最大的突破可能源于最微小的细节。在癌症治疗领域，正是这些细节决定了抗癌药物是否可耐受，还是会引发毒性副作用。
正因如此，基础科学发现对于识别潜在的治疗靶点至关重要，这些靶点有朝一日可能带来更有效、更安全的癌症治疗方法。
斯坦福癌症研究所(Stanford Cancer Institute)成员卡克佩尔·罗加拉(Kacper Rogala)博士，结构生物学和化学与系统生物学助理教授，专注于研究科学家们在未来药物开发中可以探索的蛋白质机制。他是最近发表在《科学》(Science)杂志上的一项研究的主要研究者，该研究揭示了一种与癌症相关的蛋白质的独特信号机制，这可能为科学家提供一种新的方法来阻止癌细胞生长。
该研究获得了斯坦福癌症研究所创新奖(Stanford Cancer Institute Innovation Awards)的资助。罗加拉表示："创新奖对于启动这项研究线至关重要。它使我们能够定义潜在机制，并开始探索其用于治疗开发的潜力。这项工作正在进行中，并继续从该奖项提供的初始种子资金中发展。"
mTOR的选择性难题
罗加拉的实验室研究一种名为mTOR的大型关键蛋白质，它是细胞生长的中央调节器。mTOR信号通路的失调可导致不受控制的细胞增殖，而mTOR与多种疾病相关，包括癌症和糖尿病。mTOR作为开关，通过与较小的底物蛋白质结合并给它们加上磷酸基团（这一过程称为磷酸化）来调节它们的活性。mTOR通过读取它们的表位(epitopes)来识别其目标底物，表位是短的氨基酸序列，作用类似于分子条形码。虽然表位通常有10个或更少的氨基酸，但mTOR识别的表位只有两三个氨基酸，这是一个在蛋白质中更频繁出现的较短序列。原则上，这表明mTOR可以靶向数以万计的蛋白质。然而，研究人员只确定了不到100个具有强有力实验证据的底物，这引发了关于是什么驱动其选择性的问题。
罗加拉说："mTOR引人注目的是，从技术上讲，它是一种持续活跃的激酶，几乎可以磷酸化任何目标蛋白质，只要它能与之结合。如果细胞中有数以万计的独特蛋白质，那么mTOR识别的非常短的表位序列本身不足以解释其高选择性。"
伴侣蛋白是拼图的一部分
伴侣蛋白与mTOR结合形成mTOR复合物1(mTORC1)或mTOR复合物2(mTORC2)，它们在结构和功能上是不同的。每个复合物都有自己的伴侣蛋白组和偏好的底物。研究人员长期以来一直怀疑伴侣蛋白是mTOR选择性的关键决定因素，而两个复合物之间底物的交叉靶向是最小的。
"mTOR本身可以靶向许多蛋白质，所以大问题是细胞如何保持它的专注。我们发现mTORC1和mTORC2中的伴侣蛋白以惊人的精确度帮助引导mTOR朝向不同的目标，"罗加拉说。
研究团队纯化并测试了mTORC1和mTORC2，发现它们磷酸化目标底物的效率相差超过100倍。罗加拉解释说，这种效率差距表明伴侣蛋白是mTOR选择性的来源，但他们仍然缺乏伴侣蛋白用来招募底物的机制。
"这告诉我们，mTOR特异性的真正来源编码在伴侣蛋白中，但我们仍然不知道它是如何工作的。我想定义精确的分子规则，让mTOR能够识别一个目标而不是另一个。我们专注于mTORC2，因为其机制仍未被充分定义，了解它们可以揭示它与mTORC1的区别。"
带电蛋白质促进相互作用
罗加拉和他的团队利用结构生物学方法发现，蛋白质之间的静电作用力对mTOR的选择性靶向至关重要。具体来说，他的团队研究了mTORC2伴侣蛋白mSin1与其目标蛋白Akt之间的相互作用，Akt调节细胞生长、存活和代谢，并在包括乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌在内的几种癌症中失调。
为了清晰地观察mSin1和Akt之间的相互作用，他们使用了冷冻电子显微镜(cryo-EM)，这是一种将数百万蛋白质分子在一层玻璃状冰中快速冷冻并捕捉高分辨率图像以构建详细三维蛋白质结构的技术。
早期实验具有挑战性，因为Akt与mTORC2结合的时间不够长，无法被清晰成像。为了解决这个问题，罗加拉的团队与斯坦福癌症研究所癌症药物发现副所长纳撒内尔·格雷(Nathanel Gray)博士和哈佛大学激酶专家菲利普·科尔(Philip Cole)博士合作。他们通过将Akt与mTOR抑制剂连接来设计一种改良版Akt，从而加强Akt与mTORC2之间的相互作用，使整个复合物能够被更清晰地成像。
罗加拉说："我们的显微镜努力一直未能成功，但与合作者合作，我们开发了一个改良版Akt，使整个蛋白质复合物稳定了足够长的时间，让我们能够捕捉其三维结构。这是使这个项目成为可能的关键，否则就不会发生。"
相互作用的三维图像揭示了mTORC2识别Akt的两步模型。首先，研究团队发现mSin1有一个强负电表面，与Akt的带正电区域相互作用。
罗加拉说："它们之间有这种难以置信的电荷互补性。这是一个我们没有预料到的意外发现。我们想，如果这是Akt的工作原理，那么也许我们也可以解释mTORC2磷酸化所有其他目标的规则手册。"
一旦被招募，mTORC2将Akt固定在远离其催化位点的位置，磷酸化在那里发生。这种定位使Akt的灵活尾部（包含短表位）能够摆入mTORC2的催化位点并接收化学标签。罗加拉解释说，这些发现表明，Akt识别是由于两个特征：其灵活的尾部和与mTORC2伴侣蛋白相互作用的带正电表面区域。
mTORC2实验室的Life Science Alliance Bridging Excellence博士后研究员、该研究的第一作者之一马克斯米利安·拉尼克(Maximilian Wranik)博士说："这个两步过程有助于解释mTORC2如何既具有选择性又可靠。它展示了mTORC2如何首先捕获正确的蛋白质，然后确保磷酸化发生在该蛋白质内的正确位置。"
重要的是，研究团队发现这种识别策略不仅限于Akt，还反映了mTORC2识别其底物的更广泛机制。他们的发现表明，静电吸引有助于在mTOR读取其磷酸化的短表位序列之前招募这些蛋白质。
罗加拉说："我们提出的机制是，你有来自伴侣蛋白的这种静电吸引力，它只招募有限数量的底物。现在，因为mTORC2从远离其催化核心的地方抓住其目标，只有具有长而灵活尾部的底物（如Akt）才能穿越这段距离并将它们的表位呈现给mTOR进行磷酸化。这是一个两步过程而不是单步过程，这提供了更高的选择性。"
治疗应用
研究人员先前尝试抑制mTOR导致了毒性，因为它对健康细胞的存活至关重要。通过更好地了解mTOR如何与目标底物相互作用，研究人员最终可能能够设计出只针对功能失调的相互作用而不是关闭整个蛋白质的药物。
拉尼克说："我们的工作为更精确地思考药物设计提供了一个结构蓝图。未来策略可能不是广泛靶向mTOR，而是专注于阻断将Akt带到mTORC2的精确接触点，或破坏将Akt定位用于磷酸化的夹钳状抓握。这为跨癌症信号传导的未来工作提供了路线图，其中了解酶-靶标对如何精确找到彼此可以揭示治疗的新选择。"
未来的药物开发研究可能包括阻断特定mTOR-底物相互作用的抑制剂，或破坏帮助某些目标到达mTORC2的招募步骤。该研究还表明，这些事件依赖于细胞膜表面蛋白质的有组织组装，而不是细胞内的随机相遇。
"希望是，通过更详细地了解mTOR如何与其伴侣蛋白质相互作用，我们开始看到治疗开发的新机会。"
罗加拉说："我们已经揭示了mTOR信号逻辑的一个重要部分，但仍然有许多未解答的问题。mTOR失调涉及几种癌症和其他疾病。希望是，通过更详细地了解mTOR如何与其伴侣蛋白质相互作用，我们开始看到治疗开发的新机会。"
斯坦福博士生凯伦·林德-加雷利(Karen Linde-Garelli)和米歇尔·李(Michelle Lee)是该研究的合著者。这项工作还包括来自哈佛大学、加州大学旧金山分校、匹兹堡大学、俄亥俄州立大学、怀特黑德研究所、布朗大学和洛克菲勒大学的研究人员的贡献。
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