引言
高脂血症是一种代谢紊乱疾病，其特征是血液脂质水平异常，包括总胆固醇（TCHO）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）升高或高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）降低[1]。在美国，成人高脂血症的患病率为53%[2]。越来越多的证据表明，高脂血症是心血管疾病发病和死亡的重要危险因素[3–5]。然而，尽管有标准干预措施，不到35%的患者能够达到充分控制[6]。因此，深入理解高脂血症有助于开发额外的治疗策略。
肠道微生物群与宿主脂质代谢和高脂血症风险密切相关[7]，已探索针对肠道微生物群以降低脂质水平的策略[8–11]。口腔腔，通过消化道与大肠相连，是上消化道中的主要微生物栖息地，也是人体中第二丰富的微生物群落[12]。口腔和肠道微生物组相互作用并协同调节生理功能和病理过程[13]。新兴研究表明，口腔微生物组与各种心血管和代谢疾病相关[14,15]，包括高血压[16]、动脉粥样硬化[17]、糖尿病[18]和慢性阻塞性肺疾病（COPD）[19]。口腔微生物组干预是心血管和代谢疾病的一种新兴治疗策略[20]。因此，调查口腔微生物群与脂质代谢的关联在临床上具有重要意义。然而，尚无系统分析阐明口腔微生物群与宿主脂质代谢之间的关系。
本研究旨在利用大型国家队列探索口腔微生物组与高脂血症之间的关联，增强对口腔微生物组在高脂血症预防和治疗中潜在作用的理解，并确定潜在的治疗靶点。
方法
研究人群
国家健康和营养调查（NHANES）由国家卫生统计中心（NCHS）进行，是一系列针对美国人口的横断面、多阶段概率调查。数据可在疾病控制与预防中心（CDC）网站（
在本研究中，最初纳入了2009-2012年NHANES周期的所有参与者数据（n = 20,293）。随后根据以下标准排除参与者：（1）年龄<18岁（n = 7,902）；（2）怀孕（n = 125）；（3）缺乏血液脂质谱数据（n = 6,945）；（4）过量饮酒（n = 773），定义为每天饮用4/5杯或更多（考虑到酒精对口腔微生物组的已知影响）[22–25]；（5）缺乏口腔微生物组数据（n = 1,484）。最终共有3,104名参与者被纳入分析（图1）。
高脂血症定义
高脂血症参与者根据成人国家胆固醇教育计划指南（2002年）[26]确定，符合以下任一标准：（1）TCHO ≥ 200 mg/dL；（2）TG ≥ 150 mg/dL；（3）LDL-C ≥ 130 mg/dL；（4）男性HDL-C ≤ 40 mg/dL或女性≤ 50 mg/dL；（5）先前诊断为高脂血症或当前使用降脂药物。这些指标的测量具体程序在NHANES实验室方法网页上有详细说明（
生存结果
鉴于高脂血症是心血管疾病相关死亡的重要危险因素[27]，生存分析的主要结局是心血管疾病相关死亡。心血管疾病相关死亡通过NHANES参与者与国家死亡指数（NDI）死亡证明数据之间的概率记录链接来确定。本研究分析了截至2019年12月31日的NHANES相关NDI公共访问数据。
口腔微生物组
2009-2010年和2011-2012年调查中所有14-69岁的参与者都有资格进行口腔微生物组采样。参与者被指示用漱口水漱口5秒，然后将漱口水吐入杯子以获取口腔冲洗样本。DNA通过PureGene DNA纯化试剂盒从口腔冲洗样本中提取。随后进行聚合酶链反应扩增以进行基因测序[28]。原始测序数据被解复用并处理生成扩增子序列变体（ASVs）[29]。
口腔微生物群落多样性由α多样性指数表示，这些指数通常反映群落的丰富度和/或均匀度[30]。α多样性指标包括观察到的ASVs[操作分类单元（OTU丰富度）]、系统发育多样性[Faith的系统发育多样性（FPD）]和Shannon-Weiner指数（SWI）。这些指标基于每样本10,000次测序的稀疏化生成[29]。OTU丰富度测量样本中观察到的ASVs总数；FPD通过系统发育树信息量化丰富度；SWI同时评估丰富度和均匀度。
β多样性测量个体之间的微生物组多样性，以个体间的成对差异表示。在本研究中，计算了个体间的非加权UniFrac、加权UniFrac和Bray-Curtis差异，并表示为距离矩阵[29]。
协变量
分析中包含以下变量作为协变量：年龄、性别、种族（墨西哥裔美国人、其他西班牙裔、非西班牙裔白人、非西班牙裔黑人、其他种族）、婚姻状况（已婚/与伴侣同居、从未结婚/丧偶/离婚/分居）、教育水平（高中以下、高中或同等学历、大学或更高学历）、贫困收入比（≤1.0，>1.0）、身体质量指数（BMI）、健康保险状况、吸烟状况、体力活动、糖尿病和高血压病史。体力活动根据参与者是否进行中强度或高强度活动分为高和低水平。糖尿病和高血压病史根据问卷调查结果确定。
统计分析
使用卡方检验和t检验评估按高脂血症状态分层的参与者的人口统计学特征。应用Spearman相关系数确定变量之间的相关性。进行单变量和多变量逻辑回归分析，以估计比值比（ORs）和95%置信区间（CIs），调查变量与高脂血症风险之间的关联。使用单变量和多变量线性回归分析探索变量与血液脂质之间的关系。进行单变量和多变量Cox比例风险回归分析，以估计风险比（HRs）和95% CIs，检验变量与心血管疾病相关死亡之间的关联。进行亚组分析和交互作用分析，探索不同分组变量与α多样性在死亡风险方面的相互作用。通过Kaplan-Meier方法绘制生存曲线。对于上述回归模型，模型1为未调整模型；部分调整模型（模型2）调整了年龄、性别和BMI；完全调整模型（模型3）额外调整了种族、婚姻状况、体力活动、吸烟状况、贫困收入比（PIR）、健康保险状况、糖尿病病史和高血压病史。缺失协变量数据通过"mice"包中的链式方程多重插补（MICE）方法进行插补[31]，缺失协变量信息摘要见补充数字内容表S1，可获取于：
使用主坐标分析（PCoA）和置换多变量方差分析（PERMANOVA）来描述高脂血症和非高脂血症组之间β多样性的差异。口腔微生物组的分析通过"microeco"包[32]进行。线性判别分析效应大小（LEfSe）分析用于计算不同组之间的线性判别分析（LDA）得分，从而识别高脂血症人群中的关键微生物属[33]，LDA得分阈值为2.0。使用原核生物分类单元的功能注释（FAPROTAX）进行功能预测分析，以探索组间微生物功能的差异。进行中介分析以研究微生物功能对口腔微生物组与高脂血症之间关联的中介效应。
所有分析均通过R（版本4.3.2）进行。双尾显著性水平设为0.05，被认为具有统计学意义。对多重检验应用了Bonferroni校正，双尾显著性水平设为0.017。
结果
描述性统计
在3,104名参与者中，2,215名被归类为患有高脂血症。如表1所示，高脂血症组年龄更大（45.01 vs. 35.31，P < 0.001），BMI更高（29.81 vs. 25.60，P < 0.001），高血压患病率（32.14% vs. 12.60%，P < 0.001）和糖尿病患病率（12.78% vs. 4.39%，P < 0.001）也更高。两组之间在三种α多样性指数中的任何一种均未观察到显著差异（补充数字内容图S1，可获取于：
单变量和多变量逻辑回归分析用于探索三种α多样性指数与高脂血症风险之间的关联（补充数字内容表S2，可获取于： > 0.017）。
Alpha多样性与血脂的相关性
使用Spearman相关分析检查α多样性与四种血液脂质参数之间的关系（补充数字内容图S2，可获取于： = 0.050，P = 0.006）、FPD（Rho = 0.060，P = 0.001）和SWI（Rho = 0.053，P = 0.003）与TG呈正相关。相反，OTU丰富度（Rho = -0.119，P < 0.001）、FPD（Rho = -0.118，P < 0.001）和SWI（Rho = -0.070，P < 0.001）与HDL呈负相关。对于LDL，仅FPD呈正相关（Rho = 0.044，P = 0.015），而OTU丰富度或SWI未检测到显著相关性。三种α多样性指数均与TCHO无显著相关性。
此外，进行了多变量线性回归分析，以进一步调查α多样性与血液脂质之间的关联（表2）。在完全调整模型中，仅FPD与TG之间的正相关仍具有显著性（beta = 1.028，95% CI：0.070-1.985，P = 0.037），但经过Bonferroni校正后，这种显著性消失。在完全调整模型中，所有三种α多样性指数均显示与TCHO和LDL有显著正相关（P < 0.017），而与HDL的显著相关性不再观察到（P > 0.05）。
多变量调整的RCS也用于探索三种α多样性指数与四种血液脂质之间的非线性关联（图2）。OTU丰富度（图2J）、FPD（图2K）和SWI（图2L）均与HDL-C呈倒U型非线性关联（非线性P < 0.017）。OTU丰富度（图2A-C）、FPD（图2D-F）和SWI（图2G-I）与TG、TCHO或LDL之间未发现显著非线性关联（非线性P > 0.017）。
Alpha多样性与心血管相关死亡风险的关联
通过生存分析检查了口腔微生物组α多样性与心血管疾病相关死亡之间的关联（表3）。Kaplan-Meier分析（补充数字内容图S3，可获取于： < 0.001）。然而，在完全调整的Cox回归模型（表3）中，α多样性与心血管疾病相关死亡风险之间未观察到显著关联（P > 0.05）。
在亚组分析中（补充数字内容表S3，可获取于： = 0.006）、FPD（P = 0.013）和SWI（P = 0.027）在吸烟者亚组中与心血管相关死亡风险观察到统计学显著关联。此外，检测到吸烟状态与OTU丰富度（交互P值 = 0.029）和FPD（交互P值 = 0.044）之间存在交互作用。
高脂血症人群的微生物组特征
β多样性的PERMANOVA检验显示，高脂血症和非高脂血症组之间的Bray-Curtis距离（P = 0.012）、非加权UniFrac距离（P = 0.010）和加权UniFrac距离（P = 0.013）存在显著差异，表明两组之间微生物群落组成不同（图3A-C）。
在门（图3D）、纲（图3E）和目（图3F）水平上说明微生物分布的堆叠条形图显示组间无明显差异。进一步进行LEfSe分析以识别属水平的差异分类单元（图3G-H）。进化分支图分析显示组间差异属有限（图3G）。LDA显示，仅Prevotella和Parvimonas在属水平上的|LDA得分| > 2.0；因此，这些属被确定为高脂血症个体口腔微生物组中的关键属（图3H）。
小提琴图进一步证实，Prevotella（图3I）和Parvimonas（图3J）的丰度在高脂血症组中更高。此外，Kaplan-Meier生存分析显示，增加的Prevotella（图3K）丰度与心血管疾病相关死亡风险降低相关（P = 0.022），而未检测到Parvimonas（图3L）丰度与心血管死亡风险之间的显著关联（P = 0.620）。
Prevotella和Parvimonas与高脂血症的相关性
进行了Spearman相关分析，以检查Parvimonas（补充数字内容图S4 A-D，可获取于： E-H，可获取于： = 0.041）。还进行了完全调整的RCS分析，以探索Parvimonas（图4A-D）/Prevotella（图4E-H）与血液脂质之间的非线性关联。结果显示，Parvimonas与LDL之间存在倒L型非线性关联（非线性P值 = 0.023），Prevotella与HDL之间存在倒U型非线性关联（非线性P值 = 0.021）。
通过逻辑回归进行的亚组分析显示，尽管不存在交互作用，但在老年参与者、高血压参与者或糖尿病参与者中，Parvimonas（图4I）和Prevotella（图4J）与高脂血症的关联在统计学上不显著（P > 0.05）。
FAPROTAX功能预测分析
为探索组间微生物群落的功能差异，进行了FAPROTAX分析（补充数字内容表S4，可获取于：
中介分析（图5D-F）表明，Parvimonas可能通过硫酸盐呼吸（中介比例：49.28%，P < 0.001）、亚硫酸盐呼吸（中介比例：48.38%，P < 0.001）和硫化合物呼吸（中介比例：49.06%，P < 0.001）增加高脂血症风险。在中介分析中，Prevotella未观察到显著的中介效应（补充数字内容图S6 A-C，可获取于：
此外，Spearman相关热图（图5G）展示了56种微生物功能与四种血液脂质之间的相关性，揭示了硫化合物代谢与所有四种血液脂质之间的显著关联。
讨论
高脂血症是一种与微生物组相关的疾病[14]。据我们所知，这是首次在大型全国队列中系统分析口腔微生物群与宿主脂质代谢之间关联的研究。这些结果表明，高脂血症患者与健康对照者的口腔微生物组存在差异，为通过调节口腔微生物组管理高脂血症提供了理论基础。
口腔微生物组的α多样性已与慢性阻塞性肺病（COPD）、抑郁症和心血管死亡风险相关联[19,34–38]。在我们的研究中，高脂血症组与非高脂血症组之间未检测到α多样性的显著差异。然而，与血液脂质的相关分析显示，α多样性与TCHO和LDL呈正相关，与HDL呈倒U型非线性关联。这些发现表明，新物种进入口腔可能改变宿主脂质代谢，从而可能增加高脂血症风险。
先前研究报道了口腔微生物组α多样性与全因或心血管死亡率之间的关联[34,36–38]，我们的发现在人群子集中验证了这些结果。此外，亚组分析表明，在吸烟者和高脂血症患者中关联更强。然而，在完全调整的Cox回归模型中，未观察到α多样性与心血管死亡率之间的显著关联，可能是由于心血管死亡事件数量较少导致统计功效不足。在亚组分析中，仅在吸烟者中，较高的α多样性与较低的心血管相关死亡风险相关，且检测到吸烟状态与OTU丰富度/FPD在心血管死亡率风险方面的交互作用。已知吸烟会破坏口腔微生物组的稳态[39,40]，这表明α多样性可能作为评估吸烟不良影响的生物标志物。
LEfSe分析确定Parvimonas（LDA得分 = 2.41）和Prevotella（LDA得分 = 2.96）是高脂血症患者口腔微生物组中的关键属。Khocht等人对39名参与者的规模较小研究显示，口腔Parvimonas和Prevotella与肥胖相关[41]，而另一项对166名患有牙周炎的肥胖患者的研究报告了这些属的比例增加[42]。我们的研究在更大队列中证实了这些属与高脂血症的关联。在亚组分析中，尽管未检测到交互作用，但Parvimonas和Prevotella与高脂血症的关联在老年人、高血压患者或糖尿病患者中失去了统计学意义。这可能归因于这些人群与高脂血症患者之间存在显著重叠。
Prevotella与脂质代谢的关系仍然存在争议。在肠道微生物组研究中，Prevotella copri与肥胖表型呈正相关[43]。地中海饮食对心代谢疾病的保护作用在Prevotella copri丰度较低的个体中更为明显[44]。在动物实验中，Prevotella copri增加了猪的脂肪积累[45]。一些研究表明，针对高脂血症的干预措施会降低肠道Prevotella的丰度[46,47]。然而，其他研究报告高脂血症状态下Prevotella丰度较低[48,49]。重要的是，先前研究集中在肠道Prevotella，而我们的工作调查了口腔Prevotella与脂质代谢的关联。
Parvimonas parva直到2021年才被识别[50]，而Parvimonas micra是Parvimonas属中众所周知的物种，代表该属的主要物种。Parvimonas micra被公认为对宿主有不利影响的细菌，是关键的促炎性口腔病原体[51,52]。它的存在增加了口腔癌和结直肠癌的风险[53–56]。此外，Parvimonas micra已与动脉粥样硬化的发展相关联[57]。
功能预测和中介分析显示，硫化合物呼吸与宿主脂质代谢显著相关，且Parvimonas可能通过硫化合物呼吸增加高脂血症风险。硫化合物呼吸的关键产物是硫化氢[58]，Parvimonas已被确定为口腔中参与硫化氢产生的主要属[59]。外源性硫化氢促进脂肪细胞分化、增殖和肥大[60]。我们假设Parvimonas可能通过硫化氢产生导致高脂血症。然而，由于FAPROTAX分析的预测性和推断性，这些发现仍停留在计算层面，缺乏直接实验证据，应谨慎解释。我们研究的最终目标是通过口腔微生物组管理来调节脂质代谢，这突显了进一步研究以阐明口腔微生物硫代谢是否增加高脂血症风险的必要性。
从临床角度来看，我们的发现表明口腔微生物组可能作为筛查高脂血症高风险人群的非侵入性生物标志物。有针对性的调节口腔微生物组，如控制Parvimonas的丰度、减少与硫代谢相关的通路以及维持口腔微生物组稳态，可能为高脂血症的预防和管理提供新的辅助策略。此外，人工智能（AI）技术和大型语言模型在医学研究和多组学数据整合方面显示出革命性潜力[61,62]。将口腔微生物组数据与先进的AI模型相结合，将有助于开发更准确的高脂血症风险预测模型，并支持微生物组靶向治疗的临床转化。
本研究有几个局限性。NHANES数据库不提供物种水平的微生物组数据，限制了识别关键口腔微生物物种的分辨率。横断面设计排除了确定的因果推断；高脂血症本身可能会增加口腔中某些病原微生物的定植，而不是相反[63]。单一国家队列限制了结果的普遍性。尽管我们试图将高脂血症相关数据与匹配的心血管生存结果相关联，但事件发生率低需要谨慎解释。尽管对口腔微生物组与高脂血症进行了系统的相关分析，但本研究缺乏对研究结果的实验验证，这将是未来研究的重点。
结论
总之，本研究是首次在大型全国队列中系统调查口腔微生物组与高脂血症关联的研究。口腔微生物组的α多样性与血液LDL和TCHO水平呈正相关，与血液HDL水平呈倒U型非线性关联。Parvimonas和Prevotella是高脂血症患者口腔微生物组的特征属。Parvimonas可能通过硫代谢增加高脂血症风险。需要进一步的机制研究来验证这些发现并阐明口腔微生物组在高脂血症发病机制中的作用。
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