简要摘要
本研究探讨了花椒（Zanthoxylum piperitum）、紫薇（Lagerstroemia indica）和红松（Pinus densiflora）植物来源的外泌体提取物对HaCaT细胞皮肤屏障改善和保湿的效果。外泌体处理降低了炎症性IL-6表达，增强了前胶原和透明质酸的产生，同时抑制了MMP-1、胶原酶和弹性蛋白酶的活性。这些发现表明，植物来源的外泌体可以有效加强皮肤屏障并改善皮肤水合度，支持其在化妆品开发中的潜在应用。
摘要
外泌体是纳米级颗粒，结构类似于细胞，因其能有效通过皮肤毛孔吸收且不会分解活性成分而被视为优质化妆品原料而受到关注。本研究使用HaCaT细胞评估了花椒（Zanthoxylum piperitum）、紫薇（Lagerstroemia indica）和红松（Pinus densiflora）植物来源的外泌体提取物对皮肤屏障增强和保湿的效果。通过MTS实验确认细胞活性，并通过分析TNF-α/IFN-γ诱导的炎症反应中白细胞介素(IL)-6的表达来评估皮肤屏障改善效果。此外，测量了前胶原、基质金属蛋白酶(MMP)-1、透明质酸、胶原酶抑制活性和弹性蛋白酶抑制活性，以验证保湿效果。研究结果表明，外泌体处理不影响HaCaT细胞的活性，并通过降低因TNF-α/IFN-γ处理而增加的IL-6表达，确认了皮肤屏障改善效果。此外，外泌体处理后，前胶原和透明质酸的表达增加，MMP-1表达降低，并观察到胶原酶和弹性蛋白酶抑制活性的显著改善，表明具有皮肤保湿效果。本研究结果表明，红松（Pinus densiflora）、花椒（Zanthoxylum piperitum）和紫薇（Lagerstroemia indica）植物来源的外泌体提取物有助于增强皮肤屏障和保湿，为基于外泌体的化妆品原料开发提供了基础数据。
关键词：外泌体；皮肤屏障；保湿效果；花椒（Zanthoxylum piperitum）；紫薇（Lagerstroemia indica）；红松（Pinus densiflora）
1. 引言
皮肤作为人体最大且功能多样的器官，由三层主要结构组成：表皮、真皮和皮下组织。皮肤作为一个复杂的屏障，保护内部系统免受外部环境的影响[1,2]。表皮屏障起到化学和物理防御作用，防止水分通过皮肤流失，并在陆地环境中维持稳态[3,4]。外层角质层由无核的角质细胞嵌入富含神经酰胺、胆固醇和脂肪酸的脂质层中组成，共同构成主要的渗透屏障[5,6]。主要位于颗粒层的紧密连接提供额外的屏障，防止细胞间渗透[7]，与脂质层协同作用，维持水分并保护免受外部压力[8,9,10,11,12]。当这些结构元素受损时，屏障功能受损会导致水分过度蒸发，并增加对微生物或过敏原侵入的易感性[13]。
异常或过度的免疫反应会干扰正常的皮肤屏障功能并导致其受损[14]。Th1和Th2驱动的细胞因子反应失衡导致慢性皮肤炎症。特别是，Th2相关的白细胞介素（如IL-4、IL-6和IL-13）水平升高与皮肤疾病中观察到的屏障破坏和持续性炎症密切相关[15,16]。促炎细胞因子（如TNF-α和IFN-γ）的过度产生会阻碍角质形成细胞成熟，减少紧密连接组分的表达，并干扰正常脂质代谢[17]。传统疗法，包括使用富含神经酰胺的保湿剂，在修复皮肤屏障方面成效有限，突显了维持皮肤稳态需要平衡的结构和生化调节[18,19]。
近年来，细胞外囊泡（EVs），如外泌体，作为创新的生物活性载体，在组织再生和皮肤病治疗中展现出前景，引起了关注[20]。外泌体是微小的膜包被囊泡，通常大小为30–150 nm，由各种细胞类型分泌。它们含有多种生物分子，包括蛋白质、脂质和核酸，在介导细胞间通讯中起关键作用[21,22]。与人工纳米颗粒相比，外泌体天然具有高生物相容性和结构稳定性，能够在最小化免疫反应的同时有效递送生物活性物质[23]。植物来源的外泌体由于其天然来源和多样的生物活性，最近在化妆品领域引起了越来越多的兴趣[24]。研究表明，植物来源的外泌体可以刺激胶原蛋白产生，减轻氧化损伤，并支持皮肤再生[25]。这些囊泡为旨在抗衰老和增强皮肤屏障的产品中的合成成分提供了潜在的天然替代品[26]。尽管越来越多的研究强调了它们的治疗潜力，但植物来源外泌体在维持或修复表皮屏障方面的精确功能仍研究不足。
在本研究中，我们调查了从红松（Pinus densiflora）叶子、花椒（Zanthoxylum piperitum）果实和紫薇（Lagerstroemia indica）花朵中分离的外泌体提取物对人类角质形成细胞的保护和修复作用。我们重点评估了它们调节细胞因子诱导的屏障破坏以及促进关键皮肤屏障和保湿相关生物标志物表达的能力。尽管对外泌体基化妆品材料的兴趣日益增长，但关于植物来源外泌体的生物活性的信息仍然有限，特别是从花椒（Zanthoxylum piperitum）、紫薇（Lagerstroemia indica）和红松（Pinus densiflora）获得的外泌体。在这项工作中，我们比较研究了从这三种植物来源提取的外泌体的皮肤屏障保护和保湿特性。据我们所知，这是首次系统评估它们对人类角质形成细胞中表皮炎症、细胞外基质调节和水合相关通路的影响的研究。这些发现有望为植物来源外泌体作为创新化妆品成分的潜在应用提供新的见解。
2. 材料与方法
2.1 外泌体的分离与纯化
将紫薇（Lagerstroemia indica）花朵、花椒（Zanthoxylum piperitum）果实和红松（Pinus densiflora）针叶分别在三蒸水中匀浆。经过滤网过滤后，匀浆依次在4°C下离心（3500×g 15分钟→15,000×g 30分钟→23,000×g 45分钟）以分离上清液。收集的上清液通过0.45μm膜过滤器（韩国现代微系统公司）过滤。滤液使用配备300 kDa膜的切向流过滤（TFF）系统（Minimate TFF胶囊300K OMEGA膜，Pall公司）浓缩和纯化十倍。浓缩液进一步通过0.2μm膜过滤器（韩国现代微系统公司）过滤，将每种植物来源的外泌体制备物按1:1:1比例混合进行后续实验。制备的外泌体样品储存在-80°C直至使用。
2.2 细胞培养
为评估外泌体的作用，我们使用了人角质形成细胞HaCaT细胞（Cell Line Service GmBH公司）。细胞在含有10%胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素硫酸盐（100单位/mL和100μg/mL）的杜尔贝科改良鹰培养基（DMEM）中培养，培养条件为37°C、5% CO₂环境。细胞维持在培养密度低于1×10⁵个细胞/mL的条件下。
2.3 细胞毒性实验
将处于指数生长期的HaCaT细胞以1×10⁵个细胞/孔接种在96孔培养板中，并用不同剂量的外泌体（1至1000μg/mL）处理24小时。然后使用MTS试剂（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑内盐）（Promega公司）评估细胞。向每孔加入10μL MTS溶液，细胞额外培养4小时。使用微孔板分光光度计（Multiskan Go，Thermo Scientific公司）测量490 nm处的光密度。对照细胞被认为100%存活。我们选择了较低的外泌体实验剂量。
2.4 ELISA生物标志物分析
将HaCaT细胞以5×10⁵个细胞/mL的密度接种到6孔板中并培养。更换含各种浓度测试样品的新鲜培养基后，将细胞培养24小时。收集的上清液用于评估皮肤保湿功效。使用ELISA试剂盒（R&D Systems公司）定量炎症细胞因子IL-6。使用ELISA试剂盒定量保湿活性的生物标志物，包括I型前胶原（Abcam公司）、基质金属蛋白酶（MMP）-1（Abcam公司）、透明质酸（R&D Systems公司）、胶原酶（Invitrogen公司）和弹性蛋白酶（Invitrogen公司）。
2.5 西部印迹分析
获取培养细胞的全细胞裂解物，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并进行西部印迹分析。我们从Abcam公司购买了包括抗ASAH1、抗SHMT1、抗SPTLC1、抗包壳蛋白、抗PPAR-α、抗弹性蛋白和抗HAS-2在内的主要抗体。抗丝聚蛋白（Thermo Fisher Scientific公司）、抗HAS-3（Santa Cruz公司）和抗p53、抗COL-1（Cell Signaling Technology公司）抗体分别从相应公司购买。
2.6 透射电子显微镜分析
使用透射电子显微镜（TEM；H-7600，日立公司）在80 kV加速电压下检查样品的形态特征。对于TEM制备，将10μL颗粒悬浮液置于formvar/carbon涂层铜网上，吸附约1分钟。用滤纸去除多余液体后，网格用2%（w/v）醋酸铀负染30秒。染色后的网格在室温下完全干燥，随后在各种放大倍数下成像以评估颗粒大小和形态。
2.7 纳米颗粒追踪分析
使用纳米颗粒追踪分析系统（NTA；ZetaView PMX-120，Particle Metrix公司）确定颗粒大小分布和浓度。测量前，每种样品用三蒸水稀释以获得适当的颗粒浓度进行分析。将稀释后的悬浮液引入仪器，在相同的相机设置下，在11个预定义位置记录视频，进行三次连续扫描循环。相机灵敏度设置为85，快门速度固定为100。使用ZetaView软件（版本8.05.16 SP7）处理所有记录的视频，计算平均颗粒大小、尺寸分布和颗粒浓度。
2.8 LC-MS/MS脂质谱分析
对于脂质提取，将50μL PBS和50μL脂质标准溶液添加到沉淀样品中，然后在冰浴中进行尖端超声处理1分钟（振幅10%，脉冲开启：0.5秒，脉冲关闭：0.5秒）。然后，加入250μL甲醇（MeOH）和1 mL甲基叔丁基醚（MTBE），使用旋转器涡旋1小时。加入200μL H₂O后，样品再次在旋转器上涡旋10分钟。通过在3000×g下离心5分钟实现相分离，将上层转移到新的Eppendorf管中。为提取残留脂质，向剩余沉淀中加入400μL MTBE，涡旋10分钟，再次在3000×g下离心5分钟。将所得上层与先前收集的上清液合并。将合并的提取物在SpeedVac中完全干燥过夜，并重新溶解在100μL MeOH:CHCl₃（9:1，v/v）中。将每种样品的4μL等分试样注入UPLC系统的分析柱中。使用溶剂B（有机相）的线性梯度在30分钟内分离样品，流速为0.25 mL/min。每个样品分析三次。使用LipidSearch 4.2.21版进行脂质鉴定。为确保准确的脂质谱，手动过滤结果中的假阳性峰。
2.9 统计分析
数据表示为均值±标准差（SD），所有统计分析均使用Sigmaplot v14.0软件（Systat Software公司）进行。通过单向方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较检验进行统计分析。p值<0.05被认为具有显著性。
3. 结果
3.1 透射电子显微镜和纳米颗粒追踪分析对植物来源外泌体的表征
使用透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）分析了从紫薇（Lagerstroemia indica）花朵、花椒（Zanthoxylum piperitum）果实和红松（Pinus densiflora）叶子中提取的外泌体提取物的形态和物理特性。如图1所示，TEM图像显示分离的囊泡表现出典型的杯状或球形形态，具有完整的脂质双层膜，与外泌体已知的结构特征一致。未观察到明显的碎屑或聚集，表明分离和纯化过程成功地产生了均匀的囊泡群体。NTA测量进一步证实了外泌体制备物的纳米级尺寸分布。颗粒浓度和分布谱显示所有三种植物来源之间具有高度一致性，表明外泌体稳定产生且在物理化学性质上具有可比性。这些结果与TEM和NTA分析一起证实，从红松、花椒和紫薇中提取的外泌体已成功分离和纯化，表现出均匀的形态和纳米级尺寸，从而为后续生物学和功能测定提供了特征明确的囊泡。
3.2 外泌体提取物对人细胞系的毒性
首先，我们通过MTS实验确定了外泌体对人角质形成细胞HaCaT细胞的潜在毒性。本研究使用HaCaT角质形成细胞，因为它们作为一种广泛使用的表皮细胞模型，保留了原代角质形成细胞的基本功能特征，如分化潜力和对内外部及炎症线索的敏感性。由于我们研究的重点是表皮屏障完整性和角质形成细胞驱动的炎症事件，该细胞系提供了合适的实验系统。相比之下，真皮成纤维细胞主要参与细胞外基质产生和真皮修复过程，因此更适用于以真皮重塑而非表皮生理为中心的研究。尽管基于成纤维细胞的实验可以补充我们的发现，但HaCaT细胞是解决本研究中检查的表皮方面的最合适模型。图2所示的结果清楚地表明，外泌体提取物在处理的浓度范围内未引起细胞毒性。
3.3 外泌体提取物对人细胞系中IL-6水平的抑制作用
为检验植物来源外泌体提取物的抗炎作用，在用TNF-α和IFN-γ（各10 ng/mL）刺激后，评估了HaCaT细胞中IL-6的分泌。如图3所示，与未处理的对照组相比，细胞因子刺激组的IL-6水平显著增加，确认了炎症反应的成功诱导。外泌体提取物处理以剂量依赖性方式显著降低了IL-6的分泌，表明这些囊泡能有效减轻角质形成细胞中细胞因子诱导的炎症。在测试条件下，与水提取物处理组（ZLPW组）相比，外泌体处理组显示出对IL-6表达的明显更强的抑制作用。这些发现表明，红松、花椒和紫薇来源的外泌体通过调节促炎细胞因子的产生，发挥强大的抗炎活性，从而有助于在炎症压力条件下维持皮肤屏障稳态。
3.4 外泌体提取物在人细胞系中的皮肤屏障增强功能
为进一步阐明植物来源外泌体提取物皮肤屏障增强作用的机制，通过西部印迹分析了TNF-α/IFN-γ刺激的HaCaT细胞中关键屏障相关蛋白的表达。如图4和图S1所示，与未处理对照组相比，TNF-α/IFN-γ刺激显著改变了几种脂质代谢和神经酰胺合成相关酶的表达，包括ASAH1、SHMT1和SPTLC1。外泌体提取物处理有效地逆转了这些变化，显著恢复了SHMT1和SPTLC1的表达，同时降低了在炎症条件下异常升高的ASAH1水平。这些结果表明，外泌体提取物有助于正常化脂质代谢和神经酰胺生物合成，从而支持皮肤屏障恢复。此外，我们检查了结构和分化相关蛋白的表达，包括包壳蛋白、丝聚蛋白和过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR-α），它们在维持表皮完整性方面发挥关键作用（图5和图S1）。结果表明，TNF-α/IFN-γ刺激显著降低了这些蛋白的表达，而外泌体提取物处理以剂量依赖性方式显著恢复了它们的水平。与水提取物处理组（ZLPW）相比，外泌体处理的细胞显示出这些屏障相关蛋白的更高上调。
综合来看，这些结果表明，红松、花椒和紫薇植物来源的外泌体提取物通过调节脂质代谢相关酶和对表皮分化和功能至关重要的结构蛋白，促进皮肤屏障修复。
3.5 外泌体提取物对MMP-1分泌和I型前胶原降解的抑制作用
I型前胶原是在真皮成纤维细胞中合成的I型胶原的前体。为研究植物来源外泌体提取物是否影响细胞外基质维持和胶原代谢，在用不同浓度的外泌体（0.1、0.5和1μg/mL）处理后，测量了HaCaT细胞中MMP-1分泌和I型前胶原水平。如图6A所示，与未处理对照组相比，TNF-α/IFN-γ刺激显著增加了MMP-1分泌，表明在炎症条件下基质降解。外泌体提取物处理以浓度依赖性方式显著降低了MMP-1水平，表明这些囊泡对细胞外基质降解具有保护作用。相比之下，I型前胶原的产生在处理后显著增强（图6B）。前胶原水平的增加表明外泌体促进了胶原合成并可能改善了真皮基质重塑。此外，与植物水提取物处理组（ZLPW组）相比，外泌体处理组显示出更明显的效果，暗示外泌体制剂具有更高的生物活性和递送效率。这些结果表明，红松、花椒和紫薇植物来源的外泌体提取物能有效保护皮肤细胞免受基质降解，同时刺激胶原合成，对皮肤具有抗衰老和保湿作用。
3.6 红松、花椒和紫薇植物来源外泌体提取物对HaCaT细胞保湿活性的影响
为研究红松、花椒和紫薇植物来源外泌体提取物的保湿和抗衰老作用，我们检查了它们抑制细胞外基质降解酶和增强HaCaT细胞中关键皮肤保湿标志物的能力。如图7所示，与未处理对照组相比，植物来源的外泌体提取物处理显著抑制了胶原酶（图7A）和弹性蛋白酶（图7B）的活性，且呈浓度依赖性。这种抑制作用表明外泌体通过防止胶原和弹性蛋白降解有效保护细胞外基质，从而有助于维持皮肤弹性和抗衰老潜力。此外，外泌体处理显著增加了透明质酸（HA）的产生（图7C），透明质酸是维持皮肤水分的关键润湿剂。这些结果表明，外泌体提取物通过酶抑制和刺激保湿因子，增强了皮肤的保水能力。此外，西部印迹分析证实，与对照组相比，外泌体处理的细胞中I型胶原（COL-1）、弹性蛋白、透明质酸合酶-2（HAS-2）和HAS-3的表达水平显著上调（图7D-G和图S1）。此外，外泌体处理后，凋亡和细胞衰老的关键调节因子p53的表达显著降低（图7F,G和图S1）。综合来看，这些发现表明，从三种植物物种提取的外泌体提取物通过增强细胞外基质合成和皮肤保湿，同时减弱凋亡和衰老相关通路并抑制细胞外基质降解，发挥强大的保湿和抗衰老作用。
4. 讨论
本研究表明，从红松、花椒和紫薇中获得的外泌体提取物对皮肤保湿和屏障强化具有多种积极作用。组合外泌体制备物减轻了TNF-α/IFN-γ诱导的炎症，并促进了对表皮平衡至关重要的关键结构蛋白和脂质代谢调节因子的表达。总体而言，这些结果表明植物来源的外泌体作为天然生物载体，通过协同抗炎和再生作用恢复受损皮肤。
在HaCaT细胞中检测到的IL-6分泌减少表明外泌体提取物调节细胞因子依赖性炎症通路。由于IL-6是一种主要的炎症介质，已知会削弱紧密连接并加剧屏障损伤，其下调表明这些囊泡可能有助于在炎症条件下维持表皮稳定性。这种免疫调节作用与早期发现一致，即植物来源的细胞外囊泡可以调节MAPK和NF-κB信号通路，导致促炎细胞因子产生减少。
同样，ASAH1、SHMT1和SPTLC1表达的增加表明外泌体提取物有助于维持角质层结构完整性和渗透控制的脂质重塑和神经酰胺合成过程。包壳蛋白、丝聚蛋白和PPAR-α表达的恢复进一步表明表皮分化和脂质屏障形成得到改善。这些发现共同表明，外泌体处理加强了屏障结构，提供了超越单纯炎症抑制的持续支持。此外，外泌体提取物通过促进I型前胶原和透明质酸的合成，同时抑制MMP-1、胶原酶和弹性蛋白酶的活性，增强了细胞外基质组织和保湿。这些结果表明外泌体有助于防止细胞外基质降解并增强真皮弹性，这与它们富含磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）和神经酰胺类别的脂质组成一致，如表1所示。表1总结了ZPLE样品中平均峰面积最高的30种脂质，表2总结了主要脂质类别和类别的分类。通过将每种脂质的平均MS1峰面积除以每个样品中检测到的所有脂质的平均MS1峰面积之和，并将值表示为百分比，计算每种脂质的相对丰度。在样品中，PE和PI按顺序检测到的比例最高。这些脂质以其促进囊泡和细胞膜融合以及调节与皮肤保湿相关的信号通路而闻名。
观察到的广泛功效可能源于从三种植物来源的外泌体中封装的独特代谢物组合。红松富含萜烯和多酚，花椒含有具有抗炎潜力的生物碱和黄酮类化合物，紫薇提供具有强抗氧化特性的三萜和花青素。这些生物活性化合物的组合可能产生协同效应，与来自单一植物来源的外泌体相比，提高了外泌体的稳定性和功能活性。
综上所述，这些结果表明植物来源的外泌体可以作为用于皮肤健康的合成纳米颗粒的环保、生物相容性替代品。通过同时靶向炎症、脂质代谢和细胞外基质合成，它们可能提供针对环境压力和衰老的全面保护。然而，需要进一步研究来阐明涉及的精确分子通路，确认体内外囊泡摄取机制，并评估化妆品应用中的配方稳定性。
5. 结论
从花椒、紫薇和红松中获得的外泌体提取物被发现通过减轻炎症并恢复TNF-α/IFN-γ刺激的HaCaT细胞中关键屏障相关蛋白的表达，加强皮肤屏障功能。值得注意的是，包括包壳蛋白、丝聚蛋白、PPAR-α、SHMT1和SPTLC1在内的必需结构和调节蛋白的水平得到恢复，导致表皮分化、脂质代谢和神经酰胺产生增强。此外，这些提取物通过刺激前胶原和透明质酸的合成，抑制MMP-1表达，并促进胶原酶和弹性蛋白酶抑制，展示了显著的保湿效果。综合来看，这些发现表明植物来源的外泌体作为化妆品成分具有强化皮肤屏障完整性和维持水分的强大力量。它们在恢复皮肤结构和维持水分平衡方面的双重功能突显了它们在下一代护肤配方中的潜力，值得进一步研究作为功能性化妆品中的活性成分进行开发。
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