藻源性化合物Botryococcene通过清除细胞内活性氧抑制UV-B诱导的皮肤光老化 - 干细胞与抗衰老

摘要

阳光照射有益于人类健康；然而，皮肤过度暴露于光线，尤其是紫外线B（UV-B），会产生大量活性氧（ROS）并引发炎症。一些抗氧化剂，如角鲨烯，可以防止UV-B诱导的炎症。C34H58布洛特卡烯（botryococcene）是由绿藻Botryococcus braunii产生的最常见三萜烃；它通过与角鲨烯相似的生物合成途径产生，并且化学结构与角鲨烯相似。然而，目前尚无关于布洛特卡烯生物活性的报道。在本研究中，我们评估了布洛特卡烯预防皮肤光老化的能力。通过电子自旋共振（ESR）检测，布洛特卡烯无法清除任何活性氧。然而，用布洛特卡烯处理表皮细胞显著抑制了过氧化氢（H2O2）引起的细胞内活性氧生成，并减轻了H2O2的细胞毒性。布洛特卡烯增强了胃细胞中的抗氧化酶，因此布洛特卡烯可能间接而非直接地清除活性氧。此外，布洛特卡烯抑制了细胞内白细胞介素-1的产生，并表现出对UV-B照射引起的黑色素生成的抑制作用。将经布洛特卡烯处理的表皮细胞培养基添加到真皮细胞中，缓解了UV-B照射引起的基质金属蛋白酶-1（MMP-1）产生增加和I型胶原蛋白产生减少。这些结果表明，布洛特卡烯具有抗光老化效果，包括预防皮肤皱纹和瑕疵。

关键词：

布洛特卡烯；抗氧化剂；UV-B照射；光老化；皮肤

1. 引言

阳光照射有助于预防多种疾病，如癌症、高血压和糖尿病。这些效果归因于维生素D、一氧化氮、褪黑激素和血清素的产生[1]。然而，过度的光线暴露，特别是紫外线B（UV-B），会导致皮肤中大量活性氧（ROS）的产生，进而导致炎症分子如白细胞介素（IL）-1α和前列腺素E2（PGE2）的产生，加速光老化[2,3,4,5]。活性氧的产生增加了表皮细胞中IL-1α和环氧化酶-2的水平。IL-1α通过介导内皮素-1和干细胞生长因子的增加产生，增强酪氨酸酶活性，从而增强角质形成细胞的吞噬作用并促进色素沉着[6,7,8,9]。此外，由环氧化酶-2促进的PGE2产生会增加酪氨酸酶活性[10]。增强的IL-1α也促进基质金属蛋白酶-1（MMP-1）表达，抑制I型胶原蛋白合成，导致胶原蛋白降解[11,12,13,14]。因此，已开发出光保护剂以防止光老化。

绿藻Botryococcus braunii Kützing（Trebouxiophyceae，绿藻门）广泛分布于淡水环境中，是一种著名的烃类生产者，这些烃类积累在群体基质中。该藻的烃含量显著高于其他产油微藻[15]，范围在20%至50%重量比[16]。不同的B. braunii菌株产生各种烃类，根据其化学结构分为四个化学类群：A、B、L[17]和S[15]。A类的特征是具有奇数碳原子数（C23–C33）的n-烷二烯和/或n-三烯及其衍生物。B类合成特定的CnH2n−10三萜烃，称为布洛特卡烯（botryococcenes，C30–C37）和甲基化角鲨烯（C31–C34），这些成分最常见于天然湖泊和水库中。L类合成单一的四萜烃，番茄烯（lycopadiene）。S类产生环氧-n-烷烃和碳数为18和20的饱和n-烷烃链。由于这些烃类具有高能量密度和作为化学工程材料的可用性，它们是首选的藻类燃料。然而，Botryococcus braunii的生长缓慢，对其在生物燃料生产和作为化学商品的实际应用构成了重大挑战。

布洛特卡烯通过与角鲨烯相似的途径生物合成，角鲨烯是所有真核生物甾醇代谢中必不可少的中间代谢物。角鲨烯合酶样（SSL）基因SSL-1、SSL-2和SSL-3为藻类提供具有特殊功能的三萜油[18]。SSL-1催化两个法尼基二磷酸的初始缩合形成前角鲨烯二磷酸，然后SSL-2将其还原重排形成角鲨烯。或者，SSL-3催化性地将前角鲨烯二磷酸还原形成布洛特卡烯，通过两个法尼基二磷酸分子的1–3′连接。

角鲨烯是一种具有六个主轴双键的30碳多萜化合物（C30H50）[19,20]，具有抗氧化特性，并具有多种生物活性，包括皮肤保湿、润肤、抗氧化、抗癌和抗炎作用[19,21,22,23]。特别是，它能淬灭单线态氧，保护人体皮肤表面免受UV光照射和其他氧化损伤源引起的脂质过氧化[21]。它还以高脂溶性和大量双键而闻名，使其容易穿透细胞膜的脂质双层，并由于这种高渗透性，它充当皮肤渗透增强剂[24]。因此，目前角鲨烯有许多应用，包括作为角鲨烷（角鲨烯的氢化饱和衍生物）用于化妆品[25]以及用于疾病管理和治疗的药物配方[19]。许多其他结构与角鲨烯相似的多萜分子，如β-胡萝卜素、辅酶Q10以及维生素A、E和K1，在皮肤生理学中发挥关键生物学功能，给予益处，因此用作化妆品成分[21]。

本研究中使用的C34H58布洛特卡烯[26,27]（以下简称布洛特卡烯）是Botryococcus braunii B类中最常见的多萜分子[15]，主轴中含有一个双键，侧链中含有五个双键，使其看起来与角鲨烯相似。布洛特卡烯中的双键被认为是聚合、硅氢化、氧化和硫醇-烯反应等化学转化的反应点[28,29,30]。角鲨烯和其他多萜化合物的功效，包括其抗氧化特性，已被充分认识并已商业化[21,31]；然而，尽管布洛特卡烯与角鲨烯结构相似且生物合成途径相同，但对其功效知之甚少。

鉴于布洛特卡烯与角鲨烯的结构相似性以及角鲨烯在皮肤上的已证实功效，本研究调查了布洛特卡烯是否有助于抑制人体皮肤中UV-B诱导的光老化。使用表皮和真皮细胞，我们旨在进一步了解布洛特卡烯对人类皮肤健康的功效和功能。

2. 结果

2.1 布洛特卡烯的UV-Vis光谱

在乙醇中溶解的100 μM布洛特卡烯的UV-Vis吸收光谱显示，在UV-C区域197 nm处有吸收峰，在UV-B至UV-A区域吸收很少（图1）。从用作溶剂的乙醇的吸收光谱（图1）来看，UV-B至UV-A区域观察到的少量吸收被认为是由乙醇引起的。因此，可以得出结论，布洛特卡烯不吸收本研究中照射的UV-B。

2.2 布洛特卡烯的活性氧清除能力

在将每个自由基引发剂与布洛特卡烯混合后，立即使用电子自旋共振（ESR）测量溶液中产生的活性氧量。含有布洛特卡烯的混合物的ESR信号与不含布洛特卡烯的混合物没有差异，表明布洛特卡烯本身不具有直接抗氧化活性（图2）。

2.3 布洛特卡烯的细胞毒性

使用中性红染色测量布洛特卡烯对细胞活力的影响（图3）。含有0至200 μM布洛特卡烯的培养基未引起细胞毒性。在含有400 μM布洛特卡烯的培养基中，细胞活力下降至86.7%；然而，与0 μM布洛特卡烯相比，细胞活力未观察到显著降低。

2.4 布洛特卡烯减少H2O2诱导的细胞内活性氧产生

使用荧光染料DCFH-DA检测H2O2诱导的细胞内活性氧产生。高荧光强度表示高活性氧产生。H2O2处理细胞的荧光强度高于未处理细胞。经布洛特卡烯处理的细胞在H2O2暴露后，细胞内荧光强度呈剂量依赖性降低（图4）。特别是，用100 μM布洛特卡烯处理的细胞的荧光强度与未处理细胞相比显著降低。这表明布洛特卡烯可以减少H2O2产生的活性氧。

2.5 布洛特卡烯减轻H2O2细胞损伤

在用0、25、50和100 μM浓度的布洛特卡烯预处理后，将细胞与H2O2一起孵育。H2O2处理细胞的活力显著低于对照组和布洛特卡烯处理细胞。H2O2处理后，布洛特卡烯处理细胞的活力以剂量依赖性方式显著增加（图5）。

2.6 布洛特卡烯对UV-B诱导的IL-1α和PGE2生成的影响

为了评估布洛特卡烯对UV-B诱导的促炎细胞因子生成的影响，使用酶联免疫吸附试验（ELISA）分析了经布洛特卡烯处理的正常人表皮角质形成细胞（NHEKs）培养物上清液中的IL-1α和PGE2。UV-B照射后IL-1α表达增加（与对照组相比）；然而，用100 μM布洛特卡烯处理的细胞中IL-1α显著降低（与未处理细胞相比）（图6A）。PGE2水平在UV-B照射后也增加。PGE2的产生随布洛特卡烯剂量增加而减少；然而，与0 μM和100 μM布洛特卡烯相比，没有显著差异（图6B）。

2.7 布洛特卡烯抑制UV-B诱导的吞噬作用

为了确认布洛特卡烯对黑色素积累的抑制作用，使用FluoSphere珠测量了布洛特卡烯的黑色素生成抑制活性。尽管UV-B照射显著增加了0和25 μM布洛特卡烯处理后的FluoSphere珠积累（与对照组相比），但100 μM布洛特卡烯处理后荧光珠的摄取显著减少，并且与对照组相比没有显著差异（图7）。

2.8 布洛特卡烯处理减轻了正常人真皮成纤维细胞（NHDFs）中UV-B诱导的I型胶原减少和MMP-1产生升高

检查了UV-B照射对I型胶原和MMP-1产生的影响，以确定布洛特卡烯抵消这些影响的机制。UV-B照射降低了NHDFs中I型胶原的产生，但诱导了MMP-1的产生（图8A,B）。用100 μM布洛特卡烯处理NHDFs后，UV-B照射后I型胶原产生显著增加，而MMP-1产生受到抑制（与未处理的NHDFs相比）。

3. 讨论

微藻在功能性、有效性和安全性方面具有明显优势，通过光合作用减少温室气体排放。因此，藻类作为下一代生物制药生产平台受到了相当大的关注。许多物种已开发出重要的生物技术应用，包括新型功能化合物的发现、分子克隆、基因工程和藻类生物量的大规模生产[32]。

绿藻Botryococcus braunii广泛分布于湖泊、池塘和水库中，以其显著多样的不寻常烃类而闻名，分为四个化学类群[15,17]。本研究中使用并称为布洛特卡烯的C34H58布洛特卡烯是日本自然湖泊和水库中分离的许多B. braunii菌株产生的最常见分子[15]。然而，关于布洛特卡烯的生物活性知之甚少。产生布洛特卡烯的Botryococcus braunii Bot-22的乙醇提取物显示出抗应激和抗抑郁样作用[33]。然而，负责这些效果的成分仍不清楚。

本研究的结果表明，布洛特卡烯为皮肤健康提供了以下益处，作为抗氧化剂、抗炎剂和抗光老化剂：

(1) 抗氧化剂：ESR信号显示布洛特卡烯不能直接清除活性氧（图2）。然而，这并不意味着布洛特卡烯不参与体内的活性氧清除过程。本研究使用皮肤细胞表明布洛特卡烯参与体内的抗氧化过程。H2O2暴露后，布洛特卡烯处理细胞的基于DCFH-DA的细胞内荧光强度呈剂量依赖性降低（图4），而细胞活力呈剂量依赖性增加（图5）。这些体外结果表明，布洛特卡烯可以清除H2O2以抑制H2O2诱导的细胞毒性，这与ESR实验的结果相矛盾。这些看似矛盾的结果可以通过考虑布洛特卡烯不是直接清除活性氧，而是通过诱导细胞内抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、L-半胱氨酸和谷胱甘肽过氧化物酶）的表达来解释。如引言中所述，布洛特卡烯是一种在结构和合成上与角鲨烯相似的多萜化合物，具有高细胞膜渗透性[24]。这表明布洛特卡烯也可以穿透细胞。此外，在我们正在进行的使用胃细胞观察布洛特卡烯对胃部影响的实验中，结果显示布洛特卡烯作用于细胞并诱导细胞内酶（MnSOD、GPx、过氧化氢酶等）的表达（图S1）。皮肤细胞和胃细胞都是上皮细胞，因此预计布洛特卡烯处理也会增加皮肤细胞中抗氧化酶的表达。因此，我们提出"布洛特卡烯不具有直接抗氧化活性，但它可以进入细胞并诱导细胞内抗氧化酶的表达"这一假设。需要使用皮肤细胞进行布洛特卡烯诱导抗氧化酶表达的未来研究来验证所提出的假设。

(2) 抗炎：UV-B照射增加了炎症细胞因子（如IL-1a和PGE2）的水平[3]，本研究证实了这一点（图6）。布洛特卡烯显著降低了UV-B照射产生的IL-1，因此表明布洛特卡烯可以保护皮肤免受IL-1引起的损伤，例如通过Endo180抑制胶原降解[34]。

(3) 抗光老化：使用荧光珠（如假黑色素体），我们发现UV-B照射增加了荧光珠的积累，但100 μM布洛特卡烯处理后显著减少（图7），表明抑制了角质形成细胞的吞噬作用。本研究还发现，100 μM布洛特卡烯处理增加了胶原蛋白产生并显著降低了MMP-1表达（图8）。从这些结果来看，布洛特卡烯可以抑制皮肤光老化[35]。

UV-B诱导皮肤光老化的主要机制包括活性氧应激[4]、炎症化合物（如IL-1α）的刺激[3]、黑色素生成的增强[5]、促进MMP-1表达（抑制I型胶原蛋白合成，导致胶原蛋白降解）[11,12,13,14]。由UV-B照射上调的IL-1α表达激活内皮素-1和干细胞因子以增强角质形成细胞吞噬作用[7,8,9]，导致黑色素生成增加。本研究首次揭示布洛特卡烯不具有UV-B吸收带（图1）且不能直接清除活性氧（图2）。因此，布洛特卡烯通过诱导抗氧化酶表达清除活性氧、降低炎症细胞因子IL-1α的表达以及抑制表皮中黑色素体的积累，作为UV-B诱导光老化机制各元素的抑制剂。特别是，布洛特卡烯减少UV-B诱导的IL-1α表达强烈支持其在抑制角质形成细胞吞噬作用和预防皮肤表皮色素沉着中的作用（图9）。此外，由UV-B照射诱导的活性氧产生引起的真皮成纤维细胞光老化机制包括通过激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路（该通路调节激活蛋白1和核因子κB等转录因子），由IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-8等IL家族促进MMP-1表达，诱导MMP-1表达[36,37,38,39]。基于上述结果，我们假设布洛特卡烯具有如图9所示的光保护作用。作为抑制UV-B照射诱导光老化的机制，布洛特卡烯被认为可降低IL-1α表达，从而下调MMP-1表达并抑制I型胶原的减少。

由于布洛特卡烯与角鲨烯具有相似的化学结构和代谢途径，我们希望解释它相对于作为化妆品成分广泛使用的角鲨烯的优势。角鲨烯是一种主轴上有六个双键的不饱和烃。然而，由于其易氧化的性质，它是一种非常不稳定的化合物，如果直接使用，其功效将大大降低。因此，当它用于化妆品时，需要转化为完全饱和的烃，称为角鲨烷（C30H62），具有活性氧保护作用和抗光老化作用[25]。另一方面，布洛特卡烯即使对活性氧也不具有反应性，这表明它具有抗氧化性。因此，无需将其转化为饱和烃，可以直接作为真正天然的化妆品成分使用。

总之，本研究表明布洛特卡烯可以通过清除细胞内活性氧（可能是通过诱导抗氧化酶）、降低IL-1α表达以减轻细胞毒性、抑制黑色素体积累，从而下调MMP-1以促进胶原蛋白产生，参与抑制UV-B诱导的皮肤光老化过程。

4. 材料和方法

4.1 化学品

本研究中使用化学品的来源如下：玫瑰红和4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶（HTMP）购自东京化成工业公司（日本东京）。H2O2和黄嘌呤购自和光纯药工业公司（日本大阪）。5-(2,2-二甲基-1,3-丙氧基环磷酰基)-5-甲基-1-吡咯啉N-氧化物（CYPMPO）购自Radical Research, Inc.（日本东京）。黄嘌呤氧化酶购自Nacalai Tesque Inc.（日本京都）。HuMedia-KG2（KG2）和HuMedia-KB2（KB2）购自Kurabo（日本大阪）。2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）购自Sigma-Aldrich Japan K.K.（日本东京）。IL-1α和MMP-1购自R&D systems（美国明尼阿波利斯）。PGE2购自Cayman Chemicals（美国安阿伯）。BCA蛋白质测定试剂盒和FluoSpheres购自Thermo Fisher Scientific（美国沃尔瑟姆）。I型胶原蛋白抗体购自Rockland Immunochemicals（美国莱姆里克）。

4.2 布洛特卡烯

在25±1°C的受控条件下，使用2:1的CHCl3/MeOH（v/v）从Botryococcus braunii Bot-22的干生物质中提取脂质。将提取物在减压下浓缩，并通过添加五分一体积的0.9% NaCl溶液（w/w）去除非脂质材料。盐析后，将CHCl3部分浓缩并应用于使用CHCl3制备的硅胶柱。让四倍体积的CHCl3通过该柱。蒸发洗脱液后，将残留物溶解在正己烷中。然后将己烷溶液应用于使用正己烷制备的硅胶柱，并将四倍床体积的正己烷应用于该柱。使用GC-2030（岛津公司，日本京都）配备BPX70毛细管柱（30 m × 0.25 mm内径；0.25 μm膜厚）测定布洛特卡烯的纯度。本研究中所有实验均使用纯度为99%的C34H58布洛特卡烯。

4.3 布洛特卡烯的紫外-可见吸收

使用NanoDrop™ 2000（光源：氙闪光灯，光谱仪：CCD，最佳光程：1 mm）（Thermo Fisher Scientific）测量溶解在乙醇中的100 μM布洛特卡烯的紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱，并从190 nm（UV-C）到390 nm（UV-A）记录，包括本UV照射研究中使用的UV-B区域。同样以相同方式测量并记录用作溶剂的乙醇的UV-Vis吸收光谱。

4.4 电子自旋共振测定

使用电子自旋共振（ESR）测量布洛特卡烯的活性氧清除能力[40,41]。使用玫瑰红和光照射60秒（λ = 518 nm）的组合产生单线态氧（1O2）。反应混合物包含MilliQ水中含200 μM玫瑰红和10,000 μM HTMP，有或无1000 μM布洛特卡烯。通过黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统产生超氧阴离子（O2•−）。反应混合物包含MilliQ水中含20,000 μM次黄嘌呤、20单位/mL黄嘌呤氧化酶和CYPMPO，有或无1000 μM布洛特卡烯。通过H2O2和光照射30秒（λ = 365 nm）的组合产生羟基自由基（•OH）。反应混合物包含MilliQ水中含10,000 μM H2O2和CYPMPO，有或无1000 μM布洛特卡烯。使用JEOL-TE X波段光谱仪（JEOL，日本东京）记录ESR光谱。在10 mW入射微波功率、9.4 GHz频率、0.2 mT调制宽度、7.5 mT扫描宽度、0.3 s时间对比和335.5 mT中心场的条件下获得布洛特卡烯的ESR光谱。

4.5 细胞培养

NHEKs从Kurabo购买。NHEKs在补充有10%胎牛血清、1%抗生素和1%人表皮角质形成细胞生长补充剂的KG2培养基中，在37°C、5% CO2气氛下培养。NHDFs从Kurabo购买。NHDFs在补充有10%胎牛血清、1%抗生素和1%人表皮角质形成细胞生长补充剂的Dulbecco改良Eagle培养基中，在37°C、含5% CO2的气氛下培养。在所有体外实验中，布洛特卡烯溶解在乙醇中。

4.6 布洛特卡烯的细胞毒性测定

为了确定布洛特卡烯的体外剂量范围，使用中性红法评估细胞毒性。NHEKs在KG2培养基中以2.5×104个细胞/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时。吸出培养上清液，替换为含有0、12.5、25、50、100、200和400 μM C34H58布洛特卡烯的KB2培养基，并将细胞再孵育24小时。之后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞，并在含有0.003%中性红的KB2培养基中孵育2小时。随后，再次用PBS冲洗细胞，并使用30%甲醇中的1 M HCl提取细胞内中性红。使用微孔板读数器测量A550。

4.7 布洛特卡烯处理NHEKs

NHEKs在KG2培养基中以2.5×104个细胞/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时。吸出培养上清液，替换为含有0、25、50、100和200 μM布洛特卡烯的KB2培养基，并将细胞再孵育24小时。布洛特卡烯处理的细胞用于研究细胞内活性氧产生、H2O2诱导的细胞毒性以及UV-B照射诱导的IL-1α和PGE2产生；此外，还用于基于微球的吞噬作用测定。

4.8 细胞内活性氧产生

将布洛特卡烯处理的细胞用PBS冲洗，并在含有200 μM H2O2的Hanks平衡盐溶液（HBSS）缓冲液中孵育1小时。实验方法基于以下参考文献[42]。去除上清液后，将细胞在含有20 μM DCFH-DA的HBSS中孵育30分钟。激发和发射波长分别为485和530 nm。使用微孔板读数器测量荧光强度。然后在含有0.5% Triton X-100的50 μL PBS中裂解细胞，并转移到96孔板中。使用BCA测定法估计总细胞蛋白。

4.9 布洛特卡烯对H2O2诱导细胞毒性的效果

将布洛特卡烯处理的细胞用PBS冲洗，并在含有300 μM H2O2的HBSS中孵育1小时。实验方法基于以下参考文献[42,43]。将细胞再次在KB2培养基中孵育24小时。随后，用PBS冲洗，并在含有0.003%中性红的KB2培养基中孵育2小时。之后，用PBS冲洗细胞。使用30%甲醇中的1 M HCl提取细胞内中性红。使用微孔板读数器测量A550。

4.10 布洛特卡烯对UV-B诱导炎症中IL-1α和PGE2产生的影响

将布洛特卡烯处理的细胞用PBS冲洗，替换为新鲜HBSS。然后，将细胞照射UV-B（280–320 nm，20 mJ/cm2）并在新鲜KB2培养基中孵育24小时。照射强度基于以下参考文献[42,43]。随后，使用ELISA试剂盒测量培养上清液中的IL-1α和PGE2水平。然后在含有0.5% Triton X-100的50 μL PBS中裂解细胞，并转移到96孔板中。使用BCA试剂盒估计细胞裂解物中的总细胞蛋白含量。

4.11 基于微球的吞噬作用测定

将布洛特卡烯处理的细胞用PBS冲洗，替换为新鲜HBSS。实验方法基于以下参考文献[42]。然后，将细胞照射UV-B（280–320 nm，20 mJ/cm2）并在新鲜KB2培养基中孵育24小时。然后，将细胞在含有FluoSpheres溶液（珠大小0.2 μm）的KB2培养基中培养4小时，并在含有0.5% Triton X-100的50 μL PBS中裂解，转移到96孔板中。使用荧光读数器在激发/发射波长535 nm/590 nm处检测裂解液的荧光发射。使用BCA试剂盒估计总细胞蛋白。

4.12 I型胶原和MMP-1的测量

本研究使用了NHEKs和NHDFs。NHEKs在KG2培养基中以2.5×104个细胞/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时。吸出培养上清液，替换为含有0、25、50、100和200 μM布洛特卡烯的KB2培养基24小时。然后，用PBS冲洗细胞，并在HBSS中孵育。之后，将细胞照射UV-B（280–320 nm，20 mJ/cm2）并在新鲜KB2培养基中孵育24小时，吸出上清液。NHDFs也在96孔板中以2.0×104个细胞/孔的密度在Dulbecco改良Eagle培养基中培养24小时。孵育后，使用来自布洛特卡烯处理的NHEK培养物的培养上清液在24小时内培养NDHFs。使用ELISA分析NHDF培养物的上清液以分析I型胶原和MMP-1产生。然后在含有0.5% Triton X-100的50 μL PBS中裂解细胞，并转移到96孔板中。使用BCA试剂盒估计总细胞蛋白。