摘要
背景
间充质干细胞(MSCs)及其衍生的外泌体因其独特的治疗特性，包括免疫调节和再生能力，在再生医学领域受到广泛关注。然而，开发一种简单、可扩展且可重复的从MSC条件培养基中分离外泌体的方法仍然是一个挑战。
方法
我们通过初步评估三种不同分子量的聚乙二醇(PEG)(1140、3350和8000 Da)来优化基于PEG的外泌体沉淀分离方法。对所有三种PEG类型进行蛋白质定量和纳米颗粒追踪分析(NTA)以评估产量和粒径。基于这些结果，选择了PEG 3350和PEG 8000通过扫描电子显微镜(SEM)、尺寸排阻色谱(SEC)和Western blotting进行进一步表征。随后，使用PEG 3350分离的外泌体进行蛋白质组学和代谢组学分析。在功能测定中，将HeLa细胞暴露于1%或10%胎牛血清(FBS)条件下不同浓度的MSC衍生外泌体中。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)测定法在24小时和48小时评估细胞活力。
结果
我们的结果表明，PEG 3350提供了最高产量和纯度的MSC衍生外泌体。分离的外泌体平均尺寸低于200纳米，经SEM和NTA确认。Western blotting验证了外泌体特异性标记物CD63、CD9和LGALS3BP的存在，而液相色谱–串联质谱(LC-MS/MS)分析鉴定出357种蛋白质和1,085种代谢物，证实了外泌体的分子完整性。此外，SEC分析显示，重复的基于PEG的富集循环通过去除非囊泡污染物有效提高了外泌体纯度。在功能上，PEG 3350分离的外泌体在HeLa细胞中未表现出细胞毒性，并且在较高浓度下促进了细胞活力的条件依赖性增加。
结论
本研究提出了一种优化的基于PEG 3350的外泌体分离方法，为获得高纯度MSC衍生外泌体提供了一种可扩展且可重复的方法。这些发现对再生医学中外泌体基础治疗的发展具有重要意义。
缩写词表
MSCs: 间充质干细胞
PEG: 聚乙二醇
SEM: 扫描电子显微镜
NTA: 纳米颗粒追踪分析
SEC: 尺寸排阻色谱
LC-MS/MS: 液相色谱-串联质谱
LGALS3BP: 半乳糖凝集素-3结合蛋白
sEVs: 小细胞外囊泡
ISEV: 国际细胞外囊泡学会
DMEM: 达尔伯克改良伊格尔培养基
FBS: 胎牛血清
PBS: 磷酸盐缓冲液
BSA: 牛血清白蛋白
SDS-PAGE: 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
PVDF: 聚偏二氟乙烯
PBST: Tween 20磷酸盐缓冲液
HRP: 辣根过氧化物酶
ECL: 电化学发光
TEAB: 三乙基碳酸氢铵
TCEP: 三(2-羧乙基)膦
致谢
本工作利用了国家代谢组学数据存储库(NMDR)，该存储库由NIH资助项目U2C-DK119886和OT2-OD030544支持。
AI声明
作者声明本手稿中未使用AI生成内容。
资金支持
本研究由韩国科学技术信息通信部通过韩国国家研究基金会资助的Brain Pool项目(资助号2022H1D3A2A01063847和RS-2023-00263303)和基础科学研究项目(RS-2023-0021971031482092640001和2016R1D1A1B02008854)支持，由韩国教育部分配的韩国基础科学研究所(国家研究设施和设备中心)资助的基础科学研究能力增强项目(资助号2019R1A6C1010030和2021R1A6C103A409)，以及忠南国立大学和美国国家癌症研究所(资助号1R01 CA258240)支持。
作者信息
作者及所属机构
- 伊朗阿瓦士朱迪沙普尔医科大学基础医学研究所细胞与分子研究中心生化系
Maryam Adelipour
- 韩国大田忠南国立大学化学系
Maryam Adelipour, Hyojin Hwang, Reham M. Marzouk, Mohamed A. Gab-Allah & Jeongkwon Kim
- 埃及吉萨国家标准局有机分析实验室
Mohamed A. Gab-Allah
- 韩国生物科学与生物技术研究所研究设施与分析中心
Ga Seul Lee & Jeong Hee Moon
- 韩国大田忠南国立大学生化系
Kee K. Kim
- 美国密歇根大学医学院外科系
David M. Lubman
通讯作者
通讯作者：Jeongkwon Kim
伦理声明
伦理批准和参与同意
本研究中使用的人类骨髓来源MSCs(ATCC，目录号PCS-500-012)由ATCC提供，ATCC确保所有人类来源材料均符合伦理指南。ATCC已确认已获得收集这些人源细胞的伦理批准，且捐赠者提供了知情同意。
出版同意
不适用。
利益冲突
作者声明，他们没有已知的可能影响本论文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
附加信息
出版商说明
Springer Nature对已发表地图和机构隶属关系中的司法权声明保持中立。
补充信息
补充材料包括：图S1. 通过优化PEG 3350方法分离的MSC衍生外泌体中CD63和LGALS3BP的MS/MS谱图确认；图S2. MSC衍生外泌体中鉴定的357种蛋白质的蛋白质-蛋白质相互作用网络；图S3. 对应于图5(B)的钙网蛋白、钙连蛋白、CD63、CD9和LGALS3BP的全长Western印迹；表S1. 通过LC–MS/MS鉴定的MSC衍生外泌体蛋白质的网络分析指标；表S2. 通过LC–MS/MS鉴定的MSC衍生外泌体中的代谢物列表；表S3. MSC衍生外泌体中鉴定的代谢物的通路富集分析。
权利和许可
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关于本文
引用本文
Adelipour, M., Hwang, H., Marzouk, R.M. 等. 聚乙二醇法优化间充质干细胞外泌体分离用于再生医学应用. Stem Cell Res Ther (2026).
出版历史
收到日期: 2025年03月27日
接受日期: 2026年06月04日
发表日期: 2026年06月15日
DOI
关键词
间充质干细胞，外泌体分离，聚乙二醇，蛋白质组学，代谢组学
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