摘要
背景：自噬和内体通路协同参与乙型肝炎病毒（HBV）病毒体和亚病毒颗粒（SVPs）的生成。目前尚无确凿证据证明HBV与外泌体具有相同的生物发生和分泌途径。HBV生产与释放的最后步骤尚未被充分研究。
方法：我们通过GW4869（N,N'-Bis[4-(4,5-二氢-1H-咪唑-2-基)苯基]-3,3'-pht hal amide 二盐酸盐）处理，一种抑制神经酰胺介导的膜内陷小分子，检测HBV病毒体和SVPs的生产与释放。通过基因沉默中性鞘磷脂酶（GW4869作用靶点）及调控外泌体释放的RAB27A/B小GTP酶验证结果。采用蛋白质印迹、免疫荧光染色和共聚焦显微镜检测。
结果：GW4869抑制HBV病毒体释放，导致其与SVPs在肝细胞中积累。这会触发内质网应激，导致蛋白激酶B-雷帕霉素靶蛋白激酶（AKT-MTOR）信号通路失活。GW4869处理增加自噬体形成，通过阻断自噬体-溶酶体融合损伤自噬体降解。结果HBsAg更集中于自噬体和晚期核内体/多泡体。沉默中性鞘磷脂酶得到一致结果。RAB27A沉默同样抑制HBV病毒体和SVP分泌，导致其在肝癌细胞中积累。值得注意的是，GW4869处理及RAB27A/B沉默都增加了LC3+CD63+HBsAg+复合体的形成。
结论：我们的研究结果证明自噬体-晚期核内体/多泡体-外泌体轴调控HBV生产和释放，揭示amphisome是HBV释放的潜在平台。
关键词：自噬过程；内体运输；GW4869；HBV；RAB27A/B
引言
HBV引起急性和慢性乙型肝炎，可能导致严重肝病。慢性HBV感染增加肝硬化和肝细胞癌风险。完整HBV病毒体由核衣壳和含有三种HBsAg的包膜组成。HBV核衣壳由核心蛋白（HBcAg）组成，其基因组为部分双链环状DNA。此外，非感染性亚病毒颗粒（SVPs）以球形和丝状形式分泌。然而，调控HBV病毒体和SVPs包膜和释放的机制尚未完全阐明。
研究发现，感染性HBV病毒体及各类病毒颗粒可通过内体通路释放。自噬是HBV组装的途径，可通过抑制mTOR激酶（如雷帕霉素）显著增强病毒生成。自噬体可能通过溶酶体降解清除细胞成分，但也可能存在未明机制逃逸溶酶体降解并释放到胞外。我们的最新研究表明，当内体运输部分正常时，自噬促进HBV复制和生产，提示晚期核内体/多泡体（MVBs）与自噬体融合形成amphisome促进病毒生成。
外泌体是40-160 nm的细胞外囊泡，来源于晚期核内体/MVBs。既往研究在HBV感染肝细胞来源的外泌体中检测到HBV DNA、RNA和蛋白。因此，抑制细胞外囊泡（EVs）形成和分泌可能阻碍HBV释放。GW4869作为MVB抑制剂，通过抑制中性鞘磷脂酶（nSMases）减少外泌体分泌，可减少HBV-DNA或miR-222包裹外泌体的产生。但GW4869干扰晚期核内体/MVB功能及其对HBV细胞内运输影响的机制仍不明确。RAB27A调控外泌体分泌，丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒的细胞逃逸依赖Rab27A，但HBV是否利用该蛋白尚待确认。
本研究系统揭示了GW4869、RAB27A/B在HBV运输中的机制，提供自噬体-晚期核内体/MVB-外泌体轴和amphisome在HBV复制与释放中的作用证据。
方法
细胞培养与转染
本研究采用三种HBV复制细胞模型：稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞、转染HBV质粒的Huh7细胞（瞬时模型）和HBV感染的原代人肝细胞（PHH）。细胞培养条件为37℃，5% CO₂。HepG2.2.15细胞培养基含10%胎牛血清、双抗、非必需氨基酸、HEPES和G418。Huh7细胞培养基含10%胎牛血清。PHH培养基含胰岛素、DMSO、氢化可的松半琥珀酸酯。质粒或siRNA转染采用Lipofectamine 2000。
统计分析
数据以均值±标准误表示，采用GraphPad Prism软件分析。两组比较采用配对t检验，单因素实验采用单因素方差分析。p<0.05视为有统计学意义。
结果
GW4869处理阻断HBV病毒体分泌并导致SVPs在细胞内蓄积
为研究外泌体生成抑制对HBV释放的影响，我们测试了5种靶向内体膜运输或脂质代谢的小分子化合物（calpeptin, Y27632, GW4869, imipramine, endosidin2）。其中GW4869处理后细胞内外HBV DNA比值显著变化。详细研究发现，HepG2.2.15、Huh7和PHH细胞在GW4869处理后呈现剂量依赖的细胞内HBV DNA增加和分泌病毒DNA显著减少。细胞内HBsAg水平增加，总HBV RNA无明显变化。共聚焦显微镜和蛋白质印迹显示HepG2.2.15和Huh7细胞中HBV蛋白表达显著增加。
GW4869诱导内质网应激和AKT-MTOR信号通路失活
HBV感染诱导内质网应激，触发细胞自噬促进病毒复制和生产。我们发现GW4869在HBV感染存在下显著增加内质网应激标志物（如Bip、p-EIF2A、ATF6），并导致AKT-MTOR通路失活。蛋白质印迹显示，GW4869处理HepG2.2.15细胞后，总AKT、MTOR及核糖体蛋白S6激酶B1（RPS6KB）水平下降，ULK1磷酸化水平升高。
GW4869增加自噬体形成但通过抑制自噬体-溶酶体融合损伤自噬降解
内质网应激和AKT-MTOR通路抑制与细胞自噬诱导相关。蛋白质印迹显示，GW4869处理呈剂量依赖性增加SQSTM1和LC3-II蛋白积累。免疫荧光染色显示自噬体数量增加但溶酶体降解减少。Dye Quenched-Red Bovine Serum Albumin追踪实验显示，GW4869显著减少溶酶体荧光，说明溶酶体降解受损。LysoTracker Red和acridine orange染色显示溶酶体酶活性未变，提示GW4869通过阻断自噬体-溶酶体融合增加自噬体积累。
GW4869处理促进HBV病毒体和SVPs与晚期核内体/MVBs及自噬体的共定位
机制上，GW4869通过抑制神经酰胺介导的膜内陷损伤晚期核内体/MVB形成及外泌体释放。研究显示，GW4869处理降低RAB5A及其效应物EEA1表达，增加溶酶体水平。免疫荧光显示RAB5A与HBsAg共定位减少，而CD63与HBcAg共定位增加。LC3与HBsAg和HBcAg共定位增加，LAMP1与HBsAg共定位减少，表明HBsAg降解受阻导致胞内积累。
LC3+CD63+amphisome样结构是HBV分泌平台
amphisomes是自噬体与晚期核内体/MVB融合形成的中间细胞器，参与物质降解和分泌。我们发现，GW4869处理后CD63+LC3荧光强度增加，表明晚期核内体/MVB与自噬体融合增强形成amphisome。GW4869处理后HBsAg+amphisome数量增加，提示外泌体释放受损导致病毒在amphisome积累。使用PEG沉淀法和外泌体分离试剂盒富集外泌体发现，GW4869处理后外泌体中HBV DNA水平增加，提示HBV与外泌体共享释放途径。
靶向ATG5的siRNA实验证实amphisome对HBV分泌的重要性
通过靶向ATG5基因的siRNA实验，我们发现ATG5沉默显著减少amphisome数量并损伤HBV运输。即使联合GW4869处理也无法恢复amphisome数量。ATG5沉默降低LC3免疫荧光强度及其与HBsAg的共定位，但GW4869处理部分恢复LC3水平和HBsAg共定位。ATG5沉默不影响CD63免疫荧光强度及其与HBsAg的共定位。这些发现表明自噬体形成对HBsAg运输至amphisome至关重要。
nSMase作为GW4869靶点参与HBV复制和运输
通过靶向鞘磷脂酶2（SMPD2）的siRNA实验，我们发现SMPD2沉默与GW4869处理效果一致，导致细胞内HBV DNA和HBsAg增加，分泌HBV DNA减少。SMPD2沉默增加蛋白二硫键异构酶（PDI）表达及其与HBsAg共定位，显示HBsAg滞留内质网。SMPD2沉默降低RAB5A表达及其与HBsAg的共定位，减少自噬体与溶酶体的共定位，增加HBsAg在自噬体积累。SMPD2沉默与GW4869处理对HBV复制和运输的调节具有相似效应，表明GW4869通过中性鞘磷脂酶调控HBV。
RAB27A和-B沉默导致HBsAg在amphisome中积累
通过RAB27A/B基因沉默实验，我们发现二者均与CD63共定位。基因沉默后，LC3表达增加，RAB27A沉默显著增加CD63水平。联合氯喹处理显示，RAB27A/B沉默主要通过抑制自噬降解和分泌而非新自噬体生成导致自噬体积累。RAB27A沉默增加细胞内HBV DNA减少释放，RAB27B沉默影响较小。亚细胞定位显示，RAB27A/B沉默导致HBsAg向核周聚集。免疫荧光显示RAB27A/B沉默增加HBsAg与自噬体共定位，减少其与晚期核内体/MVB共定位。HBsAg+amphisome比例增加，支持RAB27在amphisome释放中的作用。
讨论
本研究首次揭示amphisome作为HBV分泌平台的作用。先前研究显示内质网应激通过增强自噬体/MVB轴促进HBV生产。本研究发现，GW4869通过破坏内体通路导致HBV在内质网蓄积，同时通过反馈环路激活自噬，加速amphisome形成并滞留HBV，显著减少病毒释放。
在HepG2.2.15细胞中，高水平病毒复制导致HBsAg通过ER-Golgi途径分泌，而GW4869对此影响较小。而在pSM2转染的Huh7细胞和HBV感染的PHH中，GW4869显著减少HBsAg分泌。研究还发现鞘磷脂酶2（SMPD2）在GW4869调控HBV运输和释放中的关键作用。
我们观察到早期核内体减少并未直接抑制晚期核内体形成，而是改变了其形态。晚期核内体数量可能通过成熟、降解、循环速率的平衡维持稳定。RAB27A/B作为高序列相似性GTP酶，在HBV运输和释放中具有不同功能。RAB27A/B沉默导致HBsAg在amphisome中积累，但只有RAB27A沉默抑制HBV DNA和HBsAg分泌。该发现与Matias等研究一致，显示RAB27A参与膜融合和货物释放，RAB27B可能调控MVB运动。
既往研究显示amphisomes介导细胞货物运输至溶酶体降解，其非常规分泌功能仅见于神经退行性疾病和肺上皮细胞分泌。本研究首次可视化HBsAg与amphisome的关联，GW4869处理及RAB27A/B沉默导致HBsAg+LC3+CD63+结构积累，证实amphisome在HBV复制和释放中的作用。总之，自噬-晚期核内体/MVB-外泌体轴调控HBV复制和释放，amphisome作为HBV释放平台具有重要作用。
（注：由于内容长度限制，此处展示节选主要部分，完整译文包含所有实验数据和结论）
【全文结束】
