摘要
胶质瘤和脑转移瘤预后较差，需要更深入地了解脑肿瘤生物学并开发有效的治疗策略。虽然我们团队和其他研究者已证明各种肿瘤中存在微生物，但关于癌症类型特异性肿瘤内微生物群的最新争议强调了严格、正交验证的重要性。这项前瞻性、多机构研究共纳入243个样本，来自221名患者，包括168个胶质瘤和脑转移瘤样本以及75个非癌性或肿瘤邻近组织样本。使用严格的荧光原位杂交、免疫组织化学和高分辨率空间成像技术，我们在胶质瘤和脑转移瘤样本中检测到细胞内细菌16S rRNA和脂多糖，它们定位于肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞中。定制的16S和宏基因组测序工作流程确定了与肿瘤微环境中细菌信号相关的分类群；然而，标准培养方法未能产生可培养的微生物群。空间分析显示，细菌16S信号与抗菌和免疫代谢特征在区域、邻域和细胞水平上存在显著相关性。此外，肿瘤内16S细菌信号与匹配的口腔和肠道微生物群显示出序列重叠，提示可能与远端微生物群有关联。这些发现将微生物元素引入脑肿瘤微环境的组成部分，并为未来的机制和转化研究奠定基础。
主要内容
胶质瘤，包括胶质母细胞瘤(GBM)和脑转移瘤(BrM)，是成人最常见的脑恶性肿瘤形式。尽管通过手术、放疗和系统治疗进行了最大程度的治疗，原发性或转移性脑肿瘤患者的预后仍然具有挑战性。了解脑肿瘤微环境(TME)的复杂性并确定塑造肿瘤免疫环境的因素，对于推进我们对脑肿瘤生物学的理解和改善该疾病的预后至关重要。
微生物群已被认为是肿瘤免疫的重要调节者。最近的研究表明，在各种癌症类型的TME中存在微生物细胞和遗传物质，并研究了它们在癌症进展中的机制作用，特别是在肿瘤免疫浸润方面。然而，所有主要人类癌症类型中是否存在癌症类型特异性的微生物群一直存在争议，这主要是由于检测和分类低丰度微生物样本所用计算方法的固有限制。因此，仅基于生物信息学分析的结果应谨慎解释，并辅以验证方法。重要的是，"微生物群"或"微生物组"这一术语应保留用于描述环境中多样且活跃的微生物群落，需有强有力的证据支持。
在此背景下，初步研究提供了脑肿瘤中存在微生物元素的证据。具体而言，在GBM和中枢神经系统(CNS)转移瘤中检测到细菌核酸。此外，GBM肿瘤被发现含有由肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)识别的HLA II类结合细菌肽。然而，多样化微生物群是否能够浸润并存在于脑TME中仍然是一个活跃的研究领域。
在这项研究中，我们实施了稳健的互补实验和生物信息学方法，以调查前瞻性多机构队列中胶质瘤和BrM患者体内微生物和微生物元素的存在情况。我们未观察到可培养细菌群落的证据，表明脑肿瘤中可能不存在肿瘤微生物群。然而，使用广泛的高分辨率成像技术，我们验证了脑TME中存在细胞内细菌元素(RNA、DNA和膜成分)。我们进一步利用空间技术，证明了肿瘤内细菌信号与独特的抗菌和免疫代谢特征之间的相关性。最后，我们使用严格的生物信息学流程来表征肿瘤内细菌信号，并证明其与远端微生物群的相关性。
研究结果
细菌16S信号可在原发性和转移性脑肿瘤中检测到
为确定和验证细菌及细菌元素在原发性和转移性脑肿瘤中的存在、分布和生物学相关性，我们应用了严格的整合互补实验和生物信息学方法的工作流程，包括荧光原位杂交(FISH)、免疫组织化学(IHC)和空间分子成像(SMI)用于信号检测；培养组学和生物信息学分析用于表征；以及SMI和数字空间分析(DSP)用于功能分析。该研究包括来自221名患者的243个组织样本(168个肿瘤样本：113个胶质瘤，55个BrM；22个肿瘤邻近正常组织(NAT)；以及53个非癌性脑组织)。
我们首先对15个胶质瘤和15个BrM样本的全组织切片进行RNAScope FISH检测，使用经过验证的16S rRNA泛细菌探针以及阴性对照探针。在11个胶质瘤和9个BrM肿瘤中检测到明显的16S rRNA信号。z轴堆叠成像检测到靠近细胞核的16S rRNA信号，提示细胞内定位。与胶质纤维酸性蛋白(GFAP；胶质瘤)或泛细胞角蛋白(BrM)膜标记物的共染色显示，细菌16S rRNA的多样化定位模式，包括细胞质、膜邻近和细胞外分布。值得注意的是，16S rRNA信号在大小和形态上各不相同，有些与完整细菌(约2微米)一致，而另一些则显示点状模式，提示可能存在完整的细菌细胞和片段化的细菌16S rRNA。
为进一步研究细菌元素的存在，我们在用于16S rRNA FISH的连续组织切片上进行脂多糖(LPS)染色。在13个胶质瘤和9个BrM样本中检测到LPS，染色模式提示细胞内和细胞外定位。值得注意的是，16S rRNA FISH和LPS染色结果在30个样本中的22个中一致(两种方法均为阳性n=18，阴性n=4)。
为评估这些细菌信号是否特异性存在于肿瘤组织中，我们接下来检查了非肿瘤对照。在新鲜切割的健康脑组织芯片(TMA)中未检测到细菌16S rRNA信号。我们还评估了NAT(14个样本)中的16S rRNA信号和LPS染色。虽然仅在4个样本中检测到16S rRNA信号，但LPS染色在14个样本中的12个中呈阳性，并在血管周围和实质区域均被观察到。
为在更高分辨率下评估鉴定的细菌16S信号并检查其在脑TME内的空间分布，我们使用CosMx平台(Bruker Spatial Biology)进行了SMI。SMI在从胶质瘤和BrM肿瘤构建的两个TMA上进行，并使用人类6K发现面板和定制的泛细菌16S探针面板。
肿瘤内16S信号在细胞内和细胞外环境中均被检测到。尽管不能忽视细胞外16S信号的潜在生物学意义，但当前技术在准确区分真正的细胞外16S rRNA信号和组织处理过程中引入的潜在污染(例如组织固定和包埋)方面存在局限性。因此，我们仅考虑用于分析的细胞内16S信号。为确保真正的细胞内定位，我们排除了细菌16S信号靠近细胞膜的细胞，因为这种邻近性结合与细胞分割相关的固有限制可能产生假阳性细胞内模式。因此，仅当中位细菌16S位置位于所有x、y和z轴上所有转录本位置中央50%内(即位于细胞体中心)的细胞才被视为高置信度16S阳性细胞。
我们的综合分子分析表明，在胶质瘤和BrM样本中，使用16S RNAScope FISH、LPS染色和高分辨率SMI可检测到脑TME中的细胞内细菌元素。
接下来，我们评估了在脑TME中检测到的细菌信号是否可归因于可培养细菌。我们准备了来自9个新鲜切除肿瘤、13个新鲜冷冻肿瘤样本和2个来自癫痫患者的非癌性新鲜冷冻脑样本的匀浆。所有新鲜冷冻样本均使用SMI、16S扩增子测序和/或宏基因组鸟枪测序进行评估，并确认含有细菌16S信号。在新鲜切除的肿瘤中，3个样本有足够的组织可用于培养后进行16S rRNA数字聚合酶链反应PCR(dPCR)，证实存在细菌16S拷贝(每微升2.5-16拷贝)。将匀浆接种在营养丰富的培养基上，有或没有营养丰富的肉汤预富集，并在厌氧和需氧条件下进行。在所有条件下，培养14天后均未观察到细菌生长。这些发现表明，脑肿瘤和非癌性脑样本可能缺乏通过标准培养技术评估的可培养细菌。
脑肿瘤中鉴定出与非癌性脑组织不同的细菌特征
为更深入地表征肿瘤内细菌信号，我们从MD安德森癌症中心(MDACC1和MDACC2队列)和休斯顿德克萨斯大学健康科学中心(UTH队列)的胶质瘤和BrM肿瘤患者中组建了前瞻性队列，使用16S(V3-V4)rRNA扩增子测序进行分析。作为比较，我们纳入了一个UTH非癌性脑队列，其中包含作为耐药性癫痫手术一部分切除的非癌性脑组织。
生物信息学分析16S数据集面临挑战，特别是对于预期没有或低丰度细菌信号的样本，如脑组织，这主要是由于污染效应。为检测并最小化分析中潜在污染物的影响，我们应用了一系列五步过滤步骤，旨在去除最常见的污染类型。经过此过滤过程后，46.6%的肿瘤样本(118个中的55个)和76.9%的非癌性脑样本(13个中的10个)未保留任何可检测的细菌信号。在剩余样本中，共鉴定出34种细菌分类群(每个样本观察到的属为1-15个)。值得注意的是，与我们的16S FISH一致，在非癌性脑组织中检测到的信号最少。这些发现共同表明鉴定的肿瘤内16S信号具有肿瘤特异性。
在鉴定的细菌分类群中，16个与人类共生微生物群相关，代表潜在的生物学意义信号；然而，18个被发现是已知的环境污染物。这些结果突显了对低丰度样本进行生物信息学分析的固有限制，表明即使严格的过滤方法也无法消除所有污染物。因此，从低生物量样本的生物信息学分析中获得的分类学数据需要验证。
我们进一步询问通过16S rRNA基因测序鉴定的分类群是否可通过更广泛的基因覆盖进行验证。我们对45个肿瘤样本(胶质瘤n=30，BrM n=15)进行了宏基因组鸟枪测序。非人类读数平均占总读数的0.056%，其中平均0.46%被发现是细菌的。为补充16S(V3-V4)覆盖，宏基因组测序针对SILVA核糖体RNA基因数据库进行过滤，确保检测到的分类群源自非核糖体细菌基因。我们应用过滤工作流程以最小化包含可能来自污染的读数，这消除了43%和20%的胶质瘤和BrM样本，分别在17个胶质瘤和12个BrM样本中留下总共29和24个物种(24和21个属)。
这些发现揭示了胶质瘤和BrM中的不同细菌分类群，并证实至少有一部分表现出细胞内定位。然而，确定单个分类群的意义和普遍性将需要更大规模的研究。
高16S信号的肿瘤区域富含抗菌特征
我们接下来使用DSP(GeoMx平台)检查脑TME中肿瘤内16S信号与蛋白质和转录本特征的关联。DSP在先前描述的胶质瘤和BrM TMA上进行，使用GeoMx免疫肿瘤蛋白质组图谱(IPA)、全转录组分析(WTA)和定制的泛细菌16S探针。
值得注意的是，与肿瘤组织相比，正常肿瘤邻近脑组织中的细菌16S信号显著较低。为调查细菌rRNA与肿瘤蛋白质和转录本特征的空间关系，我们计算了从16S探针获得的细菌信号的几何平均值，并将感兴趣区域(ROIs)标注为16S-low(第一四分位数)或16S-high(第四四分位数)。无监督主成分分析(PCA)表明，16S-high肿瘤ROIs与16S-low肿瘤ROIs相比有明显聚类。为验证这一点，我们使用线性混合模型(LMM)识别16S-high区域与16S-low区域相比差异富集的转录本和蛋白质。
在胶质瘤和BrM的16S-high肿瘤区域中，我们发现了与抗菌反应相关的蛋白质和转录本。在胶质瘤中，我们观察到损伤相关分子模式(DAMP)分子的蛋白质富集，包括HMGB1和HMGB2，它们与Toll样受体(TLRs)等模式识别受体(PRRs)相互作用。在BrM中，16S-high区域表现出TLR9的蛋白质富集，TLR9是检测细胞内微生物核酸的关键PRR，以及TLR9下游经典通路，由MyD88、NF-κB家族成员和干扰素调节因子(IRFs)等上调支持。
在BrM的16S-high肿瘤区域中，我们还观察到中性粒细胞趋化因子、中性粒细胞酶和抗原呈递蛋白质的上调。为更深入探索16S-high区域内的细胞组成，我们在连续TMA切片上进行多重免疫荧光染色，发现CD16+CD56−GZMB−细胞显著富集，可能代表中性粒细胞。
除了抗菌特征外，我们还在胶质瘤的16S-high肿瘤区域中观察到染色质重塑蛋白的富集，以及在胶质瘤和BrM的16S-high肿瘤区域中脂质代谢和细胞应激反应蛋白和转录本的富集。
值得注意的是，与肿瘤内16S信号相关的抗菌、免疫和代谢特征与泛炎症环境无关，因为它们与其他肿瘤炎症特征(包括IL-6和STAT3通路、巨噬细胞活性和慢性炎症)没有显著相关性。总体而言，这些发现提供了与BrM和胶质瘤肿瘤中肿瘤内16S-high区域相关的抗菌、免疫和代谢特征的证据。
16S阳性肿瘤细胞和邻域表现出独特的转录谱
接下来，我们利用SMI在单细胞和邻域水平上以更高分辨率验证DSP的区域分析。包括具有超过20个16S阳性肿瘤细胞的参与者进行分析(胶质瘤，n=3；BrM，n=4)。
我们首先对胶质瘤和BrM个体的样本进行差异基因表达分析，以识别每种肿瘤类型中与16S信号相关的共享肿瘤内在转录模式。与DSP分析一致，我们在胶质瘤和BrM中均发现了与抗菌和免疫反应相关的转录本，包括PRRs、NF-κB和TRIM家族成员以及白细胞介素信号，以及参与脂质代谢、细胞应激和凋亡/自噬的转录本。在胶质瘤中，16S阳性细胞还显示出血管生成相关转录本的上调，可能与抗菌和先天免疫特征相关，以及与染色质重塑、轴突生成和神经炎症相关的转录本。
为识别更广泛的生物学模式，我们使用来自基因本体论生物过程(GOBP)和Reactome注释的定制基因集进行通路分析。这些定制模块反映了DSP突出的关键过程，包括微生物-宿主相互作用、免疫募集、脂质代谢、细胞应激反应和血管生成。在BrM中，组合16S阳性肿瘤细胞的通路评分显著高于所有四名患者，表明相关通路反映了协调的转录程序，而不仅仅是孤立的基因水平变化。
我们还分析了胶质瘤和BrM中16S阳性肿瘤细胞周围30微米半径内的邻域与16S阴性邻域的共享转录谱。与我们的区域分析一致，胶质瘤和BrM样本中围绕16S阳性细胞的组合邻域表现出细胞因子信号和免疫募集相关转录本的上调，以及与脂质代谢、细胞应激和血管生成相关的转录本。
总体而言，尽管该检测中细胞数量少存在局限性，但我们识别出与BrM和胶质瘤个体中16S信号相关的细胞和邻域水平上的独特转录谱和生物通路，这与我们的区域DSP分析一致。
肿瘤内细菌16S信号与口腔和肠道微生物群相关
鉴于关于肠-口-脑轴的大量文献，我们着手确定鉴定的肿瘤内细菌信号是否与相关的肠道或口腔微生物组相关。在我们的前瞻性队列中，在开颅术时收集了匹配的粪便(胶质瘤n=65，BrM n=28)、唾液(胶质瘤n=109，BrM n=42)和脸颊拭子(胶质瘤n=112，BrM n=42)样本，并使用宏基因组鸟枪测序进行分析。
胶质瘤和BrM患者的肠道和口腔微生物组在β多样性上没有差异，提示与脑肿瘤类型无关。我们将组合的胶质瘤和BrM数据集与来自人类微生物组计划(HMP)的健康个体的宏基因组测序数据进行比较。脑肿瘤相关和健康微生物组之间的β多样性显著不同，我们在脑肿瘤患者中鉴定出独特的口腔和肠道细菌特征。有趣的是，我们发现几种脑肿瘤相关的口腔和肠道细菌分类群与使用16S扩增子或宏基因组测序鉴定的肿瘤内细菌分类群重叠，提示肿瘤内细菌信号与口腔和肠道微生物群之间可能存在相关性。
为进一步评估这种相关性，我们对34个匹配的肿瘤和唾液样本(胶质瘤n=28，BrM n=6)和19个匹配的肿瘤和粪便样本(胶质瘤n=16，BrM n=3)进行了宏基因组鸟枪测序。为避免交叉污染，肿瘤、唾液和粪便样本分别处理和测序。在34个肿瘤-唾液样本对中的11个中，我们发现肿瘤细菌信号与唾液微生物组之间存在重叠，包括Prevotella、Veillonella、Neisseria、Streptococcus和Bifidobacterium等。平均而言，肿瘤中检测到的序列全长的79%与唾液细菌序列重叠。在肿瘤-粪便样本对中，19个肿瘤-粪便样本对中的1个检测到序列重叠。总体而言，肿瘤中鉴定的总分类群中有53%与唾液或粪便分类群重叠。
此外，从原发肿瘤迁移到转移部位的播散性肿瘤细胞可能代表BrM中细菌信号的另一个潜在来源。为评估这一点，我们对匹配的BrM和原发肿瘤的回顾性队列(n=8对)进行了宏基因组鸟枪测序。过滤后，在8个原发肿瘤中的3个和8个BrM样本中的2个中检测到细菌分类群；然而，匹配对之间未鉴定出重叠分类群。这表明肿瘤细胞播散可能不是细菌信号转移的主要途径。
讨论
恶性脑肿瘤，特别是GBM和BrM，由于治疗选择有限，仍然是临床挑战。在这项研究中，我们将细胞内细菌16S信号识别为脑TME的组成部分，尽管仅在部分肿瘤样本中以低丰度存在。我们的发现与最近关于各种癌症类型(包括GBM和CNS转移瘤)中细菌核酸的报道一致，以及它们在TME内的异质分布。
尽管微生物组研究历史上依赖于测序和计算分析，但最近的报告对这些标准方法在低丰度样本(如肿瘤组织)中的可靠性提出了担忧。这种技术限制在我们的16S扩增子和宏基因组鸟枪测序数据分析中很明显，严格的去污染工作未能消除所有已知污染物。因此，需要互补方法来评估预期低丰度样本中的微生物存在。这在几项研究中得到了体现，这些研究使用靶向方法在原位染色细菌，从结直肠癌和黑色素瘤肿瘤中恢复可培养细菌，并检测乳腺癌标本中的细菌活性。
在本研究中，我们使用基于RNA的FISH、LPS染色和SMI验证了细胞内细菌元素的存在和分布，并使用空间技术评估了它们在脑TME中的生物学相关性。值得注意的是，与细菌大小和形态相关的16S rRNA FISH显示出从微小点状到细菌大小结构的信号。结合LPS检测，这些发现提示可能存在完整和片段化的细菌。然而，我们从脑肿瘤标本培养细菌的尝试未产生任何细菌菌落，这可能反映了从组织标本中培养低丰度和异质分布细菌的技术挑战，或复杂环境中肿瘤内细菌的表型变异可能使其处于休眠状态且不可培养。尽管如此，证据仍不足以得出脑肿瘤中存在多样化和活跃微生物群的结论。这些发现强调，TME中细菌元素的性质和功能可能因肿瘤类型和解剖位置而异，从某些肿瘤中的多样化微生物群到其他肿瘤中的低丰度细菌元素。
我们在研究中观察到的细菌元素的细胞内分布与结直肠癌和口腔鳞状细胞癌中的先前报道一致。我们鉴定的肿瘤内细菌分类群主要是革兰氏阴性细胞内厌氧菌(如Prevotella、Fusobacterium和Capnocytophaga)以及兼性细胞内(如Neisseria)和细胞外(如Gemella)分类群。除了直接内化或侵入外，来自细胞内和细胞外分类群的细菌元素还可以通过细菌细胞外囊泡进入非吞噬细胞，这些囊泡可携带各种生物活性分子，包括蛋白质、LPS或脂磷壁酸以及核酸(如小RNA和DNA)。
一旦内化，细菌或其细胞外囊泡可以调节宿主反应，如促进促炎信号传导(例如通过NF-κB激活)和免疫逃逸。利用空间技术，我们发现肿瘤内细菌信号与TME的细胞、邻域和区域水平上的抗菌、免疫和代谢特征相关。特别是在BrM中，TLR9和NF-κB通路的组成部分——细胞内微生物核酸的先天免疫反应——富集。此外，肿瘤内16S信号与中性粒细胞存在和活性增加相关，这与结直肠癌中的先前发现一致。有趣的是，胶质瘤(而非BrM)中的16S-high区域显示出染色质重塑蛋白的上调，提示原发性和转移性脑肿瘤中对细菌信号的宿主反应不同。总体而言，这些数据提示肿瘤内16S信号在脑TME中可能具有潜在的生物学作用。然而，由于本研究的临床设计，无法确定因果关系。相反，我们的发现为未来确定肿瘤内细菌信号功能后果的机制研究奠定了基础。
与肠道微生物群在解剖学上远离的肿瘤相关微生物元素的起源在很大程度上仍未知。已提出几种机制将微生物和微生物元素转移到TME，包括局部共生体的定植、血液传播、肿瘤介导和免疫细胞介导的转位以及细菌细胞外囊泡。在本研究中，我们证明肿瘤内16S信号在分类群和序列水平上与口腔和肠道微生物群重叠。有趣的是，在神经退行性疾病和原发性脑肿瘤患者的脑中已检测到口腔细菌核酸和蛋白酶，以及肠道细菌肽。这些发现提示远端微生物对这两种病理的贡献可能存在机制重叠。值得注意的是，在本研究中，与肠道细菌相比，更多口腔细菌分类群与肿瘤内细菌信号重叠，这可能反映了口腔和脑之间的解剖学接近性以及共享的引流淋巴结。此外，在阿尔茨海默病中，嗅觉途径已被建议作为口腔微生物转移到脑的潜在途径。然而，我们的研究还揭示了肠-口细菌转位的证据，在脑肿瘤患者的肠道微生物群中富集口腔分类群，反之亦然。这种双向交换(先前在包括癌症在内的不同病理中报道过)可能是观察到的序列重叠的基础。
BrM肿瘤中的另一个可能机制是通过循环转移肿瘤和免疫细胞转移细菌遗传物质，如先前在结直肠癌肝转移中报道的那样。在匹配的BrM和原发肿瘤的回顾性队列中，我们发现BrM中的肿瘤内细菌信号与其对应原发肿瘤之间没有相关性。尽管样本量小，但这一发现表明肿瘤细胞播散可能不是细菌信号转移的主要途径。非转移性脑肿瘤中细菌信号的存在及其在脑驻留基质细胞中的分布进一步支持了这一观点。然而，这里鉴定的几种细菌分类群(如Fusobacterium nucleatum)也在其他实体原发肿瘤中被发现，突显了使用细菌追踪进行机制研究以严格评估这些关系的必要性。总体而言，我们的发现突显了肿瘤内细菌元素、脑TME和远端微生物群之间的复杂相互作用。
这项研究的主要局限性主要来自临床环境和分析的相关性质以及相对于队列异质性的适中样本量，阻碍了我们全面评估肿瘤内细菌信号的生物学和临床意义的能力。从这项研究中获得的见解可以指导未来的研究，以解决该领域的重要空白，例如确定将16S信号转移到脑肿瘤的机制、它们在塑造TME中的因果作用以及它们对脑肿瘤进展的影响。最后，微生物群组成可能受到地理、环境和生活方式因素的严重影响。因此，辨别与脑肿瘤(无论是肿瘤内还是远端)相关的细菌分类群的普遍性，以及它们个体和集体的临床影响，将需要在不同人群和地理区域进行标准化的多机构调查。我们倡导该领域的合作努力以实现这些目标。
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