多巴胺信号传导和神经炎症在年龄相关认知功能障碍中的作用 - 认知障碍

摘要

目的：年龄相关认知衰退是日益增长的公共卫生问题，但早期分子指标仍定义不清。由于大脑变化通常先于行为症状出现，识别早期脆弱性指标至关重要。本研究探究多巴胺调节、突触或炎症信号是否可能在行为损伤前提供认知衰退早期指标。

方法与发现：对6个月（年轻）和12个月（年龄无认知障碍）的雌性胡德-利斯特大鼠进行新物体识别（NOR）任务测试，两组均未观察到认知缺陷。生化分析显示，年龄无认知障碍大鼠的前额叶皮层（PFC）存在显著分子差异。突触蛋白BDNF、PSD-95和突触素显著减少，表明突触不稳定。同时，多巴胺降解和重摄取关键调节因子COMT和NET表达增加，暗示多巴胺能信号减弱。炎症信号也发生变化：PFC中Nfkb和Socs3在转录水平上调，而Il-6和Cox2保持稳定。相比之下，海马体对这些变化相对耐受，大多数指标无显著变化，尽管mRNA水平检测到NF-κB激活，表明存在转录后调控。

结论：研究结果表明，PFC在中年阶段经历一个潜伏脆弱期，其特征是突触和多巴胺能失调伴随低度炎症，尽管认知表现仍保持完好。海马体在此阶段表现更坚韧。这些早期分子变化可能预示未来认知衰退，为预防干预提供关键窗口期。针对老化大脑中的这些早期变化可能对延缓认知损伤具有变革性潜力。

1 引言

老龄化与体内和中枢神经系统（CNS）中累积的多种变化相关，这增加了患心血管疾病、动脉粥样硬化、糖尿病以及阿尔茨海默病、痴呆和帕金森病等多种神经退行性疾病的风险（Gallizioli等，2023）。即使没有这些疾病，健康老龄化也常伴随认知能力下降，其严重程度因人而异，通常从中年开始显现（Gallagher等，2011；Hughes等，2018；Wyss等，2000）。这种逐渐下降被认为源于大脑中年龄相关的结构和功能变化，这些变化通常先于可察觉的认知缺陷（Beason-Held等，2013；Resnick等，2003）。这些累积变化共同导致认知表现恶化，通常影响记忆、处理速度和执行功能（Fjell和Walhovd，2010）。

研究表明，年龄增长会导致神经退行性变化，从而降低认知能力，尤其影响学习和记忆（Nicholson等，2004）。情景记忆尤其脆弱，因为这与海马体、周围围嗅皮层和内嗅皮层以及前额叶皮层（PFC）的功能障碍有关（Allen和Fortin，2013）。与年龄相关的结构变化已特别与老年人认知、行为和运动表现下降相关。例如，海马体齿状回中突触可塑性失调和神经发生减少与情景记忆缺陷有关（Singhal等，2020）。类似地，PFC第3层灰质减少和细棘丧失与执行功能下降相关（Burke和Barnes，2006；Morrison和Baxter，2012；Nyberg，2017）。有趣的是，老龄化中观察到的神经退行性变化与精神分裂症有相似之处，后者被假设为可能的加速老化综合征（Anthes，2014；Kirkpatrick等，2008；Schnack等，2016）。该理论得到这两种疾病共享风险因素的支持，如心血管异常和死亡率增加风险（Kirkpatrick等，2008；Nguyen等，2018）。

情景记忆的重要组成部分是识别记忆，其定义为识别先前遇到的事件、物体或人的能力（Myskiw等，2008）。新物体识别（NOR）任务是啮齿动物中常用的评估识别记忆的行为测试。支持物体识别记忆的神经基质取决于任务参数，特别是试验间间隔（ITI）的长度。电生理、病变和神经影像学研究表明，围嗅皮层在短ITI后对识别记忆起关键作用，而海马体参与则在较长延迟（>15分钟）后更为显著（Brown和Aggleton，2001；Clark等，2002；Hannesson等，2004）。然而，越来越多的证据表明PFC也对识别记忆过程有贡献，包括编码和评估刺激熟悉度（Xiang和Brown，2004）。

多巴胺是一种关键的神经调节剂，参与认知、动机和奖励处理，与年龄相关的多巴胺能信号下降已有充分记载，尤其是在PFC中（Goldman-Rakic和Brown，1981；Papenberg等，2025）。多巴胺的老化假说源于证据，显示在健康老化过程中多巴胺受体可用性和多巴胺代谢发生变化，这些变化与认知衰退密切相关（Andersen等，2000；Naneix等，2012）。多巴胺受体在中枢神经系统中广泛存在，分为两类：D1样受体家族（包括D1和D5受体）以及D2样受体家族（包括D2、D3和D4受体）（Spano等，1978）。我们先前的研究表明，多巴胺D1激动剂可改善认知功能障碍的药理学模型（McLean等，2009），健康年轻动物在NOR任务保留试验中表现出PFC多巴胺水平增加，支持最佳认知表现（McLean等，2017）。然而，随着年龄增长，多巴胺受体密度和结合潜力在包括人类和非人灵长类在内的多个物种中下降，表明老化PFC中细胞外多巴胺可用性降低（Bäckman等，2000；Johansson等，2023；Papenberg等，2025）。这在中年动物中的情况尚不明确。虽然多巴胺合成能力似乎保持相对稳定（Karrer等，2017），但随年龄增长的儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）活性增加可能有助于降低多巴胺水平（Tunbridge等，2007）。确实，药理学抑制COMT已被证明可增强啮齿动物和人类的皮层处理（Apud等，2006；Laatikainen等，2013；Tunbridge，2004），支持其在维持老化大脑多巴胺能信号中的作用。

有趣的是，多巴胺已被证明具有免疫调节特性（Levite，2016），其受体在自然杀伤细胞、小胶质细胞和淋巴细胞表面表达，这些是免疫反应的关键介体（Sarkar等，2010）。多巴胺可以以浓度依赖方式改变肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）等促炎细胞因子的表达（Gaskill等，2012；Morimoto等，2022；Nolan等，2019）。越来越多证据支持多巴胺在神经炎症中的作用（Liu和Ding，2019；Ma和Ou，2023；Wang等，2018；Yan等，2015），在外周组织中也观察到类似效果（Cao等，2020；Liu等，2021）。虽然多巴胺能系统的年龄相关衰退在人类和动物中已有充分记载，但尚不清楚这种自然衰退是否与中枢和外周免疫系统的协调变化同时发生。此外，针对突触完整性和多巴胺能信号变化的年龄相关标志物，以及它们对认知衰退的整体预测价值，研究明显不足。

多巴胺能信号与炎症的关联提出了关键问题：这些过程如何在老化和认知衰退背景下相互作用？慢性炎症与心血管疾病和2型糖尿病等年龄相关疾病密切相关（Libby，2002；Soysal等，2016；Tsalamandris等，2019），更近来与认知衰退相关（Leonardo和Fregni，2023）。在健康老年人中，促炎标记物如IL-1β、IL-6和TNF-α始终上调，这种现象称为"炎症老化"（inflammaging）（Franceschi和Campisi，2014）。这种慢性炎症状态与认知表现下降相关，特别是在涉及执行功能的任务中（Bradburn等，2017；Kálmán等，2009；Kim等，2017；Mooijaart等，2013；Singh和Newman，2011；Tegeler等，2016；Trollor等，2012；Weaver等，2002）和记忆任务中（Serre-Miranda等，2020）。诱发慢性炎症信号的动物模型提供了有力证据，表明这种状态不仅加速老化过程，还加剧年龄相关病理和认知损伤（Neves和Sousa-Victor，2019；Jurk等，2014；Bernal等，2014；Franceschi等，2017；Buchanan等，2008），特别是记忆（Czerniawski等，2015；Hovens等，2014；Laurent等，2017；Michels等，2015；Reis等，2017；Wang等，2018）。

慢性炎症如何影响认知已被探讨；一种可能的机制是通过促炎细胞因子，这些细胞因子已显示影响脑源性神经营养因子/神经生长因子（BDNF/NGF）等神经营养因子，后者在记忆巩固中具有已知作用，并在海马CA1和CA3区域随着老化而减少（Chapman等，2012；Cortese等，2011；Richwine等，2008）。炎症也降低了poly I:C处理后年轻大鼠PFC中的BDNF（Gibney等，2013；Guan和Fang，2006），这可能促成了大鼠和小鼠从中年开始神经发生减少的情况（Solano Fonseca等，2016）。

虽然已知人类大脑变化先于认知缺陷出现（Beason-Held等，2013；Resnick等，2003），但早期认知衰退的具体分子指标仍不明确。为解决这一问题，我们在动物模型中调查了行为变化前可能的早期分子变化。我们假设PFC或海马体中多巴胺受体表达和多巴胺代谢以及炎症标记物的变化先于行为变化。突触标记物（如突触素、突触后密度蛋白95（PSD-95）和BDNF）的表达可能取决于这些早期分子变化。为验证这一假设，我们使用NOR任务检查了6个月（年轻）和12个月（年龄无认知障碍，AUI）雌性胡德-利斯特大鼠的认知能力，随后对PFC和海马体组织进行死后生化分析。

2 方法

2.1 实验动物和伦理

从英国查尔斯河公司（体重范围120-140克）获取20只雌性胡德-利斯特大鼠（5-6周龄），并在布拉德福德大学动物设施中维持标准饲养条件。当大鼠分别为6个月（称为年轻组）或12个月（称为AUI组）时进行行为测试。大鼠在III型大鼠笼（Arrowmight，英国赫里福德）中以4只为一组饲养，笼内铺设软木屑垫料（Datesand，英国曼彻斯特），提供碎纸条（Sizzle Nest，Datesand，曼彻斯特）和红色塑料隧道作为丰富环境。饲养条件维持在21°C±5°C温度、50%±5%湿度和12:12小时明暗周期，平均光照强度为150勒克斯。提供过滤自来水和标准颗粒饲料（Teklad 2018全球18%蛋白质啮齿动物饮食，Envigo，英国莱斯特）自由取食。所有动物实验均按照英国《1986年动物（科学程序）法》进行，并经布拉德福德大学动物福利伦理审查委员会批准（英国内政部项目许可证号：P6D8A22DC）。

2.2 行为测试

在雌性年轻和AUI大鼠（n=10/组）中进行NOR测试。所有行为测试在光照周期的前半段进行。测试场位于实验室内标准环境照明下，未施加额外照明。测试场位置已调整，避免测试区域内产生阴影。本研究使用雌性大鼠，因为实验室证据表明雌性在NOR中表现优于雄性（Sutcliffe等，2007），且动情周期阶段不影响NOR或其他认知测试表现（McLean等，2009；Sutcliffe等，2007）。每组动物数量通过基于先前行为研究结果的统计功效计算确定（McLean等，2016；McLean等，2021；Yun等，2022）。NOR对每只个体大鼠单独进行，新物体位置随机分配。

大鼠在测试前连续三天在NOR场（52厘米宽×40厘米高×52厘米长）进行20分钟适应。测试日包括3分钟适应，将大鼠置于NOR场中，随后是3分钟获取试验，将两个相同物体放置在NOR箱对角，距侧壁至少6厘米。然后将大鼠移出，放回同伴笼中1分钟（试验间间隔，ITI）。清洁场后，重新将大鼠引入场中，进行3分钟保留试验，其中包含新物体和未使用过的熟悉物体（先前在获取试验中见过）。

所有实验均录像，用于后续行为分析。使用两个秒表手动记录每阶段中每只物体的探索时间（秒），并计算辨别指数：辨别指数（DI）=（探索新物体的时间[秒]-探索熟悉物体的时间）/探索两个物体的总时间。DI表示探索时间差异占保留试验中探索两个物体总时间的比例。通过计算大鼠在获取和保留试验中穿越的线条总数，量化运动活动。

2.3 蛋白质分析

行为测试后1-4天处死大鼠并取出大脑。分离的PFC和海马区用冷RIPA裂解缓冲液（Millipore，美国马萨诸塞州）匀浆，按说明添加PhosSTOP和cOmplete Mini、无EDTA蛋白酶抑制剂（Merck，德国达姆施塔特）以及0.5 M蔗糖溶液，使用Potter-Elvehjem匀浆器（右侧海马半球用于蛋白质分析，即未分离亚区域）。匀浆液在4°C下1000×g离心10分钟，上清液再于4°C下15,000×g离心30分钟。使用Bradford试剂（Sigma Aldrich，美国密苏里州）测定蛋白浓度，并使用FlexStation3微孔板读取仪（Molecular Devices）测量吸光度。

将等量蛋白（30-150μg/孔）与4×上样缓冲液（Novex，美国加利福尼亚州）混合，95°C加热5分钟。在12%-12.5%聚丙烯酰胺凝胶上以100 V进行SDS-PAGE，使用湿转法（Bio-Rad，美国加利福尼亚州）将蛋白质转移到硝酸纤维素膜（0.45μm；Amersham Pharmacia Biotech）。将膜在含5%脱脂奶粉的TBS-T（10 mM Tris-HCl [pH 7.2]，250 mM NaCl，0.05% Tween-20）中封闭，4°C过夜孵育以下一抗：突触素（1:10,000；Synaptic Systems，德国哥廷根）、PSD95（1:10,000；Sigma-Aldrich，哥廷根）和BDNF（1:10,000；Aviva Systems Biology，美国加利福尼亚州）。然后用TBS-T洗涤膜3次，1小时孵育适当的二抗。GAPDH（1:20,000；Proteintech，美国伊利诺伊州）用作PSD95和BDNF的上样对照，而α-微管蛋白（1:10,000；DSHBY，美国爱荷华州）用作突触素的上样对照，因为突触素分子量与GAPDH相似，若在同一膜上探测可能干扰条带分辨率和定量。这些看家蛋白用于条内标准化，控制上样变异。TBS-T再次洗涤膜3次后施加clarity ECL（Biorad，加利福尼亚州）。使用Bio-Rad ChemiDoc成像系统测量条带强度。BDNF、PSD-95和突触素分别在独立凝胶上分析，适当上样对照与目标蛋白在同一凝胶和膜上。每个条带代表来自单个动物（年轻或AUI）的蛋白。

PSD-95被检测为双条带，两者均包含在定量中。条带强度还归一化至每张膜上运行的年轻皮质组织混合匀浆，以实现不同凝胶间比较，提供一致的条间参考。为避免年龄相关的看家蛋白表达变异，该混合对照仅包含年轻组织。

2.4 RNA制备和表达

对于每只动物，始终将左侧半球用于RNA提取（右侧半球用于蛋白质分析）。该分配未进行交叉平衡。在每个实验中，PFC和海马体使用同侧半球以确保组织间一致性。样品在细胞裂解缓冲液（Millipore，马萨诸塞州）中匀浆，使用1.5毫米二氧化锆珠（Triple-Pure）和BeadBug微型管匀浆器。提取上清液，按照Aurum总RNA Mini试剂盒（Bio-Rad，加利福尼亚州）制造商方案进行RNA分离。使用Nanodrop Lite分光光度计（Thermo Fisher Scientific，英国）定量RNA浓度。随后，使用Applied Biosystems cDNA合成试剂盒（Thermofisher，立陶宛）将500 ng纯化RNA逆转录为cDNA。

使用iTaq Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad，加利福尼亚州）在T100热循环仪（Bio-Rad，加利福尼亚州）上通过qPCR量化基因表达水平。扩增程序包括50°C 2分钟、95°C 5分钟、95°C 10秒和60°C 30秒的40个循环。使用2−ΔΔCt方法计算相对基因表达水平，归一化至D-Box基因表达。引物序列（Sigma-Aldrich，德国达姆施塔特）如下：D1-正向：CTTCTGGAAGATGGCTCCTAAC，反向：CAGAGTCCATGCTACGCTAATC；D2-正向：CAACAATACAGACCAGAATCAG，反向：GGAGGACGATGTAGATTTTG；COMT-正向：TACAGGACAAAGTCACCATC，反向：CAAGAAAGACCATGTCTAGTG；MAO-B-正向：GTCAAGTGAGTGAGCGGATAAA，反向：CTCCAGGAAGGTGTTGGTAATG；NET-正向：TAAGAAGTCAGGTCCAGCACC，反向：AGTAGAGCAAGGAAGGCACC；COX-2-正向：TCTCCAACCTCTCCTACTACAC，反向：CTCCACCGATGACCTGATATTT；SOCS3-正向：TTCTTTACCACCGACGGAAC，反向：CAGCTGGGTCACTTTCTCATAG；IL-6-正向：CCGTTTCTACCTGGAGTTTGT，反向：GTTTGCCGAGTAGACCTCATAG。

2.5 ELISA

根据TransAM试剂盒（TransAM，加利福尼亚州）说明书制备全细胞提取物，并使用Bradford试剂（Sigma-Aldrich，加利福尼亚州）定量。简言之，将每孔5 μg样品添加到包被有NF-κB共识结合位点（5'-GGGACTTTCC-3'）的96孔板中。随后应用针对p65和p50的一抗，接着是HRP偶联的二抗。使用FlexStation 3测量吸光度。结果归一化至试剂盒提供的对照（Raji核提取物）。

2.6 统计

所有图表使用GraphPad Prism 9（GraphPad Software，美国）创建，所有统计分析均在该软件中进行。所有统计检验均为双尾，当p值<0.05时认为差异具有统计学意义。使用Shapiro-Wilk检验评估正态性，所有数据均符合正态分布假设。使用双样本t检验进行组间比较。对于每项比较，使用F检验评估方差齐性，若方差显著不同，则应用Welch校正。在所有情况下，统计显著性结果（显著或不显著）保持不变。数据表示为平均值±标准差。

3 结果

3.1 年轻和AUI大鼠识别记忆保持完好

为确认识别记忆无差异，对年轻（n=9）和AUI（n=10）组使用NOR测量短期记忆。年轻组中一只动物因未探索获取阶段任一物体（左或右）而被排除。两组在获取阶段均平等探索两个物体，对物体位置（左vs.右）无显著偏好（图1a；年轻：左vs.右t(8)=1.380，p=0.2050；AUI：左vs.右t(9)=0.4143，p=0.6884）。在保留阶段，两组均对新物体表现出偏好，探索时间显著长于熟悉物体（图1b；年轻：新vs.熟悉t(8)=2.342，p=0.0473；AUI：新vs.熟悉t(9)=3.219，p=0.0105）。AUI组辨别指数虽略有增加，但未达统计学显著（图1c；t(17)=1.553，p=0.1389）。在测试期间记录运动活动，以评估年龄对大鼠探索物体运动能力的影响。数据显示两组间无显著差异，表明年龄未影响运动活动（图1d；t(17)=0.4304，p=0.6723）。获取和保留阶段测试中总物体探索时间无观察到显著差异（未显示）。年轻和AUI大鼠NOR表现均无认知障碍迹象，表明识别记忆在12个月大时仍保持完好。

3.2 前额叶皮层和海马体中突触蛋白表达的年龄相关变化

接下来，我们研究了PFC和海马体中的突触密度分子标记物，建立与突触前（突触素）和突触后（PSD-95）完整性相关的蛋白质变化，并评估突触连接的整体健康状况。对这些脑区域中确定的突触密度指标进行了蛋白质印迹分析。在PFC中，AUI大鼠的BDNF、PSD-95和突触素水平较年轻大鼠显著降低（图2a；BDNF：t(11.52)=3.759，p=0.0029；PSD-95：t(18)=2.746，p=0.0133；突触素：t(18)=4.872，p<0.001）。相比之下，海马体显示不同模式：AUI大鼠BDNF水平显著升高（图2c；t(16)=2.722，p=0.0151），但PSD-95（t(16)=0.6393，p=0.5317）和突触素水平（t(16)=0.5481，p=0.5912）未见显著年龄相关差异。

3.3 老化脑区域中多巴胺能功能的分子标记物

为探究多巴胺系统中潜在的年龄相关变化，使用qPCR量化PFC和海马体中关键多巴胺通路基因的mRNA表达。选择这种分子方法是因为现有商业多巴胺受体D1和D2抗体特异性和可靠性有限（Bodei等，2009；Stojanovic等，2017）。在PFC中，检测Drd1、Drd2、Comt、Net和Mao-B的表达，而在海马体中检测Drd1、Drd2、Comt、Net和Dat。基因选择基于区域特异性表达模式：DAT在PFC中表达稀疏（Sesack等，1998），而DAT和NET是海马体中多巴胺清除的主要机制（Borgkvist等，2012）。

在PFC中，与年轻对照相比，AUI大鼠的Comt（t(10.54)=3.610，p=0.0044）和Net（t(12.02)=2.594，p=0.0234）mRNA水平显著升高，Drd1（t(18)=0.6066，p=0.5517）、Drd2（t(12.19)=0.2663，p=0.7945）和Mao-B（t(12.4)=1.428，p=0.1779）表达无显著差异（图3a）。在海马体中，Drd1（t(9.865)=1.686，p=0.1231）、Drd2（t(9.089)=1.588，p=0.1465）、Comt（t(17)=1.072，p=0.2989）、Net（t(17)=1.141，p=0.2697）和Dat（t(9.552)=1.866，p=0.0930）在年龄组间无显著差异（图3b）。

3.4 区域特异性炎症信号和NF-kB激活

鉴于炎症与老化之间确立的关联，我们接下来检查了PFC和海马体中关键促炎和抗炎标记物（Il-6、Nfkb、Cox2和Socs3）的mRNA表达。在PFC中，我们发现AUI大鼠的Nfkb（t(18)=2.757，p=0.0130）和Socs3（t(10.65)=2.246，p=0.0470）显著上调，提示炎症信号增强和负反馈机制调控失调。Il6（t(18)=2.065，p=0.0536）和Cox2（t(11.90)=0.006415，p=0.9950）表达在该区域无显著差异（图4a）。相比之下，海马体中所有炎症标记物均无差异表达（Il-6：t(17)=0.5266，p=0.6053；Cox2：t(10.39)=0.5795，p=0.5746；Socs3：t(17)=0.4139，p=0.6841；Nfkb：t(17)=0.3590，p=0.7240；图4b）。

鉴于海马体中Nfkb mRNA表达增加，而在海马体中未见相应转录变化，我们进一步探究海马体中NF-κB的年龄相关调控是否发生在转录因子激活水平而非基因表达水平。为此，我们对海马组织进行DNA结合测定，量化NF-κB信号，测量p56和p50亚基的核水平。有趣的是，AUI海马体中NF-κB结合活性显著升高（p65：t(16)=3.943，p=0.0012；p50：t(16)=5.172，p<0.0001），表明该通路激活增加，尽管mRNA表达水平稳定（图5）。

4 讨论

已知在人类中，大脑变化先于认知缺陷出现（Beason-Held等，2013；Resnick等，2003），但早期认知衰退的具体分子指标仍不明确。为解决这一问题，我们旨在揭示行为变化前的认知衰退早期分子指标。如假设所示，我们发现了AUI大鼠PFC和海马体中基因和蛋白质表达的区域特异性改变，同时NOR任务中无行为差异，表明其认知表现保持完好，与年轻动物相同。我们发现了多巴胺代谢、炎症标记物和突触蛋白的变化。重要的是，这些分子变化与可检测的行为缺陷共存不应被解释为功能障碍证据。相反，它们反映了年龄相关的分子改变，可能表示特定脑区域的早期分化或脆弱性，同时认知表现保持完好。这些结果突显了年龄相关脑变化的复杂性，并表明分子变化可能作为未来认知衰退的早期指标。

为识别早期分子指标，选择与年轻（18-35岁）和中年人类（36-55岁）认知功能相当的鼠龄非常重要（Sengupta，2013）。我们选择6个月（年轻）和12个月（AUI）大鼠是合适的，因为这些大鼠在认知和运动活动方面均无损伤。此年龄段选择得到先前研究的支持。通常，年轻大鼠（3-6个月）在NOR和空间物体识别等各种行为测试中无差异（Antunes和Biala，2012；Forbes等，2014）。大鼠通常在18-24个月被视为老年，相当于人类>56岁（Sengupta，2013）。我们的12个月组代表年轻和老年大鼠之间的中点，对应人类中年。此年龄选择与大鼠和人类年龄相关建立相关性一致，在成年期，大鼠一个月约相当于人类2.5-3年（Sengupta，2013）。行为数据证实，12个月大鼠识别记忆完好，未检测到认知缺陷。因此，我们称这些大鼠为AUI，强调此年龄无明显认知损伤。这一观察支持工作记忆和执行控制功能在老化过程中往往比识别记忆更早衰退的观点（Erixon-Lindroth等，2005）。重要的是，认知老化轨迹可能受可修改的生活方式风险因素和神经退行性过程影响。例如，我们先前已表明，暴露于高脂饮食（Yun等，2022）或脑室内可溶性淀粉样β寡聚体给药（Watremez等，2018）的大鼠在更年轻年龄即出现NOR损伤。在本研究中，通过选择未暴露于此类风险因素或神经退行性疾病模型的大鼠，我们确保观察到的分子变化反映正常老化过程而非病理条件。

为调查年龄相关认知衰退的分子相关性，我们检查了与PFC中突触结构和功能相关的蛋白质。分析显示AUI大鼠PFC中突触衰退，BDNF（神经营养因子）、PSD-95（突触后支架蛋白）和突触素（突触前囊泡蛋白）水平显著下调。BDNF的减少尤为重要，因为BDNF对维持突触强度、促进树突生长和通过TrkB受体激活支持可塑性至关重要（Lu和Chow，1999；Park和Poo，2013）。这种减少可能反映营养支持的丧失，可能构成前额叶依赖任务随年龄出现功能性衰退的基础（Bruijniks等，2020；Oh等，2016）。PSD-95消耗损害谷氨酸受体锚定和树突棘结构完整性，突触素损失暗示神经递质释放机制受损（Sheng和Kim，2011）。这种模式与人类蛋白质组学研究一致，表明突触相关蛋白水平降低与认知衰退相关，与淀粉样蛋白病理无关（Head等，2009）。重要的是，AUI大鼠在保留行为表现的同时表现出这些分子缺陷，提示突触蛋白下调可能代表认知障碍前的潜伏脆弱期。

在海马体中，我们观察到AUI大鼠BDNF水平显著升高，但突触素或PSD-95水平无变化。重要的是，在使用的实验条件下，我们的蛋白质印迹检测到27-37 kDa条带，与32 kDa前体BDNF（proBDNF）一致，而成熟14 kDa形式在两个脑区域均未检测到。这一观察与先前报告一致，即proBDNF在老年啮齿动物海马体中上调，尽管这些大鼠略老（Buhusi等，2017；Perovic等，2013）。虽然proBDNF可能支持某些形式的突触重塑或发育可塑性，但它与成熟BDNF相比具有不同的功能，有时甚至相反。具体而言，proBDNF通过p75NTR受体信号传导，可诱导与突触抑制、树突回缩或细胞凋亡相关的通路，而非成熟BDNF促进的强化和生长。因此，海马体BDNF的观察到增加可能反映年龄相关的BDNF处理或调控改变，而非功能补偿。这些发现表明，大脑区域对老化的分子反应可能不同。总体而言，这些区域特异性特征支持突触弹性和可塑性机制可能在老化过程中在PFC和海马体间存在差异的观点，可能对认知结果产生影响。

接下来，我们调查了多巴胺能信号的年龄相关变化。海马体中Drd1、Drd2、Comt、Net和Dat的表达水平无显著年龄相关变化。在PFC中，AUI大鼠的Comt和Net mRNA水平显著高于年轻对照，而Drd1、Drd2和Mao-B表达保持不变。这些发现表明多巴胺清除机制区域特异性、年龄相关变化，PFC中儿茶酚胺降解和儿茶酚胺转运酶表达增加。这种模式与转录组学研究一致，显示PFC基因表达与年龄高度相关，而海马体转录本在生命过程中保持稳定（Dönertaş等，2017；Zarrella和Tsurumi，2024）。虽然PFC中多巴胺释放增加支持年轻动物的认知表现（McLean等，2017），但老化特征是向更大儿茶酚胺分解的转变，如Comt和Net上调所示。这种转变并非矛盾，而是反映年龄相关的稳态适应，最终导致PFC中多巴胺能信号减弱。这种低多巴胺能状态是认知衰退的关键贡献因素，证据表明COMT活性影响整个生命周期的皮层功能（Apud等，2006；Tunbridge等，2007）。

Drd2受体mRNA维持可能有助于AUI大鼠识别记忆保存。先前研究表明，海马体Drd2表达和结合对调节长期增强和长期抑制至关重要，这两者对记忆均很重要（Nyberg等，2016；Rocchetti等，2015）。人类成像研究进一步支持海马体和尾状核中的Drd2结合通过功能连接与识别记忆表现相关（Bäckman等，2000；Nordin等，2021）。相比之下，Drd1受体丰度与在新环境中空间信息编码和工作记忆方面有关（Lima等，2022；Tran等，2008；Xing等，2010）。这些发现可能解释为何空间和工作记忆以及认知控制的缺陷往往先于识别记忆随年龄下降（Erixon-Lindroth等，2005；Johansson等，2023；Liggins，2009；Nyberg，2017）。

鉴于多巴胺能和炎症过程在老化脑中的已建立关联，我们接下来探究AUI大鼠PFC和海马体中与年龄相关的分子变化是否与关键炎症通路改变相关。在AUI大鼠PFC中，我们发现SOCS3和Nfkb mRNA显著上调，而Il-6和Cox2水平无变化。该模式与文献一致，因为SOCS3表达增加是JAK/STAT通路中细胞因子信号增强和负反馈调节的公认标志，通常是对细微或慢性炎症刺激的反应（Croker等，2008）。Nfkb上调进一步指向促炎转录谱变化，尽管IL-6等经典细胞因子无明显增加。NF-κB是一种转录因子，基础条件下支持突触功能和可塑性（Kaltschmidt等，2006），但当过度或慢性激活时，可转向促进炎症反应（Mao等，2025）。海马体中未检测到任何炎症标记物的显著变化。该海马体Nfkb未上调与高级老化中NF-κB信号增加报告形成对比（Porcher等，2021；Toliver-Kinsky等，1997）。为确定海马体中年龄相关调控是否发生在转录活性而非基因表达水平，我们在该区域评估NF-κB DNA结合活性。尽管Nfkb mRNA表达稳定，我们发现AUI海马体中NF-κB结合活性显著增加（p65：t(16)=3.943，p=0.0012；p50：t(16)=5.172，p<0.0001）。NF-κB亚基上调可能代表对年龄相关突触应激的代偿性、促生存反应（Maggirwar等，1998）。NF-κB是突触健康相关下游目标的关键调节剂，包括PSD-95和BDNF。有趣的是，pro-BDNF通过p75NTR相互作用可诱导NF-κB表达，建立神经营养因子和炎症信号之间的复杂反馈环（Li等，2023；Lima Giacobbo等，2019；Marini等，2004；Nociti和Romozzi，2023）。总体而言，这些发现突显了老化过程中的区域特异性差异，其中PFC中发生转录变化，而海马体中发生活性水平调控。

我们的数据表明，外周炎症标记物如Il-6和Cox2未显著变化，Socs3上调，这与急性神经炎症模型（如LPS）中经典细胞因子或氧化应激标记物显著改变的模型不同（Henry等，2009；Xie等，2003）。这并非表明无炎症参与，而是可能反映维持炎症信号的操作性或补偿机制。同时，Nfkb表达增加和NF-κB结合活性升高指征炎症相关信号激活，尽管这些发现基于基因表达和转录因子结合，无法直接推断下游蛋白活性或功能结果。类似地，BDNF表达改变提示突触可塑性相关信号和炎症稳态变化，但关于突触功能或脆弱性的结论在缺乏蛋白或受体水平分析情况下必然推测。重要的是，与急性神经炎症模型相比，我们的发现反映健康老化中典型的细微、慢性低度炎症。该模式与精神分裂症等神经精神疾病中观察到的前驱/高风险状态相似，其中早期PFC功能障碍先于临床症状和正式诊断（Michalczyk等，2023；Misiak等，2021；Mongan等，2020）。

总之，本研究强调PFC是正常老化中分子改变的关键早期位点，海马体中也观察到独特的分子谱，这些先于明显认知衰退。我们的发现强调将PFC作为未来研究早期分子神经脆弱性指标的价值。虽然此处识别的分子改变在死后脑组织中测量，但受影响通路（包括多巴胺调节、突触完整性和炎症信号）可在活体受试者中通过遗传、外周或基于成像方法间接评估。理解这些早期变化可能有助于指导可转化生物标志物开发，为及时干预策略提供信息，旨在减缓或预防年龄相关认知损伤，最终改善老年人群结果。