摘要：小胶质细胞参与阿尔茨海默病病理从最早阶段开始的进程，提示对临床阿尔茨海默病各阶段进行脑脊液小胶质细胞图谱分析有助于治疗开发与监测。我们分析了两组脑脊液队列（共计834例），涵盖从认知正常、临床前到痴呆阶段，识别出109种失调的小胶质细胞相关蛋白。富集分析显示，临床前阿尔茨海默病中涉及固有免疫过程和细胞募集，而阿尔茨海默病痴呆阶段则表现出适应性免疫和巨噬细胞反应。随后，我们将体内小胶质细胞蛋白质谱与体外来源的小胶质细胞转录组特征（如疾病相关小胶质细胞表型）进行比对。转录组特征并非特异于某一临床阶段，而是贯穿整个过程。我们筛选出一个18种蛋白质的组合，突显了临床前与痴呆阶段之间的明确差异。我们的发现强调了基于小胶质细胞的生物标志物研究在阿尔茨海默病分期中的潜力，提供了对小胶质细胞在临床阿尔茨海默病阶段动态变化的见解，以及转录组特征如何转化为蛋白质谱。
正文：阿尔茨海默病是一种多因素疾病，源于年龄、遗传和环境等多种风险因素的复杂相互作用。这些因素的相互作用触发多种病理过程，推动疾病进展。其中，神经炎症和小胶质细胞日益被认为是阿尔茨海默病神经退行性变的重要驱动因素。尽管小胶质细胞仅占脑细胞总数的约10%，但其日益凸显的表型多样性表明其在脑功能中具有重要且复杂的参与。假设小胶质细胞被启动以清除有害的标志性阿尔茨海默病斑块，但随着病理不断积累，小胶质细胞保持慢性激活并变得功能失调。这些过程随年龄增长而加剧；老化的小胶质细胞失去正常功能，并可能变得具有免疫原性。在阿尔茨海默病临床阶段体内捕捉小胶质细胞状态对于开发旨在改变小胶质细胞功能以阻止阿尔茨海默病的新疗法至关重要，这一挑战尚未被攻克。
最近在脑脊液蛋白质组学和单细胞转录组学方面取得了显著进展，后者为开发单细胞小胶质细胞图谱奠定了基础。体外小胶质细胞的转录组学揭示了疾病相关的异质性表型，包括阿尔茨海默病脑活检、死后组织和实验模型中的疾病相关小胶质细胞表型。疾病相关小胶质细胞表型已被一致证明表现出时间异质性，这可能反映在脑脊液中分泌蛋白水平的异常变化中，这是评估阿尔茨海默病病理的有价值的体内代用指标。此外，阿尔茨海默病中的小胶质细胞激活被假设有两个高峰：早期保护性高峰和晚期促炎性高峰。人类脑脊液研究显示多种小胶质细胞蛋白具有这种双重性，包括 sTREM2、MIF 和 sAXL，它们在阿尔茨海默病早期阶段升高，可能是对淀粉样蛋白病理积累的保护性反应。利用单细胞转录组学和蛋白质组学的数据可以揭示阿尔茨海默病连续谱各阶段小胶质细胞特征的脑脊液概况。
在本研究中，我们将现有的转录组数据集与我们高通量邻近延伸分析法检测的来自临床前阿尔茨海默病和阿尔茨海默病痴呆个体的脑脊液数据集相结合。PEA 蛋白质组学是一种基于抗体的多重蛋白质组学已建立方法，用于识别可转化为单一免疫测定和组合的生物标志物候选物，这对临床和试验实施至关重要。我们识别并独立验证了阿尔茨海默病临床阶段的小胶质细胞相关蛋白质谱，同时评估了它们在脑脊液中向转录组小胶质细胞表型的转化。我们应用分类模型来描绘一组蛋白质，可区分临床前无症状阿尔茨海默病和晚期症状性阿尔茨海默病，旨在阐明脑脊液来源的小胶质细胞相关差异表达蛋白在两个阶段之间的差异。对于所有感兴趣的阿尔茨海默病小胶质细胞相关脑脊液蛋白，我们检查了年龄的影响、与其他痴呆类型相比的特异性以及使用正交蛋白质组学技术的可重复性。捕捉这些蛋白质谱可以提供对小胶质细胞活动在过渡到临床前阿尔茨海默病和阿尔茨海默病痴呆阶段时在脑脊液中反映的见解，这对于开发靶向生物标志物和治疗方法很重要。
研究结果总结如图1所示。发现队列包括553例个体，涵盖阿尔茨海默病临床阶段：确认认知正常且脑脊液阿尔茨海默病生物标志物正常的对照组，确认阿尔茨海默病脑脊液生物标志物阳性的临床前阿尔茨海默病组，以及确认阿尔茨海默病脑脊液生物标志物阳性的阿尔茨海默病痴呆组。验证在独立的临床队列中进行，分组相同。从这些脑脊液PEA蛋白质组数据集中，我们通过比较新鲜手术和冷冻尸检脑组织中分离的小胶质细胞的单细胞和批量转录组数据集，筛选出155种小胶质细胞相关蛋白。我们分析了这些小胶质细胞标志物的标准化蛋白表达水平，通过ANCOVA与Tukey事后检验和假发现率校正来识别早期和/或晚期失调模式。
首先，为了探讨仅在临床前阿尔茨海默病组失调的小胶质细胞相关脑脊液蛋白的生物学意义，我们进行了基因本体论功能富集分析。其次，为了了解脑脊液蛋白质谱是否能转化为不同的转录组小胶质细胞表型，我们采用了最近发布的单细胞转录组小胶质细胞图谱。总之，该图谱基于从一系列不同患者中分离的活小胶质细胞的转录组数据。这些数据被因子化，以定义捕捉人类小胶质细胞主要异质性轴的生物学相关转录组特征。我们感兴趣的蛋白与此转录组图谱中每个转录组特征的前100个标志物进行匹配，以确定特定的小胶质细胞特征是否与脑脊液中的不同临床阿尔茨海默病组相关。
蛋白质组学分析确定了在临床前阿尔茨海默病阶段（早期特征）独特上调的蛋白，在阿尔茨海默病痴呆阶段（晚期特征）独特上调的蛋白，以及在两个阶段均失调的蛋白（持续特征）。早期特征包括七种蛋白，如APP、VEGFA和ADGRE5，与炎症、防御反应和细胞趋化性等功能相关。晚期特征包括九种蛋白，如CCL2、CTSH和CXCL8，涉及固有免疫和细胞因子信号传导。持续特征包括75种蛋白，涉及凋亡、适应性免疫和固有免疫过程。通过分类分析，我们确定了18种在临床前与痴呆阶段之间表达差异最显著的蛋白，其中15种在早期至晚期下降，三种上升。这些蛋白包括ADAM23、ADGRE5、APP、AXL等。STRING分析显示CCL2、CCL3和VEGFA是连接这些蛋白的中心节点。
我们发现年龄对大多数蛋白水平的影响很小或不存在。在特异性分析中，大多数失调对于阿尔茨海默病具有特异性。正交技术验证表明，81%的蛋白在不同技术之间表现出相似的趋势。敏感性分析显示tau病理可能是差异蛋白表达的主要驱动因素。
本研究将单细胞转录组小胶质细胞状态与脑脊液蛋白质组学相结合，描述了阿尔茨海默病临床阶段中小胶质细胞相关脑脊液蛋白和特征的存在与动态。我们的发现为脑脊液中小胶质细胞相关特征提供了见解，强调了小胶质细胞生物标志物研究在阿尔茨海默病分期中的潜力，以及单细胞转录组特征如何转化为脑脊液蛋白质谱。这为追踪阿尔茨海默病病程中小胶质细胞相关贡献以开发治疗方法提供了概念框架和基础，并具有预测阿尔茨海默病临床发作的潜在应用。
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