摘要
造血干细胞（HSCs）能够自我更新并分化为所有血细胞，维持造血系统。与年龄相关的HSC功能障碍会影响整个造血过程，而衰老HSC中的DNA甲基化改变会加剧功能异常。生长停滞和DNA损伤诱导蛋白（Gadd45a、Gadd45b和Gadd45g）在HSC激活过程中表达，且已有报道称Gadd45b可诱导DNA去甲基化。因此，我们探索了Gadd45b、DNA甲基化与年龄相关HSC变化之间的关系。对GADD45B敲除小鼠HSC进行的全基因组亚硫酸盐测序表明，年轻敲除HSC的DNA甲基化水平升高，与老年野生型HSC相比，既存在独特的甲基化变化，也存在重叠的甲基化变化，但并未反映衰老相关的转录变化。外周血和骨髓分析、竞争性移植以及单细胞培养分析均显示，发生异常甲基化的GADD45B敲除HSC并未出现显著的功能潜能丧失。我们得出结论，这些改变的甲基化位点并不影响HSC潜能。我们整合了现有数据集，生成了一个可搜索的HSC DNA甲基化数据库，并提供了一个与HSC功能变化相关的甲基化位点精简列表，以优先确定目标，从而重置与年龄相关的HSC潜能丧失。
1 引言
衰老导致造血干细胞功能能力下降，其特征是小鼠模型中HSC数量增加以及向髓系和血小板分化的偏向性（Beerman等，2010）。与年轻HSC相比，老年HSC的表观基因组和染色质组织已观察到变化（Beerman等，2013；Itokawa等，2022；Sun等，2014）。据报道，年轻HSC的全局DNA甲基化水平在70%至90%之间（Cabezas-Wallscheid等，2014；Sun等，2014），而DNA甲基化变化可能影响其分化潜能（Beerman等，2013；Yu等，2016）。DNA甲基化和去甲基化的作用主要由DNA甲基转移酶（DNMT）和十-十一易位（TET）家族蛋白执行（Ambrosi等，2017）。在造血过程中，Dnmt和Tet家族基因突变的鼠模型显示HSC分化决策的调控失调（Challen等，2014；Cimmino等，2015；Moran-Crusio等，2011；Tie等，2020；Trowbridge等，2009），导致克隆扩增和髓系细胞生成改变。这些也是与衰老相关的表型。此外，老年HSC中Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt1和Tet1的表达水平较年轻HSC下降，表明DNA甲基化调控的变化也与衰老相关（Flohr Svendsen等，2021；Sun等，2014）。先前的研究已报道HSC的全局DNA甲基化水平随年龄增长而升高（Beerman等，2013；Kuribayashi等，2021；Sun等，2014）；然而，DNA甲基化的年龄相关变化是否直接影响HSC的功能潜能尚不清楚。
老年HSC会积累DNA损伤，但仍能激发DNA损伤反应通路（Beerman等，2014；Flach等，2014）。在静息期，包括GADD45家族的DNA修复通路受到抑制，但在进入细胞周期时被激活（Beerman等，2014）。GADD45蛋白家族由GADD45A、GADD45B和GADD45G组成，通过激活多种通路来增强细胞在DNA损伤诱导应激下的存活能力，在应激信号传导中发挥关键作用（Niehrs和Schafer，2012）。这一在DNA损伤中的关键作用通常是该家族的研究重点，但Gadd45a或Gadd45b在神经细胞中的过表达会导致DNA损伤增加以及DNA去甲基化的诱导（Barreto等，2007；Ravel-Godreuil等，2021）。Gadd45b也被认为参与脑细胞的去甲基化（Labonte等，2019；Ma等，2009）。为了揭示GADD45B在衰老过程中是否调节造血系统的DNA甲基化，我们研究了GADD45B敲除模型，以评估其在造血干细胞DNA甲基化和功能潜能中的作用。我们发现，在HSC中缺失GADD45B后，与衰老后失去甲基化的位点存在惊人的重叠，但这些甲基化状态的重叠变化并未导致功能变化。结合我们新生成的DNA甲基化数据集与先前的研究，我们创建了一个可搜索的数据库，定义了老年HSC中可重复改变的DNA甲基化位点。通过减去与GADD45B KO HSC重叠（且无功能改变）的DNA甲基化位点，我们确定了一个显著减少的潜在DNA位点列表，以靶向缓解与年龄相关的HSC功能变化。
2 方法（略，详见原文）
3 结果
3.1 年轻小鼠中GADD45B敲除使HSC的DNA甲基化水平升高至与老年WT HSC相似的水平
为了测试GADD45B在造血干细胞DNA去甲基化中的作用，我们对从年轻和老年小鼠中分离的野生型（WT）和GADD45B敲除（KO）HSC进行了全基因组亚硫酸盐测序。年轻WT HSC（YWT）的平均全局DNA甲基化水平为82.1%，而老年WT HSC（OWT）则升高至90.1%（图1a），这与先前报道一致（Beerman等，2013；Kuribayashi等，2021；Sun等，2014）。在KO HSC中也观察到相同的年龄相关甲基化增加趋势，老年KO（OKO，88.2%）高于年轻KO（YKO，84.1%）。YKO的全局甲基化水平也高于YWT，但OWT与OKO之间无差异。DNA甲基化谱的主成分分析显示，OKO和OWT HSC聚集在一起，而YKO HSC的甲基化模式更接近老年HSC的表观遗传景观，而非YWT（图1b）。
为了检查驱动PCA聚类的表观遗传修饰，我们定义了这些组之间比较中的差异甲基化CpG（DMC）。在WT衰老过程中（OWT vs. YWT），我们发现了超过400万个高甲基化CpG（3,011,859个）和仅189,639个低甲基化DMC。YKO与YWT HSC的比较显示，在缺乏GADD45B的年轻HSC中，有1,032,085个高甲基化和382,464个低甲基化DMC。这一年轻KO与WT之间的DMC数量大于OKO与YKO之间年龄相关变化的数量（高甲基化：982,060；低甲基化：163,828）。将DMC映射到基因组位置显示，所有比较中位点的分布准相似。大多数DMC位于TSS上游>1 kb或下游>10 kb处，以及内含子或基因间区域。仅有一小部分DMC位于基因启动子附近。然而，当我们生成差异甲基化区域（DMR）时，大多数DMR位于基因启动子区域附近（DMR-NP，-1000 bp ≤ TSS ≤ 100 bp）。
为了探索缺乏GADD45B的HSC中特定的甲基化差异以及那些与HSC衰老相关的位点，我们比较了各组之间甲基化变化的重叠程度。我们发现，最频繁重叠的两个比较是WT衰老（OWT vs. YWT）和年轻HSC中GADD45B缺失（YKO vs. YWT）相关的变化，有209,801个高甲基化位点和5,158个低甲基化位点重叠（图1d）。第二常见的重叠是衰老相关的甲基化变化，在OWT vs. YWT和OKO vs. YKO比较中均可见（图1d）。对来自所有四个比较的DMC的甲基化水平分析显示，在检查野生型年龄相关甲基化变化时，YKO谱与老年HSC之间存在层次聚类（图S1b）。在YKO vs. YWT定义的DMC处，老年HSC与YWT相比具有类似的甲基化增加，YKO接近OWT和OKO。然而，当我们评估老年KO HSC的DMC时，甲基化谱要么按GADD45B表达聚类（OKO vs. OWT），要么按年龄聚类（OKO vs. YKO）（图S1b）。这些结果表明，由GADD45B缺失诱导的DNA甲基化变化产生了与WT衰老相关的一些甲基化变化，其中一些DNA甲基化变化在敲除动物衰老过程中得以维持；然而，也存在衰老特异性和GADD45B-KO特异性的DNA甲基化改变。
我们还观察到，在检查DMR-NP时，OWT vs. YWT与YKO vs. YWT以及OKO vs. YKO之间的变化重叠显著富集（图1d）。鉴于衰老与年轻HSC中GADD45B缺失的甲基化模式之间存在惊人的重叠，我们检查了用于测量生物学年龄的DNA标记是否也受到影响。使用多种DNA甲基化时钟计算了GADD45B-KO和对照小鼠HSC的表观遗传年龄，发现KO HSC的生物学年龄似乎基本不受这些由GADD45B缺失驱动的甲基化改变的影响（图S1c）。
3.2 衰老相关的HSC转录改变在GADD45B-KO中得以维持
为了确定GADD45B-KO衰老转录特征是否与WT衰老相关的转录变化相似或不同，以及这些改变的表达谱是否与DNA甲基化变化相对应，我们对年轻和老年小鼠的WT和KO HSC进行了RNA测序。主成分分析显示，YKO HSC的基因表达谱在PC1上与其他样本分离最远，而KO和WT老年HSC彼此紧密聚集（图2a）。这表明，与DNA甲基化相反，年轻HSC中GADD45B-KO的转录景观并未与衰老表型重叠。为了更明确地检查变化，我们定义了每个比较中差异表达基因（DEG），阈值为调整后p值<0.05且倍数变化>1.5（图2b）。表达差异最显著的比较是OKO vs. YKO，上调和下调基因数量相似（2,321和2,657）。与甲基化差异相反，OWT vs. YWT和YKO vs. YWT的DEG之间没有显著重叠富集。在GADD45B KO和WT之间，年龄相关的DEG存在富集（图2b），这些DEG与已报道的老年HSC特征基因重叠（Flohr Svendsen等，2021）（图S2a）。这表明，尽管YKO的甲基化谱与老年HSC相似，但转录上YKO并未表现出更"衰老"的转录组。
对比较之间DEG的IPA上游通路分析预测，在WT和KO比较中，老年HSC相对于年轻HSC的RXRA和RXRB受到抑制，而在YKO vs. YWT中，预测的逆转，YKO HSC中RXRA和RXRB均被激活（图S2b）。RXRA和RXRB已被认为与HSC静息相关（Cabezas-Wallscheid等，2017；Menendez-Gutierrez等，2023；Zeng等，2024），视黄酸受体表达缺失导致静息降低和适应性下降（Menendez-Gutierrez等，2023）。在经典通路分析中，也预测了YKO与YWT之间细胞周期调控的潜在改变（图2c）。GADD45B敲除中细胞周期变化的z分数主要由年轻GADD45B KO HSC中Cdc25a、Cdc25b、E2f2、E2f4以及蛋白酶体20S和26S亚基的表达增加驱动。
为了确定DNA甲基化变化是否与转录变化相关，我们建立了比较之间DEG与重叠的DMR-NP。在OKO vs. YKO比较中，有176个基因同时出现在DEG和DMR-NP中；OWT vs. YWT中有79个；YKO vs. YWT中有153个；OKO vs. OWT中有5个重叠（图2d）。我们分析了当转录和DNA甲基化同时发生变化时的相关性（图2e）。一般来说，启动子区域的高甲基化水平与低表达相关，反之，未甲基化启动子可发生高表达；因此，调控基因表达的DNA甲基化变化应呈负相关（象限2和4）。然而，第2和第4象限中基因并未富集，表明大多数差异表达区域独立于DNA甲基化变化。
3.3 Gadd45b-KO HSC与WT相比未显示任何功能差异
我们接下来检查了GADD45B-KO中的甲基化或转录改变是否影响HSC的功能潜能。由于视黄酸信号在GADD45B-KO和衰老中均被涉及，且GADD45B是重要的细胞周期调节因子，我们首先评估了HSC的离体细胞周期潜能。我们制备了两种单细胞培养培养基：(1)分化培养基，富含细胞因子和FBS，以诱导HSC分化和增殖；(2)维持培养基，无FBS的最低培养基，以延长离体干细胞特征（图3a）。YKO和YWT HSC的时间过程分析（图S3a）显示，在两种培养基条件下，首次和第二次细胞分裂的时间均无显著差异（图3b）。KO HSC的分裂速度略快于WT HSC，但差异无统计学意义。我们还使用EdU掺入实验检测了批量分选HSC在培养前18小时内的增殖频率，但再次未观察到YKO和YWT HSC之间的显著差异（图3c），MPP也未观察到差异（图S3b）。在比较从第1天到第7天的单细胞生长轨迹时，YWT和YKO之间也没有差异（图3d），在第14天由任一年轻HSC组产生的集落大小也未观察到显著差异（图3e）。
由于Gadd45b参与应激信号传导和对DNA损伤的反应，我们还通过照射诱导YKO和YWT HSC的DNA损伤，以评估单细胞反应。无论GADD45B表达如何，经照射的HSC具有相似的分裂动力学，且YKO和YWT HSC在照射后存活率均下降（图3f,g）。在照射的HSC中，培养7天后集落大小减小，并在14天时保持，但WT和KO之间无差异（图3h，图S3c）。我们也没有检测到老年GADD45B-KO HSC与老年WT HSC的生长动力学差异（图S3d）。因此，GADD45B缺失并未改变离体干细胞的生长动力学。
为了确定GADD45B KO对体内血液系统的影响，我们通过流式细胞术对年轻和老年WT和KO小鼠的外周血和骨髓进行了分析（图4a,b）。我们显示年轻KO和WT小鼠的外周血无显著变化（图4a），但在OKO vs. YKO比较中，与OWT vs. YWT比较相比，我们观察到更明显的衰老相关表型，即髓系细胞增加和B细胞减少。在WT和KO骨髓中，HSC频率随年龄增加，仅在老年KO HSC的淋巴偏向MPP Flk2+区室中观察到显著变化（图4b）。与OWT相比，OKO中CD150high频率（髓系偏向HSC）的增加也加剧，同时CD150neg频率降低（图4c）。
为了评估HSC在应激下的功能潜能，我们进行了竞争性移植（图4d）。所有测量HSC适应性的参数在相同供体年龄的KO和WT之间均无显著差异：外周血嵌合率（图4e）、供体系输出（图4f）、骨髓嵌合率（图4g）和供体造血干细胞与祖细胞组成（图4h）。这些实验支持YKO小鼠的外周血和骨髓细胞与YWT小鼠相当，且YKO HSC的功能潜能未受损。此外，OKO HSC的功能潜能与OWT HSC相比无显著差异（图4f-h），尽管亚群组成有所改变。作为另一种HSC挑战，我们在年轻KO和WT动物中注射了两个周期的5-氟尿嘧啶（5-FU），并在动物造血系统恢复稳态后（6周）检查了LSK群体（图4i）。这种造血应激也未在YKO和YWT造血干细胞与祖细胞之间诱导差异（图4j）。
3.4 YKO中的DNA甲基化变化不驱动HSC功能潜能的改变
在我们的分析中，尽管YKO HSC的DNA甲基化谱与老年HSC存在显著重叠，但我们未观察到YKO HSC功能的显著差异。因此，我们试图确定是否能够缩小与功能变化相关的DNA甲基化变化列表。为此，我们生成了一个复合数据集，比较了衰老HSC研究中报道的DNA甲基化变化（Beerman等，2013；Kuribayashi等，2021；Sun等，2014）（表S6），并结合了本手稿的数据。我们还纳入了我们认为具有功能相关性的一组DNA甲基化变化：去除YKO DMR后的年龄相关甲基化变化，因为YKO DMR未导致功能变化（图5a）。在WT衰老相关的DNA甲基化变化中，仅有6个DMR（5个高甲基化和1个低甲基化）与先前报道的所有三个DMR共同。这些重叠度相当低，由于四个数据集之间HSC的性别、年龄、覆盖深度和免疫表型差异可能导致差异，我们生成了一种可搜索的方法，用于可视化从每个数据集报告并映射到mm10的DNA甲基化数据。例如，Clec1a（老年HSC中最可重复的DEG转录本之一）在四个数据集中有三个数据集的老年HSC启动子区域DNA甲基化降低，而年轻Gadd45
KO HSC中该区域的DNA甲基化水平较高，但在RRBS数据集中该区域无覆盖（图5b）。我们发现在四个数据集的起始位点存在DNA甲基化差异，但仅有两个比较将这些差异定义为显著。我们还观察到年轻GADD45B-KO中甲基化降低——这与Clec1a转录相比年轻WT HSC显著升高相关，但这种表达增加并未导致功能差异。我们提供了这一跨多个实验搜索HSC甲基化谱的工具。
4 讨论
在本研究中，我们揭示了敲除HSC中的GADD45B会诱导全局DNA甲基化增加，与老年HSC中报道的DNA甲基化增加类似。我们发现不仅全局DNA甲基化增加与衰老表型相同，而且年轻GADD45B-KO HSC的整体甲基化图谱更接近于老年HSC而非年轻WT HSC。然而，在包括金标准竞争性移植实验在内的功能检测中，这些DNA甲基化变化对功能潜能的几乎没有影响。一个可能的原因是GADD45A和GADD45G可能具有补偿作用，以抵消GADD45B缺失的影响。类似地，GADD45A KO和GADD45G KO小鼠均未显示造血干细胞和祖细胞功能潜能的受损。因此，当其中一个Gadd45基因缺失时，可能足以诱导DNA甲基化变化，但不足以改变造血系统的功能。
我们的DMR-NP与转录变化的整合分析显示，甲基化与基因表达差异之间仅有有限的重叠，且未发现一致的负相关（图2d,e）。这些发现与最近的研究一致，表明大多数年龄相关的甲基化变化并不通过启动子甲基化直接调控转录。尽管我们聚焦于TSS附近的DMR-NP，但这些位点并未显示出与转录输出的强相关性。由于基因表达还受到增强子活性、远端调控元件和染色质结构的影响，一部分DNA甲基化变化可能在启动子区域之外发挥作用。这些考虑支持了以下解释：GADD45B KO与老年HSC之间共享的许多DNA甲基化改变代表了非功能性或远端的表观遗传变化，并不驱动HSC功能潜能的转变。
DNMT1/3和TET1/2是HSC衰老过程中DNA甲基化维持和转换的核心调控因子。通过将我们的DEG和DMR-NP数据集与已发表的DNMT和TET缺陷造血干细胞和祖细胞数据集进行比较，我们观察到在转录水平上重叠有限，而在DNA甲基化变化水平上则存在显著更大的趋同程度。这种分离表明Gadd45b主要影响表观遗传景观，而不直接执行DNMT或TET酶调控的转录程序。
在全基因组分析中关联表观遗传和功能变化具有挑战性，因为存在大量定义的差异，且转录与DNA甲基化变化之间往往缺乏直接相关性。Yu等人利用多色谱系追踪监测HSC克隆分化，发现单细胞分析中干细胞的表观遗传预编程比转录组能更好地指示功能潜能，且干细胞即使暴露于不同环境也能保留这种表观遗传衍生的潜能。我们提出了一个模型，其中HSC的甲基化模式已发生改变（年轻HSC中的GADD45B-KO），导致了与衰老过程中许多甲基化改变重叠的表观遗传变化；然而，这些重叠的变化并未导致表型改变，表明这些甲基化标记对于功能潜能的变化并非关键。这些数据强调了为表观遗传时钟选择的甲基化位点的重要性，因为并非所有年龄相关的DNA甲基化变化都是功能衰老的直接指标。然而，在我们使用五个不同表观遗传时钟的分析中，除一个时钟外，所有时钟对YKO的预测年龄均与YWT相似，这与功能潜能相关，表明这些时钟的甲基化位点似乎与HSC的功能相关性良好，尽管它们可能与转录变化无直接关联。为了进一步研究HSC中的关键变化，我们生成了一个可搜索的年龄相关甲基化变化数据库，并定义了一个精简的DNA甲基化标记库，这些标记有助于HSC功能潜能的变化。
作者贡献
W.K.、M.T.-Y.、H.Y.和F.T.-T.进行了实验并分析了结果；B.P.进行了生物信息学分析；I.B.、W.K.和M.T.-Y.设计了研究并解释了结果；I.B.和W.K.撰写了手稿。
致谢
衷心感谢Rafael de Cabo博士和Myriam Gorospe博士以及TGB所有成员提供的宝贵支持。感谢基因组核心在数据处理和测序建议方面的协助。Shiny应用的支持和协助由Nirad Banskota和Andy Varshine提供。感谢NIA流式核心的Christopher Dunn。我们感谢NIA比较医学部所有成员始终如一的努力和高标准的动物护理。本研究的数据分析利用了NIH HPC Biowulf集群的计算资源。本研究完全由NIH国家老龄化研究所的院内研究项目支持。NIH作者的贡献是其作为NIH联邦雇员职责的一部分，符合机构政策要求，并被视为美国政府作品。然而，本文提出的发现和结论仅代表作者个人观点，不一定反映NIH或美国卫生与公众服务部的观点。
资金
本研究由国家老龄化研究所（NIA）资助（AG000992）。
伦理声明
所有动物护理、处理和程序均经NIA动物护理和使用委员会（ACUC）批准（469-TGB-2025），并符合NIH动物指南。
利益冲突
作者声明无利益冲突。
数据可用性声明
发表时，所有原始数据均可在NCBI基因表达综合数据库（GEO）中以登录号GSE276335获取。Shiny应用可在以下网址获取：
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