辐射通过胰腺癌细胞的外泌体分泌抑制肝转移Radiation suppresses liver metastases via exosome secretion in pancreatic cancer cells

辐射通过胰腺癌细胞的外泌体分泌抑制肝转移

胰腺癌（PC）由于其抗辐射性和转移性而难以治疗。放射治疗可以改变肿瘤微环境（TME），并影响PC的进展。尽管辐射会诱导外泌体产生，但它们的本质和作用机制尚不清楚。我们研究了来自辐照PC细胞（IR-Exo）的外泌体在体外和体内如何调控转移。

从三种人胰腺癌细胞系MIAPaCa-2、BxPC3和Panc-1中分离出外泌体。我们发现，在体外，IR-Exo被辐照的PC细胞摄取后，所有PC细胞系的迁移和侵袭能力均下降。此外，IR-Exos在体内阻止了由MIAPaCa-2细胞引起的肝转移。在外泌体中检测到2,565个miRNA，其中17个基因在非辐照细胞（0 Gy-Cells）和IR-Exo之间差异表达。miR-3160-5p是IR-Exo中最上调的miRNA。将miR-3160-5p转染到PC细胞中会降低细胞迁移和侵袭。此外，加入miR-3160-5p显著降低了RGMB（miR-3160-5p的目标分子）的表达。敲低RGMB表达显著阻止了细胞迁移和侵袭。因此，辐照增加了外泌体miR-3160-5p的表达，并通过减少RGMB表达抑制了细胞迁移和侵袭，这为新的治疗靶点或生物标志物指明了方向。

结果

外泌体的分离、鉴定和细胞摄取

分析了从MIAPaCa-2、Panc-1和BxPC3细胞培养基中分离的外泌体的纯度、质量和形态。使用Qubit蛋白测定法收集和测量外泌体蛋白。分离的外泌体是封闭的圆形囊泡，直径约为100 nm。形态特征与透射电子显微镜（TEM）观察到的相似（图1A）。CD9和CD63在所有人胰腺癌细胞系（MIAPaCa-2、Panc-1和BxPC3）的外泌体中均有表达，而细胞色素c仅在全细胞裂解物中检测到（图1B）。这些数据表明，外泌体成功地从培养基上清液中分离出来，没有受到细胞成分的污染。非辐照（0 Gy-Exos）和辐照（5 Gy-Exos）分离的外泌体在MIAPaCa-2细胞中成功吸收和内化。5 Gy-Exos的摄取量显著高于0 Gy-Exos（p < 0.05）（图S1）。

外泌体治疗损害胰腺癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力

我们调查了外泌体内化后的细胞存活变化。MIAPaCa-2、Panc-1和BxPC3细胞在有无5 Gy-Exos的情况下受到辐照（图1C）。接受5 Gy辐照并用5 Gy-Exos处理的MIAPaCa-2、BxPC3和Panc-1细胞显示出比单独接受5 Gy处理的细胞更低的存活率（分别为p < 0.01、p < 0.01和p < 0.05）（图1D-F）。

随后我们在PC细胞系中调查了细胞迁移（图2A和S2）。与非辐照细胞（0 Gy-Cells）相比，未受辐照且用0 Gy-Exos处理的MIAPaCa-2细胞、未受辐照且用5 Gy-Exo处理的细胞，以及接受5 Gy辐照且用5 Gy-Exos处理的细胞表现出显著减少的迁移细胞数量（分别为p < 0.001、p < 0.001和p < 0.0001）。将5 Gy-Exos引入0 Gy-Cells导致迁移细胞数量减少，与用0 Gy-Exo处理的0 Gy-Cells相比（p < 0.01）。相比之下，接受5 Gy辐照并用5 Gy-Exos处理的细胞表现出比用5 Gy-Exos处理的0 Gy-Cells更低的细胞迁移（p < 0.0001）。

0 Gy-Cells在无辐照且用0 Gy-Exos处理、无辐照且用5 Gy-Exos处理、以及接受5 Gy辐照且用5 Gy-Exos处理的Panc-1细胞中显示出显著减少的迁移细胞数量（分别为p < 0.01、p < 0.0001和p < 0.0001）。用5 Gy-Exos处理的0 Gy-Cells表现出显著减少的迁移细胞数量，与用0 Gy-Exo处理的0 Gy-Cells相比（p < 0.0001）。在BxPC-3中观察到类似结果，其中用0 Gy-Exos处理的0 Gy-Cells、用5 Gy-Exos处理的0 Gy-Cells以及接受5 Gy辐照且用5 Gy-Exos处理的细胞相比0 Gy-Cells表现出显著减少的迁移细胞数量（分别为p < 0.05、p < 0.0001和p < 0.0001）。在0 Gy-Cells中加入5 Gy-Exos导致迁移细胞数量减少，与用0 Gy-Exos处理的0 Gy-Cells相比（p < 0.01），而接受5 Gy辐照且用5 Gy-Exos处理的细胞表现出比用5 Gy-Exos处理的0 Gy-Cells更低的细胞迁移（p < 0.01）。

我们研究了外泌体内化后细胞侵袭的变化（图2B）。在MIAPaCa-2中，用5 Gy-Exos处理的0 Gy-Cells和接受5 Gy辐照且用5 Gy-Exos处理的细胞相比于0 Gy-Cells显示出显著减少的侵袭细胞数量（分别为p < 0.001和p < 0.0001）。在0 Gy-Cells中加入5 Gy-Exos减少了侵袭细胞的数量，与用0 Gy-Exos处理的0 Gy-Cells相比（p < 0.001），而接受5 Gy辐照且用5 Gy-Exos处理的细胞表现出比用5 Gy-Exos处理的0 Gy-Cells更低的细胞侵袭（p < 0.001）。在Panc-1细胞中，用0 Gy-Exos处理的0 Gy-Cells、用5 Gy-Exos处理的0 Gy-Cells和接受5 Gy辐照且用5 Gy-Exos处理的细胞相比于0 Gy-Cells显示出显著减少的侵袭细胞数量（所有p < 0.0001）。用5 Gy-Exos处理的0 Gy-Cells显示出显著减少的侵袭细胞数量，与用0 Gy-Exos处理的0 Gy-Cells相比（p < 0.001）。在BxPC-3细胞中记录了相同的结果，其中用0 Gy-Exos处理的0 Gy-Cells、用5 Gy-Exos处理的0 Gy-Cells和接受5 Gy辐照且用5 Gy-Exos处理的细胞相比于0 Gy-Cells显示出显著减少的侵袭细胞数量（分别为p < 0.01、p < 0.0001和p < 0.0001）。在0 Gy-Cells中加入5 Gy-Exos导致侵袭细胞数量减少，与用0 Gy-Exos处理的0 Gy-Cells相比（p < 0.01）。

来自辐照癌细胞的外泌体miR-3160-5p通过抑制RGMB抑制细胞迁移和侵袭

通过热图和条形图对5 Gy-Exos和0 Gy-Exos组之间不同表达的miRNA水平进行了分层（图3A和B）。在这17种miRNA中，miR-3160-5p的表达最高。因此，我们专注于miR-3160-5p以识别与外泌体治疗后细胞迁移和侵袭减少相关的潜在靶点。

利用TargetScan和miRTarBase数据库处理后，确定Repulsive Guidance Molecule BMP Co-Receptor B（RGMB）是miR-3160-5p的候选靶分子（图4A）。Alexa Fluor 488标记的miR-3160-5p转染到MIAPaCa-2细胞中的转染效率通过荧光信号检测显著观察到（p < 0.0001）（图4B）。转染miR-3160-5p后，RGMB表达显著下降（p < 0.05）（图4C）。MIAPaCa-2细胞转染miR-3160-5p并通过Transwell试验进行分析。与非靶细胞相比，转染细胞的迁移和侵袭显著减少（分别为p < 0.0001和p < 0.01）（图4D和E）。

辐照癌细胞衍生的外泌体抑制肝转移

为了模拟肝转移，MIAPaCa-2胰腺癌细胞——预处理过0 Gy-Exos或5 Gy-Exos——通过脾内注射异位移植到裸鼠体内，使癌细胞扩散到肝脏。8至14周后，小鼠被安乐死并收集组织进行检查（图5A）。石蜡包埋的肝和脾组织用苏木精和伊红或S100A4抗体免疫组化染色（图5B和C及图S3）。在注射MIAPaCa-2细胞的小鼠中发现了肝转移；与对照组相比，用0 Gy-Exos处理的MIAPaCa-2细胞（p < 0.0001）。然而，在注射用5 Gy-Exos处理的MIAPaCa-2细胞的组中未检测到转移（图5B和C）。与注射用5 Gy-Exos处理的MIAPaCa-2细胞的组相比，注射用0 Gy-Exos处理的MIAPaCa-2细胞的组中明显观察到了转移（p < 0.0001）。这些发现在检测不同组中的转移标志物S100A4后得到确认。在接受5 Gy-Exos处理的MIAPaCa-2细胞中，S100A4蛋白的表达显著减少（图5B）。治疗导致不同MIAPaCa-2注射组之间的体重没有明显损失（图5D）。

讨论

最近，由于辐照癌细胞产生的外泌体可能改变肿瘤进程的潜力引起了人们的兴趣，特别是它们影响转移行为的能力。在本研究中，我们显示了从暴露于辐射的人PC细胞（MIAPaCa-2、Panc-1和BxPC3细胞系）中提取的外泌体抑制了这些细胞的侵袭、迁移和肝转移。基于差异miRNA表达谱分析，我们显示了这些细胞增加了来自辐照细胞的外泌体摄取，并下调了miR-3160-5p的目标分子RGMB。

许多研究已经确立了miRNAs作为可靠的癌症进展和转移生物标志物。在胰腺癌中，几种miRNAs可能作为胰腺癌的生物标志物，如miR-21、miR-155、miR-210、miR-1290和miR-22。我们发现外泌体在细胞间通讯和肿瘤微环境调节中起着重要作用，这与最近的研究一致。这一点在胰腺癌中尤为相关，因为癌细胞和基质成分之间的外泌体介导的串扰显著影响疾病进展。值得注意的是，辐射诱导的外泌体miRNA谱的变化已显示从根本上改变它们对受体细胞的功能影响。外泌体miRNA，比如miR-3160-5p，调节控制转移和致癌的重要通路。miR-3160-5p对RGMB的抑制意味着辐照外泌体可以改变受体癌细胞的侵袭和迁移能力。这一发现与新兴证据一致，即放疗可以通过重新编程外泌体货物来发挥肿瘤抑制效果。糖蛋白RGMB在多种癌症中控制细胞迁移并促进转移。因此，miR-3160-5p对RGMB的下调可能是防止癌细胞扩散到其他器官的关键步骤。这种机制为我们体内模型中观察到的IR-Exo治疗后肝转移减少提供了一个潜在解释。

来自辐照外泌体的潜在治疗价值进一步凸显的是，它们在一个体内小鼠模型中显著减少了肝转移。外泌体作为辐射诱导肿瘤抑制介质的相关性已被类似研究所强调，这些研究表明它们在其他癌症中对转移的抑制作用。我们的研究还显示，来自辐照细胞的外泌体在不改变总体体重的情况下预防了肝转移，这表明它们的应用可能提供一种集中方法来减少系统毒性并阻止癌症扩散。

最近的研究表明，外泌体可以传递促肿瘤和抗肿瘤信号，对其在辐射反应中的功能认识正在迅速增长。我们的结果支持了这样一种观点，即来自辐照癌细胞的外泌体具有抗转移特性，miR-3160-5p是一个有希望的治疗生物标志物，可能有助于预防转移。包括其可能与放疗结合的外泌体治疗的临床转化应成为未来研究的重点。

结论

我们发现来自辐照PC细胞的外泌体有效地减少了这些细胞的迁移、侵袭和肝转移。这种效应似乎是通过靶向RGMB（细胞运动的关键参与者）的miR-3160-5p驱动的。这些结果表明，外泌体作为一种限制PC扩散的治疗工具具有前景，提供了一种潜在策略以增强放疗效果，同时最大限度地减少其有害副作用。对外泌体疗法在管理癌症转移方面的临床潜力进行进一步调查至关重要。

(全文结束)