摘要与图表
随着现代医学的发展和健康生活方式的普及，人们比祖先活得更长、更健康。现代医学的成功使社会中老年人比例不断增加。全球研究团队已调查了肠道微生物群落对人类健康和福祉的贡献。研究表明，人类肠道微生物群的组成受生活方式因素调节，尤其是饮食。微生物群的组成和功能与习惯性饮食的直接和间接效应协同作用，对保持健康和活力至关重要。这一概念并非全新，但迄今为止，微生物群潜在贡献的规模尚未得到充分认识。据估计，人体内的细菌数量是人体细胞数量的十倍。细菌群落在成年人中相对稳定，但晚年发生的与年龄相关的变化可能对宿主健康产生负面影响。这种与成年人相关的微生物群的丧失与炎症标志物、虚弱、共病和营养状况的测量相关联。这种影响可能超过饮食，甚至在某些情况下超过遗传因素。总体而言，最近的研究表明微生物群及其相关代谢物在健康老龄化中的重要性，以及饮食在其调节中的重要性。
饮食、肠道微生物群与营养状况的相互作用
人类胃肠道具有多个对健康和福祉至关重要的关键作用。它作为处理食物和排泄废物的途径。它帮助控制食欲，容纳了体内最大的黏膜表面，其中包含免疫系统的重要组成部分，甚至有助于情绪、行为和整体健康。胃肠道中数量最多的细胞部分并非人类细胞，而是微生物。大多数这些细菌被称为共生菌，意味着它们通常驻留并代谢人类饮食成分。人体内外的微生物所拥有的基因总数是人类基因补充的百倍。胃肠道是地球上最多样的环境之一。肠道微生物群现已被认为是健康风险的主要环境调节因子。独立于遗传和其他生活方式因素，肠道微生物群具有编码能力和潜在的代谢活性，对人类生理产生重大影响。
在婴儿期，微生物群组成在前2-3年内趋向于成年模式，初始多样性较低并在此期间增加。这一过程的中断可能与日后患过敏性疾病的风险相关。在成年期，微生物群的改变与多种疾病相关[de Vos和de Vos综述]。特别有说服力的是研究老龄化受试者中的微生物群。生命这一阶段伴随着一系列可能对肠道物理环境产生重大影响的生理和生活方式变化。几十年来，人们已经知道老年人的肠道微生物群，与非常年幼的人一样，处于波动状态。随着老年人肠道微生物群组成报告的广泛变化，以及不同个体、国家和人群中与年龄相关的健康损失速率不同，对老年人肠道微生物群-健康相互作用的详细分析尤为恰当。本综述总结了与微生物群变化相关的老年人生理与年轻成年人之间的差异，并详细介绍了基于培养的研究的主要发现，然后考察了近期无培养研究的健康意义，包括迄今为止最大规模的研究——ELDERMET联盟的研究。
老年人肠道微生物群可能受到影响的生理和临床问题
全球老年人比例正在快速持续增加。这导致社会对这一人群的医疗保健和社会支持需求增加，并突显了不仅追求长寿，而且追求最大化老年人功能能力和生活质量的健康老龄化的重要性。个体微生物群的多样性受到宿主内部和外部多种因素的塑造。常见的与年龄相关的生理变化可以改变生理功能，进而改变微生物群的组成。
生理、运动和感觉功能随年龄而变化。例如，晚年自然减少的牙齿和肌肉质量退化可能影响咀嚼能力。这可能限制饮食选择，而饮食变化可能极大地影响微生物群。衰老可能伴随肠道感觉障碍，因此增加对胃肠道并发症的易感性。其他与年龄相关的消化系统并发症包括吞咽困难、功能性消化不良、胃食管反流、肠道传输时间延迟、憩室病以及便秘、粪便和气体失禁的发生率增加，所有这些都可能显著影响微生物群组成和宿主健康。重要的是，味觉和口渴感觉、嗅觉和消化的障碍，加上吸收不良和老年人饱腹感水平的增加，可能导致营养摄入失衡、营养不良和微生物群的重大扰动。
微生物群与宿主之间的双向相互作用促进了免疫系统的功能调节，这反过来影响微生物群本身的组成。微生物群扰动已被证实与过敏、癌症、消化/肠道疾病、虚弱、肥胖/代谢紊乱及其相关病症等疾病易感性增加相关。它还可能影响激素信号等调节系统，导致情绪和行为变化。促进肠道与大脑连接的宿主代谢途径可能受到影响。这种双向稳态途径的破坏与炎症和应激反应改变相关联，包括老年人中常见的焦虑等其他与应激相关的症状。健康的、更多样化的微生物群组成鼓励对病原体的抵抗力和与宿主免疫系统的更多互动。老年期多样性的丧失与对病原体抵抗力降低和免疫功能的自然下降（免疫衰老）相关，伴随着老年人典型的慢性低度炎症（炎症老化）。低多样性微生物群和免疫衰老都可能导致胃肠道感染率增加。
在老年期，复杂的动态外源性因素，包括饮食和生活方式改变、药物使用（特别是抗生素）、疾病、伤害和压力进一步影响微生物群的组成。一生中的健康，特别是晚年，依赖于稳态的维持，即稳定生理环境的存在。成人肠道微生物群在物种水平上的相对稳定性是促进和维持健康的关键因素。然而，在丰度水平上，微生物群的组成可以在短时间内大幅波动。这表明微生物群能够响应一生中的外源性影响。
基于培养的老年人肠道微生物群分析
传统上使用基于培养的方法来分析肠道微生物群。1989年在日本进行的实验中使用的一些方法示例可见[5]。基于培养的方法用于比较日本东京和日本一个老年人往往寿命更长的地区——汤来地区的老年人的微生物群。收集了来自两个地区的15名健康老年人的粪便微生物群。进行了多项实验以确定这些样本中发现的分离物的属，尽可能确定种。在厌氧稀释液中进行系列稀释，随后将样本涂抹在4个非选择性和11个选择性琼脂平板上。从厌氧平板到其他平板的亚培养有助于确定哪些微生物是严格厌氧菌。
为了鉴定分离物，对肉汤培养物进行了许多生化测试。这些测试包括检测细菌衍生的代谢物和确定胆汁对细菌生长的影响。Benno等人[5]报告称，虽然两个组观察到的属大多相同，但汤来地区受试者的双歧杆菌数量比东京受试者多。然而，汤来地区受试者的总细菌、厌氧菌、芽孢杆菌、梭菌、拟杆菌种和产气荚膜梭菌较少。Megamonas、Mitsuokella、Selenomonas和Acidaminococcus四个属仅从汤来地区受试者中分离出来，而未从东京受试者中分离。已知肠道双歧杆菌计数随年龄下降，而某些肠杆菌科增加。尽管汤来地区老年人年龄更大，但其双歧杆菌数量高于东京老年人，这表明汤来地区受试者并未表现出我们在世界其他地区看到的相同年龄相关微生物群变化。Benno等人[5]认为这是由于汤来地区受试者的高纤维饮食，这也是汤来地区人们往往寿命更长的原因。
2002年，另一项基于培养的研究聚焦于患有艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)的老年人[6]，这些患者有抗生素治疗史，导致微生物群紊乱。这种改变的微生物群提供了对艰难梭菌感染的抵抗力降低。随着抗生素的广泛使用和老年人数量的增加，CDAD已成为一个棘手的问题。Hopkins和Macfarlane[6]旨在表征患有CDAD的老年人的微生物群。他们根据细胞脂肪酸谱对分离物进行分类。他们的结果显示，与健康老年人和年轻受试者相比，CDAD患者的物种多样性最低，特别是双歧杆菌、拟杆菌和普雷沃菌。CDAD患者中的兼性菌种比健康受试者多。总之，这表明艰难梭菌与大大改变的微生物群相关。同一组在2004年完成了进一步研究[7]，这次比较了健康的年轻人和老年人，以及住院老年人。同样，他们使用脂肪酸来鉴定细菌。他们报告称，与年轻受试者相比，老年人中双歧杆菌和拟杆菌的数量和物种多样性减少。
使用此类基于培养的方法分析肠道微生物群的好处包括低成本，以及保留分离物进行进一步分析的能力。然而，基于培养的方法有许多缺点。它劳动密集型，而且用当前方法仍然不可能培养估计的肠道细菌的大多数（估计50-90%）。在当前人工培养基上生长的物种中，某些物种会超过其他物种生长，导致进一步偏见。基于培养方法的另一个缺点是系统发育分类的困难。对于某些微生物家族，必须使用多种方法对不同家族的属和种进行分类，如上所述。Benno等人[5]需要大量方法对分离物进行分类。这表明使用基于培养的方法识别分离物可能多么复杂。它还显示了识别给定分离物需要培养多少。其中一些方法通常无法区分给定属的两个物种，因此无法考虑生物学上相关的物种特异性基因或功能。需要快速、高通量、特异性和可靠的替代方法。
技术革命
过去十年见证了日益深入的研究技术的引入。与其尝试从给定环境中培养所有分离物，不如直接从样本中提取DNA。理论上，这种方法提供了对样本内分离物的无偏见视图。用于鉴定的首选位点是16S核糖体DNA。作为一种几乎存在于所有细菌中的管家基因，通常以高拷贝数存在，它易于扩增。它包含在物种和/或属之间不同的多个可变区域，因此允许有效鉴定。
实时定量PCR通常用于确定样本中某些细菌的比例。这种方法快速、便宜，对于确定特定细菌群的水平很有用。然而，当试图评估和比较多个不同群组时，qPCR变得繁琐。这种定向方法虽然在许多情况下非常有用，但并未提供肠道种群的详尽视图，这正变得越来越重要。2009年，开发了一种专门针对人类肠道的系统发育微阵列，称为HITChip[8]。该芯片由4,809个探针组成，必要时可以添加更多探针。然而，微阵列是一种高通量定向方法。虽然它们一次覆盖更多目标，但仍受探针限制。不同的探针具有不同的杂交能力，因此探针的选择可能引入偏见。
目前更常用的技术是高通量测序。有多种不同的测序技术可用；然而，基于16S核糖体DNA研究的微生物群落分析往往使用454 FLX Titanium焦磷酸测序，因为它可以获得更长的读取[9]。一次运行可以测序多达160万条读取。可以使用条形码适配器在一个载玻片上加载许多不同的样本。
对于焦磷酸测序等任何新技术，必须开发分析程序。目标是最大化获得的数据，同时最小化出错的可能性。速度和准确性至关重要，随着获取数据量的增加，能够处理大量读取的程序必不可少。处理焦磷酸测序数据时，可以执行许多步骤。必须分离多重文库。必须去除适配器序列。可以进行错误校正或去噪。在PCR扩增步骤期间可能形成嵌合序列。有可用程序可去除这些。进行聚类以减少后续步骤的时间和体积。最后，必须在不同的系统发育水平上对序列进行分类。
对这些技术的兴趣巨大，形成了大型跨国科学联盟，如人类微生物组计划[10]、MetaHIT（人类肠道宏基因组）[11]和较小的ELDERMET项目[12]，以及世界各地的众多实验室。这些联盟利用了新的高通量技术，并首次全面表征了肠道和其他身体部位的人类微生物组。
这些技术的使用展示了我们胃肠道中微生物种群的异质性，个体间细菌物种的存在和缺失存在巨大差异。虽然某些物种存在于大多数人群中，但就可发现的物种数量而言，这些物种是少数。这些较稀有的物种对宿主的福祉同样重要。物种往往共同出现，并可能由于饮食定义的习惯偏好、交叉喂养事件以及细菌素（一种特定于有限数量或范围物种的细菌产生的抗菌剂）的存在而聚类为共丰度群(CAGs)[12]。CAGs概念的替代方案是肠型。肠型的概念早于CAGs，并在几个特征上有所不同（表1）[13]。肠型群彼此不同，通常被描述为类似于血型。尽管存在争议，但这一概念已变得流行，并允许研究人员根据代表微生物群落的主导属对样本进行分类，这些微生物群落具有通过代谢物生产和免疫调节效应显著改变个体表型的潜力。
无培养方法分析老年人微生物群
老年人中的微生物变化
来自不同地理区域的许多研究试图表征一般健康人群的微生物群，并将这些与携带疾病的人、老年人甚至百岁老人——100岁以上的人进行比较。2001年，Hopkins等人[14]分析了来自英国儿童、成人、老年人和艰难梭菌感染老年患者的细菌16S rDNA序列。他们揭示了与成年人相比，老年人中双歧杆菌总体减少，乳酸菌略有减少。拟杆菌-卟啉单胞菌-普雷沃菌组没有变化，这与他们三年后[7]讨论的基于培养的研究相反。该组在2004年再次发表[15]，使用rDNA实时PCR比较健康老年人、住院老年人和接受抗生素治疗的老年人的细菌。与健康老年人相比，住院患者的拟杆菌-普雷沃菌物种丰度显著降低，而肠杆菌科、丁酸梭菌和粪肠球菌增加。与健康老年人相比，抗生素治疗患者显示粪肠球菌丰度增加，但拟杆菌-普雷沃菌组、脱硫弧菌、肠杆菌科、普拉梭菌、丁酸梭菌和瘤胃球菌丰度降低。普拉梭菌具有抗炎作用，因此抗生素治疗患者中水平降低可能与炎症老化相关。
其他研究关注老化的其他方面，如虚弱。荷兰一个养老中心的长期护理受试者研究[16]显示，虚弱增加与瘤胃球菌和Atopobium增加以及拟杆菌-普雷沃菌组、直肠真杆菌-梭状芽孢杆菌簇、乳酸菌和普拉梭菌减少相关。这种虚弱微生物特征与Bartosch等人[15]和Claesson等人[12]讨论的住院受试者中发现的特征相似。
不同年龄组中观察到的文化微生物差异
一项来自四个不同国家——法国、意大利、德国和瑞典——受试者的欧洲研究提供了基于位置差异的证据[17]。在法国或瑞典队列的年龄组之间未观察到差异。德国人群中直肠真杆菌-梭状芽孢杆菌簇随年龄增加，但在意大利受试者中随年龄减少，这与Bartosch等人[15]的荷兰研究类似。德国成年人的拟杆菌-普雷沃菌低于来自其他国家的成年人，而意大利老年人的比例如低于来自其他国家的老年人。在瑞典和意大利受试者中，普拉梭菌随年龄减少，但在法国或德国受试者中未减少。Atopobium簇在德国和瑞典人群中随年龄增加，但在法国和意大利人群中未增加。与相应成年队列相比，所有老年受试者中的双歧杆菌都较低；然而，这并不显著。意大利受试者的双歧杆菌显著多于其他人群。
Claesson等人[12]评估了来自四个不同居住地点——社区、长期护理、康复和日间医院——的大量爱尔兰老年人的微生物群。他们报告说，从社区到长期居住，拟杆菌门总体呈增加趋势，而厚壁菌门呈下降趋势。长期居住受试者中观察到Coprococcus和Roseburia丰度降低，而Parabacteroides、Eubacterium、Anaerotruncus、Lactonifactor和Coprobacillus增加。这项相对大型研究能够在控制饮食、药物甚至年龄等混杂因素的情况下，识别微生物群与虚弱和其他临床因素之间的许多微生物关系。
年轻人和健康老年人之间存在少数差异，与增加的变形菌门和双歧杆菌门相关联。Biagi等人[18]试图通过百岁老人解决这个问题。百岁老人往往与老年人和年轻人分开聚类，后者没有差异。主要是百岁老人的聚类具有更高的变形菌门和芽孢杆菌，而梭状芽孢杆菌簇XIVa较低，但未观察到拟杆菌门减少。
这些研究传达了给定人群中微生物群的巨大个体间差异。它们还为我们提供了不同人群之间可能看到的一些差异的视图。这些阐明了微生物群泛化观点的问题，并提醒我们在试图增加寿命和生活质量时将面临的困难。未来可能需要考虑某种程度的个性化或基于社区的方法。
饮食作为老年人微生物群变异的驱动因素
影响老年人肠道微生物群的因素
研究饮食作为老年人肠道微生物群变异调节因子的作用面临许多挑战，包括：(1)肠道微生物群的组成个体间变异性；(2)即使在看似同质的人群组中，如老年人，个体间饮食摄入的差异[12]；(3)饮食干预的可变效果，取决于基线微生物群；(4)医疗治疗的使用，特别是抗生素[19]；(5)分类适当的饮食干预时间框架以及如何量化其对整个微生物组的总影响。
人类胃肠道中的细菌居民能够合成多种微量营养素，包括多种B族维生素、统称为甲萘醌的维生素K2异构体，并有助于钙吸收，以及调节食欲和胰岛素释放（图1）。事实上，长期饮食选择可以极大地影响肠道微生物群种群，而营养状况也已被证明影响肠道微生物群的组成及其功能[20]。疾病也会影响饮食选择和多样性，这可能影响肠道微生物群的组成、多样性和代谢能力，并对旨在调节大肠微生物群的治疗产生重要影响。ELDERMET研究说明了减少饮食和微生物群多样性对临床的负面影响[12]。使用益生元、益生菌或组合（即合生元）的针对性饮食干预可能抵消负面的年龄相关变化，并解决长期广谱抗生素治疗对肠道的不利影响。有限的喂养试验显示这些补充剂结果令人鼓舞。
饮食对微生物群变异的影响
饮食可以对肠道环境产生显著影响，包括传输时间和pH值。改变三种主要宏量营养素（碳水化合物、蛋白质和脂肪）的摄入量可以显著影响微生物群的组成。在一项关于长期饮食对微生物群组成影响的研究中，Wu等人[21]发现高动物产品饮食摄入与拟杆菌相关，而更多植物材料摄入促进普雷沃菌属。同样，ELDERMET研究发现健康老年人中普雷沃菌属的细菌物种丰富[12]。一项调查不同不可消化碳水化合物（抗性淀粉和非淀粉多糖）对超重个体影响的饮食干预试验揭示了微生物群的适应性[22]。植物多糖（不包括淀粉）是细胞膜的关键结构和生物成分，统称为非淀粉多糖。这些结构成分不能被人类内源酶水解。相反，哺乳动物宿主和共生肠道微生物之间已经发展出复杂的相互依赖关系，这些微生物具有获取这种额外能量来源的能力，这可以贡献多达每日能量需求的10%。此外，大肠中在复杂底物的初级降解者和其他依赖于饮食底物的发酵和部分降解产物的细菌物种之间发生广泛的交叉喂养。
饮食在改变老年人群肠道微生物群中的重要性正变得越来越明显。Woodmansey等人[23]的综述表明，老年期碳水化合物代谢细菌减少，而蛋白质代谢细菌增强。有趣的是，认为肠道中增加的蛋白水解活性，由增加的拟杆菌和梭菌物种引起，负责腐败和产生有害的氨、胺、酚和吲哚，而高脂肪喂养在动物模型中与系统性内毒素产生和低度炎症增加相关[24]。高脂肪、高蛋白、低碳水化合物饮食促进结肠残留物的产生，这些残留物促进微生物产生潜在的致癌副产物[25]。认为微生物群通过调节丁酸盐、叶酸和生物素的产生来介导饮食对结肠癌风险的影响，这些分子已知在调节上皮增殖中起关键作用。然而，与高蛋白和脂肪摄入不同，碳水化合物增加肠道微生物多样性[21]，这与包括老年人群在内的多个群体中的若干健康益处相关联[12]。长期高膳食纤维摄入与增加的细菌细胞壁和xylan水解基因以及短链脂肪酸产量增加相关[26]，短链脂肪酸是上皮细胞的能量来源，已显示具有抗炎特性，可能特别有益于老年人群。
饮食干预
大多数饮食干预数据集中在人体中益生元的双歧杆菌作用上，益生元被定义为不可消化的碳水化合物，据认为通过刺激保护性肠道微生物群而对宿主健康有益。该领域的大多数研究集中在单一碳水化合物分数的调节作用上，主要是长链和短链碳水化合物，它们在上消化道中逃避消化。这些包括果寡糖(FOS)、半乳寡糖(GOS)、抗性淀粉和益生元，如菊粉和低聚果糖。然后它们在结肠中发酵，并选择性地刺激双歧杆菌的生长，这些双歧杆菌已知在老年期以显著降低的水平存在（表2）。研究表明，益生元通过肠道微生物群谱或发酵潜力的直接或间接变化影响免疫系统。此外，GOS和FOS已被归因于与矿物质生物利用度、脂质代谢和肠道习惯调节相关的功能声明。
老年人群中的益生元干预研究
已进行有限数量的干预试验，以确定某些益生元成分的微生物群调节作用。Walton等人[27]对39名50至81岁的人进行了研究，补充8克GOS或安慰剂6周，发现双歧杆菌和丁酸盐显著增加。Vulevic等人[28]也报告了GOS诱导的双歧杆菌生成，他们专注于10周内混合GOS制剂的免疫调节作用，导致吞噬作用增加和抗炎细胞因子谱。然而，肠道微生物群的个体间变异表明，微生物群落对益生元补充/饮食调节的反应也可能不同。事实上，某些研究志愿者被报告为"无反应者"，表明肠道微生物群初始组成的影响。
人类研究还调查了阿拉伯木聚糖低聚糖补充的影响，据报道会影响大肠中蛋白质/碳水化合物发酵平衡，从而影响结肠中潜在有毒代谢物的生成。补充试验据报道增加了包括双歧杆菌在内的总细菌种群[27]和粪便丁酸盐浓度以及发酵活性。需要进一步研究其他有前景的功能成分对老年人群微生物群组成的影响。
展望、知识缺口和所需研究
饮食-微生物群相互作用
从前文可以看出，饮食是老年人（和其他年龄组）微生物群变异的主要驱动因素。CROWNALIFE研究[17]测量的不同欧洲国家受试者的微生物群组成变化趋势的巨大差异几乎肯定是由于包括饮食在内的因素。Woodmansey[23]综述中所述，识别微生物群组成随年龄变化的统一趋势的困难，除了培养依赖性研究中使用的方法差异外，也可能在很大程度上归因于饮食影响。因此，有必要在精心表型的个体中进行大型纵向微生物群测量，这些个体消耗经过仔细测量的饮食，以及对基线时已分析微生物组的受试者进行受控饮食干预。由欧盟委员会资助的NuAge项目（www.nu-age.eu）将在某种程度上解决后一个愿望，因为其目标之一是在5个地理分布广泛的欧洲城市对1,250名受试者进行饮食干预，参与者将转为地中海饮食。然后将进行广泛的物理和临床测量，以寻求将记录的任何变化与受试者微生物组、炎症小体和外周血淋巴细胞表观基因组中的变化相关联。
饮食-微生物群-药物相互作用
即使在较健康的受试者中，老年人中药物的消耗（通常是多种类型）也很常见。然而，尚无专门研究肠道微生物群如何影响或受多种药物影响的研究。至少已有30种药物已知被微生物群修饰[29]，并且有充分证据表明微生物群的活性可以影响药物的活性或生物利用度[30]。加上饮食影响，这可能呈现出一个复杂的环境修饰因子，对老年人尤其相关。要解开这些相互作用，需要强有力的充分研究。
生态系统管理、微生物群恢复和替代
术语"失调"通常用于传达改变的微生物群，但定义核心微生物群的困难使得描述何时发生失调变得非常具有挑战性。尽管如此，最近的研究已经明确表明，低多样性微生物群是经历肥胖、炎症性肠病[31]和加速老化相关健康损失[12]的受试者的常见特征。如上所述，我们对长期居住护理受试者中虚弱和健康损失增加的研究以较低多样性的微生物群和-shotgun宏基因组数据中较低的基因计数为特征[12]。虽然饮食调整可能是恢复微生物群多样性的最简单方法，但由于生理或财务障碍，实施起来可能实际困难。此外，在老年人中，缺失的微生物群元素可能无法仅通过饮食恢复。粪便微生物群移植已被证明对治疗人类艰难梭菌有效[32]，并可恢复代谢综合征患者的葡萄糖敏感性[33]。在人类之间移植整个微生物群存在残留安全问题，但基于定义的培养微生物开发人工组合提供了清洁可重复替代品的前景。对于老年人，可以想象有些人已经失去了整个能够水解或代谢某些饮食成分（如抗性淀粉或其他复杂多糖）的微生物群落。所谓的"细菌疗法"也可能是将所需微生物群元素恢复到这些个体的唯一方法。
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