儿童和青少年新诊断免疫性血小板减少症的肠道微生物群模式 - 硒与微生态

背景：许多自身免疫疾病的病理生理学与肠道微生物群的变化有关。我们调查了新诊断免疫性血小板减少症（N-ITP）中微生物群的作用，以确定微生物群的变化及其对疾病进程的影响。

方法：招募了50名N-ITP患儿（患者组）和30名对照。通过实时PCR测量了第一周内治疗前粪便样本中的7种微生物群属。在入组时及随访1周、1个月和3个月后进行了出血评估工具和全血细胞计数（CBC）检测。

结果：超过70%的患者出现了早期缓解。三种菌株仅从N-ITP病例中分离出来，在对照组中未发现。相较于对照组，患者组中双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）的检出率较低，但在进展为持续性ITP（P-ITP）的患者中显著高于早期缓解的患者。相较于对照组，N-ITP组中Phascolarctobacterium和乳酸杆菌属（Lactobacillus）的检出率显著较高。相较于进展为P-ITP的患者，早期缓解患者的Phascolarctobacterium水平更高。Lachnospiraceae仅在表现出早期缓解的N-ITP患者中检出。两组均未检测到拟杆菌属（Bacteroides）。

结论：患有N-ITP的儿童的肠道微生物群表现出不同的模式，这种行为似乎影响了疾病的进程，并可能对未来ITP辅助治疗产生影响。

介绍：免疫性血小板减少症（ITP）是一种获得性的免疫介导性疾病，由外周血小板破坏增加和血小板生成受损引起。其定义为孤立性血小板减少症，即外周血血小板计数< 100 × 109/L，并且没有明显的基础病因。该病在儿科人群中的估计发病率为每年每10万人中有1.9至6.4例。儿童ITP通常较为温和，大多数患者在诊断后6至18个月内自发缓解。然而，20-30%的病例发展为慢性ITP。在埃及，Khalifa及其同事报告了一项在埃及进行的研究，结果显示慢性ITP病例的比例为30%，与国际上报道的比例相同。尽管在儿童中症状较轻，但儿童及父母常常关注生活质量及某些日常活动的变化，这凸显了疾病的重要性。根据从诊断开始所经过的时间，ITP被分类为新诊断、持续性和慢性。决定患有ITP的儿童是否接受医疗治疗或密切观察的因素不仅包括血小板计数，特别是出血症状、近期创伤史和孩子的生活方式。针对不同程度的出血，推荐使用各种治疗方法。这些治疗方法要么增加血小板的生产，要么阻止免疫介导的血小板破坏。基于对ITP病理生理学的更好理解，可能会提出新的治疗方案。虽然ITP的发病机制尚未完全明了，但ITP被认为是一种复杂的多因素免疫失调，其中主要机制是免疫耐受的丧失和血小板自身抗体的产生。此外，T细胞的免疫机制也被认为会导致ITP。这包括T细胞介导的细胞毒性和调节性T细胞（T-Regs）功能和/或数量的缺陷。肠道微生物群被认为在ITP的发病机制中起作用。它指的是一群自然生活在人类消化道中的微生物。它们包括出生后不久就定植于消化道的细菌、病毒和一些真核生物。每个人都有自己的微生物群分布和组成模式，这部分由宿主基因型和出生后立即发生的定植决定。许多因素决定了个体的微生物群模式，包括分娩方式、母乳喂养、生活方式、饮食、环境条件、抗生素使用和疫苗接种。

肠道微生物群包含超过1500个物种，由超过50个不同的门组成。人类中最主要的门是拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes），其次是变形菌门（Proteobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、柔膜菌门（Tenericutes）、放线菌门（Actinobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia），占总微生物群体的90%。肠道微生物群在人体免疫反应中发挥重要作用。它对于淋巴组织的发育和扩展，以及肠道免疫的维持和调节至关重要。共生微生物作为T细胞和自然杀伤细胞亚群的外部修饰因子。它们维持粘膜屏障的完整性。T细胞可以生成具有抗炎或促炎作用的亚群。脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）能够诱导CD4 + T细胞分化为调节性T细胞，促进抗炎细胞和转化生长因子β（TGF-β）的产生，从而中和Th（T辅助细胞）的促炎反应。另一方面，丝状菌群在接触抗原调节细胞后，似乎能够诱导促炎细胞如Th17。不同因素导致有益微生物的缺失和微生物多样性的减少，最终引发肠道菌群失调（微生物失衡或适应不良）。菌群失调可以改变免疫反应，从而促进促炎状态。这种改变可以引发或促进多种疾病的发生。许多自身免疫疾病与肠道微生物群扰动有关，包括类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、自身免疫性肝病、Graves病、皮肤相关自身免疫病理和炎症性肠病。ITP作为一种免疫介导的疾病，也与肠道微生物群的变化有关。Borody等人报告称，粪便微生物群移植成功逆转了ITP。先前关于ITP中肠道微生物群模式的研究结果不一致，与健康对照相比，ITP中变形菌门和拟杆菌门的比例显著增加，而厚壁菌门/拟杆菌门比例则较低；另一些研究显示，放线菌门和厚壁菌门/拟杆菌门比例降低，而相反的厚壁菌门/拟杆菌门比例则有所报道。此外，ITP患者的肠道微生物群和代谢组显示出代谢变化。Saki等人表明，特定的门和属在ITP患者中经历了最显著的变化。此外，他们还展示了ITP患者的各种肠道代谢物的变化，包括脂质、氨基酸和胆汁酸。据报道，血小板计数与肠道微生物群之间存在强烈的负相关关系，同样血小板计数与肠道代谢物之间也存在强烈的负相关关系。此外，膳食酵母通过改变肠道菌群的组成并在ITP个体中生成许多有利的细胞因子，在ITP中起着重要作用。

我们的目标是评估新诊断ITP（N-ITP）儿童的肠道微生物群变化，并确定其与疾病进程和出血评分的关系。据我们所知，这是第一个评估埃及儿童和青少年ITP中肠道微生物群的埃及研究。

方法论：

患者：这项前瞻性纵向病例对照研究在诊断后第一周内招募了符合美国血液学会（ASH）定义的ITP标准的儿童和青少年。符合条件的2至15岁儿童和青少年是在2023年4月至10月期间连续六个月从Ain Shams大学儿科血液肿瘤骨髓移植科招募的，在初始治疗方式之前。年龄和性别匹配的健康志愿者并非来自患者家庭。如果怀疑有家族性或遗传相关的ITP，或者在过去三个月内使用过抗生素，或者有急性或慢性胃肠道疾病、代谢综合征病史，或有肠手术或其他自身免疫疾病病史的患者和对照者都被排除在外。该研究在伦理委员会批准下进行，批准编号为FMASU MS/000017585。在纳入研究之前，从每位患者、对照者或其法定监护人处获得了知情同意书和同意声明。所有程序均按照机构研究委员会的道德标准以及2013年赫尔辛基宣言进行。

方法：在研究开始时，所有患者和对照者都使用ITP特异性出血评估工具（ITP-BAT）评估了不同的出血症状，该工具得到了国际ITP工作组的支持，用于进一步的临床研究。它包括三个主要领域：皮肤（S）、可见黏膜（M）和器官（O），包括严重程度分级（SMOG）。严重程度范围从0到3或4，任何致命出血都会给予5级评分。患者报告但无医疗记录的出血评分为1。所有参与者的粪便样本中特定七种微生物群的比例评估（如双歧杆菌属、拟杆菌属、Phascolarctobacterium、乳酸杆菌属、瘤胃球菌科（包括瘤胃球菌和其他细菌的细菌科）、Eubacterium coprostanoligeues和Lachnospiraceae）通过实时聚合酶链反应（PCR）完成。选择在我们研究中评估的微生物属是基于Yu及其同事之前的研究，该研究表明这些微生物属在健康对照和新诊断ITP之间存在显著比例差异，但研究对象为成年人。粪便标本收集后保存在+4°C冰箱的灭菌盖中，并在4小时内送至PCR实验室进行DNA提取。提取的基因组DNA量通过Nanodrop测量来确定DNA质量。用于检测双歧杆菌属、链球菌属和乳酸杆菌属的引物和探针基于从美国国家生物技术信息中心数据库检索的16S rRNA基因序列。对于实时PCR实验，DNA与Thermo Fisher公司的Power SYBR™ Green PCR Master Mix结合。

患者每隔两周定期随访，进行CBC和ITP-BAT检查，同时在研究开始后的1周、1个月和3个月收集数据。患者根据Provan及其同事2019年的国际共识报告接受治疗，当血小板计数>30×10^3/uL并无活动性出血时采用保守管理。类固醇疗法：短期疗程（7天或更短），每日剂量为2-4 mg/kg（最大剂量120 mg，持续5-7天）。静脉注射免疫球蛋白（IVIG）使用的剂量为1 g/kg，连续1或2天。艾曲波帕作为二线治疗在研究开始后超过1个月给予20%的患者，由于这些患者对一线治疗无反应。在三个月末，根据疾病进程将患者分为早期缓解组和持续性ITP（P-ITP）组。

图1：

患者组和对照组中参与者的Consort流程图

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样本量

50名患者和30名性别和年龄匹配的健康对照（HCs）的样本量足以达到研究目标，基于对人群中结果发生率的假设。样本量使用PASS 15程序计算，设定功效为90%，阿尔法误差为0.05，并根据Zhang及其同事的研究，预计ITP与HCs之间的拟杆菌门耗竭差异为20.21 ± 2.75% vs 39.49 ± 2.49%。

统计分析

数据收集、修订、编码并输入统计软件包IBM SPSS 27版。置信区间设为95%，可接受的误差范围设为5%。

结果

表1列出了患者的年龄、性别、出血特征和治疗数据。他们的中位年龄为6岁。在研究期末，38名患者（76%）处于缓解状态，而12名患者（24%）被视为持续性ITP（P-ITP）。P-ITP组的患者年龄显著高于早期缓解组，P-ITP组的中位年龄为11.5岁（8.5-12.5岁），而早期缓解组的中位年龄为5岁（3-8岁），在近亲结婚或出血评分方面无显著差异。所有患者（100%）均表现为皮肤出血，12名患者（24%）表现为粘膜出血，只有4名患者（8%）表现为器官出血。器官出血患者为12-14岁的青春期女性，表现为月经大量出血，导致血红蛋白下降，最低血红蛋白降至7 g/dl。表2显示了患者组在研究开始、1周、1个月和3个月（研究结束）时的实验室参数和出血评分。对照组和患者组在微生物属方面的比较如图2所示，Ruminococcaceae、Eubacterium coprostanoligenes 和 Lachnospiraceae 属仅在患者组中检测到，而在对照组中未检测到。双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）在对照组中的平均log计数较高（9.19 ± 0.11），相比之下患者组为（8.47 ± 0.15）（P < 0.001）。Phascolarctobacterium属在患者组中显著较高（9.03 ± 0.11），相比之下对照组为（8.94 ± 0.07），P值< 0.001。乳酸杆菌属（Lactobacillus）在患者组中也显著较高（9.49 ± 0.19），相比之下对照组为（8.11 ± 0.13），P值< 0.001。

表1 所有新诊断ITP（N-ITP）患者的年龄、性别、出血评分和治疗数据

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表2 N-ITP患者在研究开始、1周、1个月和3个月随访时的实验室参数和出血评分

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图2

对照组和患者组在微生物属（log计数）cfu/g方面的比较（研究开始时）

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接收者操作特征曲线（ROC）如图3所示，显示双歧杆菌属、Phascolarctobacterium 和乳酸杆菌属可以在≤8.71、>9.02 和 >8.34 的截断点区分患者组和对照组，灵敏度为100.0%，特异度为100.0%，AUC分别为1.000、0.719 和 1.000。在初次就诊时，比较显示早期缓解患者和那些发展为持续性ITP（P-ITP）患者的微生物群模式存在显著差异，如表3所示。双歧杆菌属在P-ITP组中的平均log计数（8.58 ± 0.09）显著高于早期缓解组（8.44 ± 0.15），p值为0.005。Phascolarctobacterium 在早期缓解组中的平均log计数（9.06 ± 0.11）显著高于P-ITP组（8.94 ± 0.06），p值为0.002。Eubacterium coprostanoligenes 在P-ITP组中的平均log计数（9.06 ± 0.1）也显著高于早期缓解组（8.81 ± 0.16），p值< 0.001。表4中的单变量逻辑回归分析显示，年龄>10岁、双歧杆菌属>8.5、Phascolarctobacterium<8.95 和 Eubacterium coprostanoligenes>8.96 与P-ITP患者显著相关。此外，多变量逻辑回归分析显示，与P-ITP患者最相关的因素是Eubacterium coprostanoligenes>8.96，OR（95%CI）为61.810（5.554–687.901），p值=0.001，其次是双歧杆菌属>8.5，OR（95% CI）为15.694（1.458–168.974），p值=0.023。

表3 新诊断ITP早期缓解与持续性ITP在研究期间结束时的初始微生物菌株（log 计数）cfu/g 比较

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表4 P-ITP患者相关因素的单变量和多变量逻辑回归分析

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图3

接收者操作特性曲线（ROC）曲线。它显示双歧杆菌属、Phascolarctobacterium 和乳酸杆菌属能够在≤8.71、>9.02 和 >8.34 的截断点区分患者组和对照组，灵敏度为100.0%，特异度为100.0%，AUC分别为1.000、0.719 和 1.000。

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所有研究患者的血小板计数在研究开始时与不同微生物属（双歧杆菌属r值=0.14，p值=0.34，Phascolarctobacterium r值=-0.23，p值=0.14，乳酸杆菌属r值=0.009，p值=0.953）无显著相关性。研究开始时，皮肤出血评分（S评分）和粘膜出血评分（M评分）与研究的微生物属之间无显著相关性，p值>0.05。器官出血表现（O评分）与研究的N-ITP患者中不同微生物属的关系如图4所示。乳酸杆菌属在O评分阳性患者中的水平[9.75 ± 0.11]显著高于O评分阴性患者[9.46 ± 0.17]，p值=0.002。Eubacterium coprostanoligenes 在O评分阳性患者中的水平[9.09 ± 0.07]也显著高于O评分阴性患者[8.85 ± 0.18]，p值=0.012。Lachnospiraceae 在O评分阳性患者中的水平[5.9 ± 0.01]也显著高于O评分阴性患者[5.63 ± 0.13]，p值=0.008。

图4

研究的N-ITP患者在研究开始时器官出血（O评分）与微生物属之间的关系

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讨论

肠道微生物群参与了宿主众多重要的生理功能，包括免疫系统的成熟。微生物群与免疫系统之间相互作用的任何不平衡都在许多免疫介导疾病的发生中发挥作用。最近的一项研究表明，肠道微生物群与ITP之间存在联系。

在这项研究中，我们在六个月内招募了50名年轻的N-ITP患者。在12周的期末，38名患者（76%）处于缓解状态，这是一个高缓解率，但由于随访时间短，部分患者在停止治疗后可能会再次出现血小板减少。只有12名（24%）患者呈持续性病程（P-ITP组）。6岁以下的年轻患者与12岁以上的儿童相比，但亲属婚配或出血评分对早期缓解没有影响。所有患者均有瘀斑或瘀点，四分之一的患者有粘膜出血，只有4名（8%）患者有器官出血。88%（n = 44）的患者接受了类固醇治疗。10%（n = 5）的患者因高出血评分（S2或M2）、血小板计数（PC）< 10 × 103/uL和/或一周持续出血症状后对类固醇治疗反应不佳而接受了静脉注射免疫球蛋白（IVIG）。由于这些患者对一线治疗无反应，20%的患者在研究开始后超过一个月接受了二线治疗艾曲波帕。五名患者表现出自发性疾病缓解，无需启动任何血小板增强治疗。这五名患者年龄小于6岁，仅表现为轻微的皮肤出血，血小板计数约为20 × 103/uL。

在我们的研究中，与对照组相比，患者组中微生物类型平均对数值的差异显而易见。Joseph H Oved 等人得出了类似的发现，指出新诊断ITP的儿童患者在诊断时表现出肠道菌群失调。研究中的微生物群如双歧杆菌属在患者组中的平均对数值低于对照组，但Phascolarctobacterium和乳酸杆菌属在患者组中的平均对数值显著高于对照组。Li等人进行的一项研究发现了类似的结果。他们发现厚壁菌门（乳酸杆菌属所属的一个门）在ITP患者中增加，而放线菌门显著减少，双歧杆菌属在ITP患者中显著减少。Yu及其同事进行的一项研究也发现，Phascolarctobacterium和乳酸杆菌属在ITP患者中显著增加。Zhang等人对30名成人ITP患者的研究表明，ITP患者微生物群的变化主要是由于乳酸杆菌属的富集，这与我们的研究结果相似。此外，在我们的研究中，Eubacterium coprostanoligeues、Lachnospiraceae和Ruminococcaceae这三种菌种在ITP病例中被检测到，但在对照组中未被检测到，可能需要进一步研究以确定其是否通过介导炎症在ITP发病机制中发挥作用。然而，另一项研究报告称，Lachnospiraceae和Ruminococcaceae在免疫调节中起作用，其代谢产物可以通过Treg细胞诱导免疫耐受。与Yu及其同事2022年的研究结果相反，他们在ITP患者组中发现拟杆菌属富集，而我们的病例和对照组中尽管经过细致的工作仍未能检测到拟杆菌属，这可能可以用各国微生物特征的建议来解释，这突显了环境因素和宿主遗传学在塑造肠道微生物群组成中的作用。

此外，我们的研究显示，在初诊时，早期疾病缓解患者和持续性ITP患者之间的微生物群模式存在显著差异。Phascolarctobacterium在早期缓解患者中的含量显著高于那些发展为P-ITP的患者。Phascolarctobacterium被认为是短链脂肪酸（SCFA）的重要生产者，包括乙酸和丙酸。SCFA在免疫调节中起重要作用，因为它们增加了Treg细胞的数量及其活性，并抑制CD4+细胞。它们还显示出减少肠道炎症并增强抗炎细胞因子如IL-10的表达。这可以解释在我们的研究中早期缓解患者中Phascolarctobacterium显著较高的现象。同样，Wang等人揭示了N-ITP、持续性ITP和慢性ITP之间肠道微生物组的差异，这在一定程度上与我们在初诊时的研究结果一致，但涉及不同的微生物种类。此外，我们的研究显示P-ITP组中的双歧杆菌水平显著高于早期缓解组，尽管整体ITP患者中双歧杆菌低于对照组。由于P-ITP在青少年中更为常见，P-ITP组和早期缓解组之间的这些微生物群差异可能归因于年龄和性激素。雌激素和睾酮显示出对免疫细胞以及肠道微生物群的直接影响。在另一项研究中，黄体酮被认为在妊娠晚期促进双歧杆菌的增加。因此，肠道微生物群、性激素和免疫之间的相互作用可以解释P-ITP和早期缓解患者之间微生物群的变化。这些数据表明微生物群在决定疾病进程和治疗反应方面可能起到作用，从而指导治疗决策。

虽然有器官出血的患者与没有器官出血的患者在微生物群方面存在显著差异，但文献中并未找到直接将出血与检测到的不同微生物群联系起来的关系。这可能与炎症过程和疾病的严重性有关，而不是出血本身。

尽管我们不同的患者组在最初存在微生物群差异，但微生物群分布的随访不在我们研究的范围内，因此我们没有研究益生元或益生菌对患者的影响。使用膳食酵母改变饮食可能通过诱导微生物群变化协助未来的ITP管理。

局限性

这项初步的单臂前瞻性研究没有包括2岁以下的婴儿。短期随访无法真正区分一组被归类为早期应答者的患者是否会再次进展为持续性或慢性ITP。少量的入选患者可能是一个限制。微生物属与免疫调节细胞、细胞因子或疾病不同阶段微生物群动态变化之间的直接关系超出了研究范围。我们没有研究益生元或益生菌对我们患者的影响。有限的先前研究涉及埃及健康儿童的肠道微生物群模式。治疗对微生物群的影响也未被研究。尽管研究代谢组学/宏基因组学会有更多价值，但它需要更高的预算，可以在未来的多中心研究中进行。