摘要
间充质干细胞（MSCs）是临床应用最广泛的干细胞类型，但其质量与数量在不同组织来源和供体间存在显著差异。诱导多能干细胞（iPSCs）作为MSCs的替代来源，可克服成人MSCs的局限性。本研究通过TGF-β选择性抑制剂SB431542处理，发现其能显著增强iMSCs的成骨潜力并减少早衰现象。研究团队建立了一种无异种成分的可靠分化方案，适用于符合药品生产质量管理规范（GMP）的临床级iMSCs生产。
引言
MSCs因其多向分化能力、免疫调节特性及促进组织修复功能，被视为再生医学的重要治疗手段。本团队在骨再生研究中使用的下颌骨膜来源MSCs（JPCs）具有高成骨分化潜力。然而，MSCs临床应用面临供体差异性、体外扩增早衰、异体移植免疫排斥及组织获取伦理争议等挑战。
iPSC衍生MSCs（iMSCs）具有标准化生产、减少供体差异、潜在细胞年轻化等优势。iPSCs可无限扩增，且可通过皮肤或血液等易获取组织建立，规避骨髓/脂肪组织捐献的伦理问题。早期iMSCs分化方法多借鉴胚胎干细胞研究，现有方案在复杂度、耗时及结果一致性方面仍存缺陷。
方法
细胞培养
从3名供体获取下颌骨膜细胞（JPCs），经伦理审批（618/2017BO2）。iPSCs在Vitronectin包被板中培养于Essential 8培养基。
iPSC重编程
采用自复制RNA载体将JPCs重编程为iPSCs，培养基添加B18R蛋白及SB431542（TGF-β抑制剂）。
iMSCs分化
iPSCs在含10μM SB431542的hPL5培养基中分化，通过CD105表达检测分化效率。采用流式细胞术分析CD44、CD73、CD90、CD105等MSC标志物，以及SSEA-4、TRA-1-60等iPSC标志物。
成骨诱导与检测
在成骨培养基中诱导分化，通过Alizarin红染色定量钙沉积，检测ALPL、OCN、RUNX2基因表达。
衰老检测
通过SA-β-gal活性检测及P16、P21基因表达评估细胞衰老程度。
结果
iMSC分化优化
添加SB431542后，细胞形成三维聚集体，第10天出现明显外周梭形MSC样细胞。CD105表达分析显示，两组（±SB）间无显著差异，但SB组细胞形态更均一。
表型特征分析
iMSCs在P1-P2阶段MSC标志物（CD44、CD73、CD105）表达达平台期，iPSC标志物（SSEA-4、TRA-1-60）显著下调。SB组P16表达随传代下降，接近JPCs水平。
成骨潜力对比
SB组在P4时钙沉积量达- SB组的2.3倍（p<0.0001）。Alizarin红浓度检测显示，SB_d10和SB_d5组在P2-P4期间显著上升，证实SB作用窗口期在分化前5-10天。
衰老标志物分析
iMSCs SA-β-gal活性（MFI 702.3-821.3）高于JPCs（550.5），但低于iPSCs（69.8）。P21表达随传代持续下降，SB组下降幅度更大（P3时较JPCs低54.9%）。
讨论
本研究证实：
- SB431542通过抑制TGF-β信号，显著增强iMSCs成骨潜力；
- 分化早期（0-10天）SB处理效果最佳；
- 无异种成分培养体系（含人血小板裂解液）符合临床转化需求；
- CD105+细胞计数标准化可提升分化效率可重复性。
研究发现SB作用机制可能涉及：
- 抑制iPSC去粘附诱导的应激性衰老
- 调控P16/P21通路，延缓复制性衰老
- 促进成骨谱系特化，抑制成纤维细胞分化
结论
本团队建立了一套改良的iMSCs分化方案：
- 通过避免iPSCs解离、控制CD105+细胞密度，将应激性衰老降低40%
- 添加SB431542 5-10天，使P4代iMSCs成骨潜力达到JPCs的92%
- 整个流程符合GMP标准，为临床转化奠定基础
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