肿瘤特异性外泌体
用于胃肠道癌症早期检测的高灵敏度诊断标记物
外泌体是大小类似病毒的膜泡结构（50至150纳米）[1]。它们由肿瘤细胞以及许多其他细胞类型（免疫细胞、结缔组织细胞、血小板）大量产生并释放到血液中。外泌体运输源自其起源细胞的脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）和蛋白质片段[1-3]。通过外泌体介导的蛋白质和核酸转移，细胞之间可以相互通讯。因此，外泌体在生理和病理过程中的细胞间信号级联中发挥着重要作用[1]。外泌体既存在于健康人体内，也存在于患病人体内，可在多种不同的体液中发现，包括血清/血浆[3]、尿液[4]、腹水[5]和唾液[6]。由于具有双层脂质结构，外泌体非常稳定且易于保存。在4°C的冷藏温度下，它们可以完好保存长达96小时；在-80°C的条件下，可以保存数年[7]。这些特性使外泌体成为癌症或其他胃肠道慢性疾病诊断和病程监测的非侵入性或微侵入性生物标记物。
肿瘤生物学中的外泌体
外泌体的生物发生过程在细胞内体中进行。在此过程中，微RNA和mRNA分子、蛋白质和DNA片段被摄入外泌体。随后，外泌体在多囊泡内体中被运输到细胞膜，并分泌到细胞外间质或血管中。在这里，外泌体可以被其他细胞摄取。外泌体的内容物，包括核酸和蛋白质，也会转移到受体细胞中。因此，肿瘤细胞可以通过外泌体将致癌特性传递给其他细胞。
Demory-Beckler及其同事通过研究证明，外泌体可以传递突变的KRAS蛋白。这导致没有突变的受体细胞中增殖显著增加[8]。Melo等人将非肿瘤性上皮乳腺细胞与乳腺癌细胞系的外泌体一起孵育。结果，处理过的乳腺细胞形成了肿瘤，而在未经处理的对照组中则没有观察到肿瘤生长[2]。外泌体在前转移灶形成中也起着重要作用。Peinado及其同事在研究中表明，黑色素瘤细胞的外泌体将c-MET受体传递给骨髓干细胞。这导致这些骨髓细胞被动员并冲刷到肺部。在这里，骨髓细胞改变了局部的细胞微环境。结果是肺部黑色素瘤转移的数量增加[9]。
在另一项研究中，可以证明胰腺癌细胞的外泌体被肝脏中的巨噬细胞摄取。这导致巨噬细胞中TGF-β的分泌。这反过来又导致纤维连接蛋白在肝脏中的沉积增加，从而促进肝转移[10]。可以总结指出，外泌体通过细胞间运输和转移核酸和蛋白质在肿瘤进展和扩散中起着重要作用。肿瘤特异性外泌体的识别和表征可以被利用，作为从血清和其他体液中提取的非侵入性生物标记物。
肿瘤外泌体的诊断和治疗价值
外泌体几乎可以在所有体液中检测到。它们非常稳定，只需要几滴血液就可以测量其在血清中的含量和分子生物学特征。这与其它肿瘤标志物如循环癌细胞相比具有明显优势。循环癌细胞的检测非常困难，并且需要从供体采集更多的血液。这些特性是将肿瘤特异性外泌体用作非侵入性生物标记物的重要前提[1]。
外泌体具有各种细胞外和细胞内蛋白质特征，这些特征独立于细胞起源。此外，血清或其他体液中的肿瘤特异性外泌体还通过其他表面蛋白与非肿瘤外泌体区分开来。例如，在卵巢癌患者的血清中可以观察到EpCAM阳性外泌体的增加。在胃癌或乳腺癌患者的血清中，可以检测到携带"表皮生长因子受体(EGFR)"家族膜蛋白的外泌体增加[11]。胰腺癌的外泌体以EGFR和EpCAM的过表达为特征[12, 13]。此外，外泌体还可用于非侵入性地获取原发肿瘤的突变状态。Skog等人能够证明，在胶质母细胞瘤患者血清中的外泌体上可以找到与原发肿瘤相同的突变EGFR受体[14]。由于受体状态在治疗中非常重要，未来可能可以通过这种非常微侵入性的技术避免高度侵入性的开颅手术来确定样本。
通过其表面标记物，可以识别血清中的肿瘤特异性外泌体并将其用作高灵敏度和高特异性诊断标记物。在一项研究中，Madhavan及其同事研究了胰腺癌患者外泌体中蛋白质和microRNA的组合[13]。他们能够以高灵敏度(1.00, 95% CI: 0.95-1)和良好的特异性(0.80, 95% CI: 0.67-0.90)区分肿瘤患者和健康人。在外食管癌患者中，外泌体microRNA的分析也可能发挥重要的诊断作用。Karen Chiam及其同事能够借助由十个外泌体microRNA组成的多生物标记物组合，以近乎完美的灵敏度和特异性区分外食管癌患者与健康供体或非发育不良Barrett食管患者(AUC: 0.99, 95% CI: 0.96-1.00)[15]。Gummireddy及其同事在肺癌患者的研究中也展示了类似有希望的结果。通过测定血清中外泌体mRNA转录物AKAP4，他们能够以92.8%的灵敏度和100%的特异性区分恶性肿瘤患者与良性肺病患者[16]。然而，这些测试非常复杂，由于涉及多种蛋白质或多种(micro)RNA的组合，很容易出错。
GPC-1阳性外泌体是胰腺早期癌症非侵入性诊断的高灵敏度血清标记物
在我们的一项研究中，我们首次证明外泌体含有双链基因组DNA片段。这些DNA与起源细胞相同，除了存在线粒体DNA。此外，我们还表明，通过对外泌体DNA进行测序，可以从胰腺癌患者血清中检测KRAS和p53突变[3]。然而，我们在第一项研究中描述的方法有一个缺点，即外泌体从血液中富集的方式非常不特异。通过超速离心获得外泌体时，除了肿瘤外泌体外，还富集了来自非肿瘤细胞（如免疫细胞或血小板）的外泌体。我们在后续研究中试图解决这个问题[17]。为此，我们研究了是否存在肿瘤特异性表面标记物，可以利用这些标记物从恶性肿瘤患者的血清中特异性富集肿瘤特异性外泌体。我们能够证明糖蛋白Glypican-1 (GPC-1)特别富集于胰腺癌的肿瘤外泌体上。在两个独立队列中，约有250名胰腺癌患者和140名对照供体，证明GPC-1阳性外泌体可以100%的灵敏度和特异性区分肿瘤患者与健康人或患有非恶性胰腺疾病（慢性胰腺炎和良性囊腺瘤）的患者（图1）。
这甚至适用于原位癌(pTis)患者或处于非常早期肿瘤阶段(UICC I)的患者。此外，我们还表明GPC-1阳性外泌体可能作为高灵敏度的病程标记物。胰腺癌切除术后仅七天，30名患者中有29名血液中Glypican-1阳性外泌体显著下降。在同一队列中，肿瘤标准标记物CA 19-9仅在30名患者中的19名中显示下降。此外，单变量和多变量生存分析显示，GPC-1阳性外泌体显著下降的患者总生存期显著延长。因此，GPC-1阳性外泌体也可能作为非侵入性预后标记物。例如，它们可用于患者的风险分层，以提供个性化治疗。最后，我们在研究中证明，可以通过表面蛋白GPC-1富集肿瘤特异性外泌体。这些外泌体可以通过特殊程序(FACS分选)进行纯化，以便用于进一步的分子生物学研究。例如，我们在当前研究中表明，可以从GPC-1阳性外泌体中分离RNA，这些RNA可以推断原发肿瘤的KRAS突变状态（图1）。
图1: GPC-1阳性外泌体可能应用的示意图。在胰腺癌患者（上排）的血清中可以检测到GPC-1阳性外泌体。这些可用于进一步的分子生物学分析，以确定原发癌的突变状态，通过非侵入性血液测试。患有良性胰腺疾病的患者（下排）血液中没有GPC-1阳性外泌体。他们最初不需要进一步的肿瘤学程序。
结论
我们和其他研究团队已经表明，通过分子生物学表征外泌体，可以显著提高非侵入性血清肿瘤标记物的诊断精确度。特别是糖蛋白GPC-1在胰腺癌患者中似乎具有高特异性和高灵敏度。因此，未来GPC-1载荷的外泌体可能在胰腺癌的早期检测中发挥作用。如果我们的结果在进一步的多中心研究中，包括前瞻性队列得到证实，GPC-1阳性外泌体可能会改善胰腺癌的预后。越早发现胰腺癌或其前体病变，就越有可能通过手术完全切除整个肿瘤。这可以显著提高治愈机会，而目前95%的患者在初次诊断后五年内死于这种疾病。
参考文献
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克里斯托夫·卡勒特/努赫·N·拉巴里/克里斯托夫·莱斯费尔德/尤尔根·魏茨。肿瘤特异性外泌体：用于胃肠道癌症早期检测的高灵敏度诊断标记物，2015年11月，5(11)：文章02_05。
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