外泌体是大小如病毒的膜泡(50至150纳米)[1]，不仅由肿瘤细胞，而且由多种其他细胞类型(免疫细胞、结缔组织细胞、血小板)大量产生并释放到血液中。它们运输脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和蛋白质片段，这些物质对其起源细胞具有特异性[1–3]。通过外泌体转运蛋白质和核酸，细胞可以相互交流。因此，外泌体在生理和病理过程中的细胞间信号级联中发挥重要作用[1]。健康人和患病者的多种不同体液中都存在外泌体，包括血清/血浆[3]、尿液[4]、腹水[5]和唾液[6]。由于具有双层脂质结构，外泌体非常稳定且易于储存。在4°C的冷藏温度下，它们可以完好无损地保存长达96小时。在-80°C的储存条件下，它们可以保存数年[7]。这些特性使外泌体成为诊断和监测胃肠道肿瘤或其他慢性疾病的非侵入性或最小侵入性生物标志物。
外泌体在肿瘤生物学中的作用
外泌体的生物发生发生在细胞内的内体中。在此过程中，微小RNA和信使RNA分子、蛋白质和DNA片段被纳入外泌体。随后，外泌体在多泡内体中被运输到细胞膜，并分泌到细胞外间质或血管中。在这里，外泌体可以被其他细胞吸收。它们的核酸和蛋白质内容物也被转移到接收细胞中。因此，肿瘤细胞可以通过外泌体将致癌特性转移到其他细胞。
Demory-Beckler及其同事通过研究证明，突变的KRAS蛋白可以通过外泌体传递。这导致没有突变的接收细胞显著增加增殖[8]。Melo等人将非肿瘤性上皮乳腺细胞与来自乳腺癌细胞系的外泌体共同培养。结果，处理过的乳腺细胞形成了肿瘤，而在未处理的对照组中则没有观察到肿瘤生长[2]。肿瘤外泌体在前转移生态位的形成中也起着重要作用。Peinado及其同事在研究中表明，黑色素瘤细胞的外泌体将c-MET受体传递给骨髓干细胞。这导致这些骨髓细胞动员并流入肺部。在这里，骨髓细胞改变了局部细胞微环境，结果是肺部黑色素瘤转移数量增加[9]。
在另一项研究中，可以证明胰腺癌细胞的外泌体被肝脏中的巨噬细胞吸收。这导致巨噬细胞中TGF-β的分泌。这反过来又导致纤维连接蛋白在肝脏中大量沉积，促进了肝脏转移[10]。可以总结指出，外泌体通过核酸和蛋白质的细胞间转运和转移在肿瘤进展和扩散中起着重要作用。肿瘤特异性外泌体的识别和表征可以利用这一点，将其作为血清和其他体液中的非侵入性生物标志物使用。
肿瘤外泌体的诊断和治疗价值
外泌体几乎可以在所有体液中检测到。它们非常稳定，只需少量血液即可测量其在血清中的含量和分子生物学特征。与循环肿瘤细胞等其他肿瘤标志物相比，这是一个显著优势。后者的检测非常困难，需要从供体采集更多血液。这些特性是将肿瘤特异性外泌体用作非侵入性生物标志物的重要前提[1]。
外泌体具有各种特征性的细胞外和细胞内蛋白质，这些蛋白质独立于细胞来源。此外，血清或其他体液中的肿瘤特异性外泌体通过其他表面蛋白与非肿瘤外泌体区分开来。例如，在卵巢癌患者的血清中可以观察到EpCAM阳性外泌体的增加。在胃癌或乳腺癌患者的血清中，可以检测到携带"表皮生长因子受体(EGFR)"家族膜蛋白的外泌体[11]。胰腺癌的外泌体特征是EGFR和EpCAM的过表达[12, 13]。此外，外泌体还可用于非侵入性地确定原发肿瘤的突变状态。Skog等人证明，在胶质母细胞瘤患者的血清外泌体上可以找到与原发肿瘤相同的突变EGFR受体[14]。由于受体状态对治疗非常重要，未来可能无需进行高度侵入性的开颅手术取样，而可采用这种最小侵入性技术。
通过其表面标记物，可以识别肿瘤特异性外泌体并将其用作高敏感性和高特异性诊断标志物。Madhavan及其同事研究了胰腺癌患者外泌体中的一组蛋白质和微小RNA[13]。他们能够以高敏感性(1.00，95%CI：0.95-1)和良好特异性(0.80，95%CI：0.67-0.90)区分肿瘤患者和健康人。在食管癌患者中，外泌体微小RNA的分析也可能发挥重要的诊断作用。Karen Chiam及其同事通过包含十个外泌体微小RNA的多生物标志物组合，几乎完美地将食管癌患者与健康供体或非发育不良Barrett食管患者区分开来(曲线下面积：0.99，95%CI：0.96-1.00)[15]。Gummireddy及其同事在肺癌患者研究中也展示了类似有希望的结果。通过测定血清中外泌体mRNA转录物AKAP4，他们能够以92.8%的敏感性和100%的特异性区分恶性肿瘤患者和良性肺部疾病患者[16]。然而，这些测试非常复杂，由于结合了多种蛋白质或多个(微)RNA，很容易出错。
GPC-1阳性外泌体：胰腺早期癌症非侵入性诊断的高敏感性血清标志物
在我们的一项研究中，我们首次证明外泌体含有双链基因组DNA片段。这些DNA与起源细胞几乎相同，只是存在线粒体DNA。此外，我们证明可以通过测序胰腺癌患者血清中外泌体DNA来检测KRAS和p53突变[3]。然而，我们在第一项研究中描述的方法有一个缺点，即外泌体只能非常非特异性地从血液中富集。通过超速离心获得外泌体时，除了肿瘤外泌体外，还富集了来自非肿瘤细胞(如免疫细胞或血小板)的外泌体。我们在后续研究中试图解决这个问题[17]。
为此，我们研究了是否存在肿瘤特异性表面标记物，可以有针对性地从恶性肿瘤患者的血清中富集肿瘤特异性外泌体。在此过程中，我们证明糖蛋白Glypican-1(GPC-1)特别富集在胰腺癌的肿瘤外泌体上。在两个独立的队列中，约有250名胰腺癌患者和140名对照供体，证明GPC-1阳性外泌体能够以100%的敏感性和特异性区分肿瘤患者与健康人或非恶性胰腺疾病患者(慢性胰腺炎和良性囊腺瘤)(图1)。
这甚至适用于原位癌(pTis)患者或处于非常早期肿瘤阶段(UICC I)的患者。此外，我们证明GPC-1阳性外泌体可能作为高敏感性疾病监测标志物。胰腺癌肿瘤切除仅七天后，30名患者中有29名显示血液中Glypican-1阳性外泌体显著下降。在同一队列中，肿瘤标准标志物CA 19-9仅在30名患者中的19名中显示下降。此外，单变量和多变量生存分析表明，GPC-1阳性外泌体显著下降的患者具有显著更长的总生存期。因此，GPC-1阳性外泌体也可能作为非侵入性预后标志物。例如，它们可用于患者风险分层，以提供个性化治疗。最后，我们在研究中证明，可以通过表面蛋白GPC-1富集肿瘤特异性外泌体。这些可以通过特殊程序(FACS分选)纯化，用于进一步的分子生物学研究。例如，我们在当前研究中表明，可以从GPC-1阳性外泌体中分离出RNA，从而推断原发肿瘤的KRAS突变状态(图1)。
![图1：GPC-1阳性外泌体可能应用的示意图。在胰腺癌患者(上排)的血清中可以检测到GPC-1阳性外泌体。这些可用于进一步的分子生物学分析，例如通过非侵入性血液检测确定原发癌的突变状态。良性胰腺疾病患者(下排)血液中没有GPC-1阳性外泌体。他们最初不需要进一步的肿瘤学程序。]
结论
我们和其他研究小组已经证明，通过分子生物学表征外泌体可以显著提高非侵入性血清肿瘤标志物的诊断精确度。特别是糖蛋白GPC-1在胰腺癌患者中似乎具有高度特异性和高敏感性。因此，未来GPC-1负载的外泌体可能在胰腺癌早期检测中发挥作用。如果我们的结果在纳入前瞻性队列的进一步多中心研究中得到证实，GPC-1阳性外泌体可能改善胰腺癌的预后。胰腺癌或其前体越早被发现，通过手术完全切除整个肿瘤的可能性就越高。这可以显著提高治愈机会，而对于目前95%的患者在初次诊断后五年内死亡的疾病来说，这是极其重要的。
参考文献
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