aβ斑块的最佳预测因子，其次是蛋白质表达特征(附图10b和附图10)。然而，髓系细胞的形态是Aβ斑块的较差预测因子(附图10b)。最佳预测是结合形态学、蛋白质表达和邻域(附图10b)。为了解特定髓系细胞特征对致密Aβ斑块预测的贡献，我们按与致密Aβ斑块的相关性对所有个别髓系细胞特征进行排名，发现CD11c和CD68表达是最强相关特征(附图10)。此外，邻域特征如GFAP或Vimentin也是预测致密Aβ斑块的最强相关特征(附图10)。
因此，我们使用CODEX-CNS分析健康对照者和AD患者额叶皮层样本中髓系细胞的形态、蛋白质表达谱和邻域的分析，已识别出一种可能与AD相关的特殊小胶质细胞亚群，该亚群与人脑中的致密Aβ斑块相关。
讨论
本研究报告了对阿尔茨海默病患者与健康对照者额叶皮层样本中小胶质细胞亚群的细胞-细胞相互作用和表征，基于形态、蛋白质表达和微环境进行区分。先前的大多数研究主要在小鼠中定义了髓系细胞群体，仅基于转录、蛋白质或形态数据。然而，CODEX-CNS使蛋白质、形态和微环境特征的整合得以实现，以识别AD FFPE脑样本中空间隔离、疾病富集的亚群。脑细胞位于一个微妙的生态系统中，在此系统中不同细胞类型之间互补和相互依赖的关系对组织功能至关重要。当前的单细胞技术不能提供关于病理条件下脑微环境的关键信息，这些信息对于获得有关协调病理生物过程的细胞-细胞信号级联的新见解至关重要。在此背景下，如CODEX等高通量、单细胞空间蛋白质组方法可以解决神经科学中先前建立的单细胞技术的关键局限性。然而，将这些应用于脑研究受到人类老年脑样本中自发荧光的复杂性挑战。
通过修改现有CODEX协议，我们的CODEX-CNS方法克服了这一障碍，实现了FFPE脑样本中高质量的成像基础蛋白质分析。利用CODEX技术测量超过100种蛋白质的能力，我们优化的平台为未来研究解构人类CNS中分子和依赖于上下文的细胞异质性奠定了基础。
应用CODEX-CNS于阿尔茨海膜病患者和健康对照者的额叶皮层样本，我们的蛋白质基础聚类分析确定了一种小胶质细胞亚群(BLM聚类)，具有BAM样表型。一个有趣的观察是BLM聚类与星形胶质细胞、ApoE和AD脑中致密Aβ斑块的特定关联。然而，在AD患者和健康人中均观察到相似比例的BLM，表明BLM是随年龄变化的小胶质细胞亚群，迁移到AD中的Aβ斑块部位，或Aβ斑块在其周围发育。神经退行性疾病相关小胶质细胞群体(如DAM)也在健康小鼠大脑中被报道。然而，与我们在BLM中观察到的相似，当Aβ斑块存在时，这些特征会特异性地定位于Aβ斑块周围。
我们的数据表明BLM亚群表达CD163，此前被确定为CNS相关组织中BAMs的标记物。此外，几项研究已报告AD脑中Aβ斑块附近存在CD163⁺微胶质细胞。Muñoz-Castro等最近提出这些CD163⁺实质细胞是浸润单核细胞而非微胶质细胞。这与传统观点相矛盾，即血液衍生细胞不浸润AD脑，如5xFAD小鼠的parabiosis研究所示。然而，CD163⁺细胞在老年或AD小鼠脑中未报道，表明髓系浸润或微胶质细胞状态可能存在物种差异。由于这种CD163⁺髓系群体似乎具有人类特异性，其起源无法通过parabiosis或命运图谱研究进行调查。我们的拟时分析中观察到的细胞轨迹表明BLM代表PVM和小胶质细胞样表型之间的过渡状态，这通过分析显示在暴露于Aβ的人iPSC衍生微胶质细胞中CD163上调缺失的已发表scRNA-seq数据集得到支持。然而，鉴于PVMs和微胶质细胞共享胚胎起源和相似的转录和蛋白组谱，它们可能对局部血管或实质Aβ积累作出类似响应，从而限制了我们当前CODEX-CNS面板的拟时分析分辨率。需要进一步研究来阐明人脑实质中CD163⁺细胞的来源及其在Aβ病理中的作用。
我们的CODEX-CNS协议的一个关键优势是将微环境整合到脑髓系细胞聚类中。与scRNA-seq不同，CODEX-CNS能够同时进行蛋白质表达、形态和局部邻域的单细胞分析。我们的分析确定了一种与Aβ、ApoE和Vimentin⁺星形胶质细胞相关联的细胞簇，该簇具有特定的蛋白质签名和形态，并被命名为HPAM。HPAM中观察到的大胞体大小和粗突起可能反映了Aβ斑块部位的高吞噬活性。在蛋白质表达方面，HPAM组合了DAM(CD11c)、抗原呈递(HLA-DR)、吞噬(CD68)和巨噬细胞(CD163)标记物，以及高表达的泛白细胞标记物CD45。与不同微胶质细胞签名相关的标记物的同时表达加强了关于人类AD相关微胶质细胞签名缺乏共识的观点。值得注意的是，HPAM代表BLM聚类内的一个亚群，表明传统上通过有限数量的标记物识别的细胞群体可能代表未知数量的不同亚群组合。虽然BLM在健康供体和AD供体中均被发现，但HPAM子簇在AD脑中显著富集，与Aβ斑块相关联。这些数据表明微环境可以揭示常规蛋白质基础聚类分析中错过的疾病相关细胞亚群。
细胞与特定邻域、其蛋白质表达和形态的关联暗示了其功能性。例如，HPAM中CD68高表达表明这些细胞可能在Aβ吞噬中起重要作用。相反，Aβ周围HLE-DR表达的细胞可能表明向浸润T细胞的抗原呈递。我们的结果表明HPAM细胞与致密Aβ斑块而非弥散Aβ斑块相关，后者还与异常神经突相关。因此，HPAM细胞可能具有的假定吞噬和抗原呈递功能可能由神经突病理而非Aβ沉积本身引发。HPAM细胞对AD病理的重要性进一步通过最近的多组学研究得到支持，该研究对接受针对Aβ的抗体Lecanemab治疗的AD患者大脑中微胶质细胞Aβ清除进行了表征，观察到Aβ富集区域中HPAM相关标记物显著上调。这可能指向HPAM在Aβ清除中的作用，未来可能被治疗性开发。因此，CODEX-CNS将大大促进研究髓系细胞与这种仍无法治愈的神经退行性疾病的阿尔茨海默病病理标志物之间的亲密关系，促进新治疗方法的发展。
总体而言，CODEX-CNS将蛋白质水平上的单细胞特征与其空间位置和形态结合，代表了一种强大的方法，用于研究人脑细胞结构，将以前所未有的分辨率提供对神经系统疾病细胞机制的新见解。
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