摘要
睾丸衰老常伴随生殖健康下降，但其分子机制尚不明确。本研究构建了包含35名21-69岁男性睾丸细胞214,369个单细胞转录组的数据集，为研究睾丸衰老提供资源。机器学习分析显示体细胞的衰老反应强于生殖细胞。研究识别出两个衰老相关变化阶段：第一个阶段发生在30岁供者生精小管周围细胞，表现为基底膜增厚的衰老前状态；第二个阶段在50岁时出现，睾丸细胞功能改变，包括莱迪细胞类固醇代谢异常和巨噬细胞免疫反应失调。分析还揭示体重指数对精子发生能力的影响随年龄增长而加剧，特别是在45岁后。研究结果阐明了睾丸衰老的分子特征及其与体重指数的关系，为未来研究提供了潜在诊断标志物和治疗靶点。
主体内容
女性生殖衰老与受孕时间延长和流产率升高密切相关。男性生殖衰老研究长期被低估，因其终生持续产生精子。但男性生育能力衰退已日益受到关注，这受到环境因素和生理因素的影响。
衰老是男性生育能力衰退的重要决定因素，表现为细胞功能障碍、疾病易感性增加和生殖内分泌功能改变。男性生殖衰老可引发类似更年期或迟发性性腺功能减退症的症状，因生理和分子改变导致生育力下降。年长男性的精子和生精小管功能呈现血清睾酮水平下降、基底膜完整性受损、睾丸体积重量减少，以及精子基因组完整性改变（包括端粒缩短、DNA稳定性降低和基因突变）。
尽管已有研究报道了人类、非人灵长类、小鼠和果蝇睾丸衰老的组织学变化，但对人类睾丸细胞类型响应衰老的分子机制仍存知识空白。已有的多组学研究（包括精子基因组分析、睾丸转录组、精浆蛋白质组或精子代谢组、精子表观组）试图阐明衰老和生活方式对男性生育力的影响，但人类异质性和生活方式因素（如体重指数）使得睾丸细胞对衰老的分子和细胞水平响应机制尚不明确。因此，大规模高质量样本的睾丸细胞图谱对于系统理解衰老机制至关重要。
生精作用发生在睾丸生精小管内，包括三个阶段：精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂、圆形精细胞转化为拉长的精子。体细胞（如支持细胞、莱迪细胞、生精小管周围细胞、巨噬细胞和内皮细胞）通过提供生长因子、营养物质、合成雄激素、辅助精子运输等机制积极参与该过程。本研究采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）对10个供体细胞进行表征，识别特征和通路，解析生殖细胞命运决定及衰老相关分子机制。
本研究构建了21-69岁男性睾丸衰老的单细胞转录组图谱，覆盖男性生育全周期。该数据集为探索男性亚生育是累积性还是即时性、不同睾丸细胞是否同步或异步响应衰老、肥胖与衰老如何协同影响生育等关键问题提供机会。研究揭示了睾丸细胞对衰老响应的细胞类型敏感性差异，为分析衰老与肥胖的交互作用提供了分子层面的洞见。
结果
人类睾丸不同年龄的单细胞转录组
本研究收集了35个21-69岁男性尸体供者睾丸样本。使用10x Genomics Chromium平台进行scRNA-seq分析，集成既往数据（图1a）。研究覆盖了男性生育全周期，与既往活检样本一致。经质量控制后，共分析214,369个细胞，每个细胞平均检测到2,318个基因，6,265个分子标识符（UMI）。统一流形逼近与投影（UMAP）分析显示最小的批次效应。研究识别出体细胞和生殖细胞（图1b），并根据DDX4、TNP1和VIM表达进一步分为14个亚群，包括未分化精原细胞（PIWIL4、TSPAN33）、分化精原细胞（KIT、MKI67）、早期初级精母细胞（SPO11、SYCP3）等。
年龄预测中细胞群特异性
研究使用机器学习评估睾丸细胞群在年龄预测中的重要性。通过八种监督学习模型分析，XGBoost模型显示体细胞在年龄预测中具有重要性（图2b）。优化模型后，内皮细胞、生精小管周围细胞、巨噬细胞、莱迪细胞和拉长的精子细胞预测性能超0.8。混淆矩阵验证了模型性能（图2d）。
体细胞的一致性和特异性变化
研究通过成对差异基因分析显示：30-60岁男性体细胞差异基因数增加（补充图7a）。基因本体（GO）分析发现免疫反应通路上调，而胰岛素反应、Notch信号、伤口愈合等通路下调（图3a）。生精小管周围细胞（TPC）在30岁时出现显著差异基因（占26%），表现为胞质翻译（RPL38、RPL37、RPL17）、p53介导的信号转导和核糖体生物发生通路的上调，氧化应激反应（HSPA1A、HSPA1B）、细胞外基质（MMP14、COL14A1、COL5A2）和胶原蛋白原纤维组装通路的下调（图4b）。PAS染色显示30岁供者基底膜增厚（图4d-e），定量分析显示I型胶原蛋白改变（图4f-g），CellChat分析显示30岁TPC与其它细胞通讯改变（扩展数据图4c-d）。
单倍体生殖细胞的显著变化
虽然各年龄组都观察到精子发生，但某些样本精子细胞数量减少（图5a）。未分化精原细胞数量随年龄显著下降（图5b）。免疫荧光染色显示30岁供者UTF1+和cKIT+细胞增加，50-60岁cKIT+细胞增加（图5c）。差异基因（DEG）分析显示：50岁时单倍体生殖细胞出现显著转录组变化，如鞭毛依赖的细胞运动、精子形态发生和双链断裂修复通路（扩展数据图6a-c）。
体重指数对精子发生的影响随年龄增长加剧
体重指数（BMI）和生活方式显著影响睾丸功能。分析发现：高BMI供者精子细胞数量减少（图6a），尽管仍能生育，提示BMI阈值可能导致次生育。年龄对转录组变化的解释方差显著高于BMI（图6b）。ROC曲线显示年龄和BMI对亚生育预测的AUC值分别为0.82和0.71（图6c）。高BMI（≥30）与低BMI（<30）组比较显示：50岁后单倍体生殖细胞频率差异显著（图6d），III级肥胖（BMI>40）类精子细胞数量显著下降（图6e）。TPC、莱迪细胞和平滑肌细胞的差异通路分析显示，高BMI的转录组变化与年龄相关通路重叠（图6f-h），提示高BMI加速衰老。
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