两亲性螺旋肽-尼罗红探针被研究用于分析外泌体膜表面的脂质堆积缺陷（LPDs）。本研究考察了两种AH肽序列，分别源自载脂蛋白A-I（ApoC）的C端序列和人α-突触核蛋白（p2-23），它们在插入LPDs时的疏水面存在差异。通过合成脂质体作为外泌体模型进行AH肽插入深度和竞争结合试验，发现ApoC肽可作为深层LPDs的结合剂，而p2-23肽优先识别浅层LPDs。这些肽与环境敏感染料尼罗红（NR）结合后，通过荧光增强反应评估目标LPDs的丰度，并通过探针发射波长评估这些LPDs周围的膜特性。利用这些特性，我们的探针成功表征了来自三种癌细胞（A549、Hela和MCF7细胞）的外泌体的LPDs。结果表明，外泌体膜在深层和浅层LPDs及其周围膜极性方面表现出独特的结构性质，且这些性质显著依赖于供体细胞。我们的探针将作为强大的工具，推动对外泌体膜的理解。
【图1】
（A）两亲性螺旋（AH）肽-尼罗红（NR）结合探针用于荧光探测脂质堆积缺陷（LPDs）及其周围膜极性的示意图。（B）本研究中使用的ApoC-NR和p2-23-NR探针的结构。还展示了使用HELIQUEST获得的AH肽的螺旋轮表示。箭头指示每个肽的疏水矩向量。颜色：黄色，大体积疏水残基；灰色，小型非极性残基；蓝色，阳离子残基；粉色和紫色，无电荷极性残基；绿色，脯氨酸。（C）Laurdan和DPH的化学结构。
我们研究了两种AH肽，即ApoC和来源于人α-突触核蛋白的p2-23，作为与NR结合的LPD结合单元，用于探测外泌体膜（图1B）。先前的研究已经阐明了固有的LPD特性对于调节高度弯曲膜靶向蛋白中AH域结合能力的重要性。根据相对缺陷位点深度，LPD定性地分为“深”或“浅”。ApoC肽在其α-螺旋结构中的疏水面比p2-23肽更大（图1B），如通过HELIQUEST确定的螺旋轮表示所示。这表明其优先结合深层LPD。相反，浅层LPD会被p2-23肽优先结合。事实上，我们发现这些肽能够通过一系列合成脂质体的测试区分其目标LPD。其NR结合探针被证明可用于通过荧光增强响应评估目标LPDs的丰度，并通过探针的发射波长评估这些LPDs周围的膜特性。凭借这些特性，我们的探针成功表征了来自三种癌细胞的外泌体的LPDs。本文讨论了AH肽-NR探针的这些特性，为设计更先进的外泌体膜分析工具奠定基础。
【图2】
（A）加入20 µM AH肽（p2-23、ApoC和M2）后，标记有Laurdan的DOPC脂质体ΔGP值的变化。[Laurdan] = 0.5 µM，[DOPC脂质体（总脂质）] = 250 µM。（B）在存在DOPC脂质体或p2-23/脂质体复合物的情况下，ApoC-NR的荧光光谱。[ApoC-NR] = 2.0 µM，[DOPC脂质体（总脂质）] = 500 µM，[p2-23肽] = 0–50 µM。激发波长，552 nm。
首先，我们研究了两个AH肽在结合合成脂质体时的插入深度，以使用标记有Laurdan的DOPC脂质体（平均直径为115 nm）检查其对LPDs的结合特性。分子动力学模拟及随后使用Packmem算法对LPDs的表征表明，DOPC脂质体在膜表面同时具有深层和浅层LPDs。Laurdan可以插入到脂质双层中脂质尾部的深度，其发射光谱会因暴露在水中的程度而发生显著变化，从而可以分析肽在膜上的插入情况。图2A显示了AH肽结合后嵌入DOPC脂质体中Laurdan的ΔGP值变化。ApoC结合导致Laurdan的ΔGP大幅增加，表明Laurdan暴露在水环境中的程度减少。这意味着由于ApoC肽更深地插入膜中，膜的脂质堆积更加紧密。相比之下，我们观察到p2-23肽的ΔGP值下降。这意味着在p2-23肽结合后，水更容易接触到脂质体内的Laurdan，这很可能是由于p2-23肽较浅地插入膜中所致。值得注意的是，观察到的ApoC的ΔGP值与已知能深入插入膜中的M2肽相当。结合其对LPDs的优先结合，这些结果表明ApoC和p2-23肽分别能够识别高曲率膜上的深层和浅层LPDs。
我们接下来研究了这些肽是否会相互竞争结合DOPC脂质体。如果ApoC和p2-23肽分别选择性识别深层和浅层LPDs，则这些肽之间不会发生竞争结合。在这里，制备了通过C5连接子在N端结合NR单元的肽探针（ApoC-NR和p2-23-NR，图1B）。虽然这些NR探针在缓冲液中显示出弱发射，但在加入DOPC脂质体后引起了发射增强以及发射峰的蓝移。这源于AH肽单元结合到膜表面LPDs上后，NR单元分配到膜区域。通过荧光各向异性滴定实验确定了表观解离常数（Kd）。ApoC-NR和p2-23-NR的Kd值分别为45 ± 14 µM和60 ± 12 µM（插图，图S3），显示出这些探针具有相当的结合亲和力。在竞争结合实验中，首先将p2-23肽与DOPC脂质体孵育形成p2-23/脂质体复合物，然后加入ApoC-NR探针。在没有p2-23肽的情况下，ApoC-NR在结合脂质体时显示出强烈的发射，而在存在5-50 µM p2-23肽的情况下，其发射保持不变（图2B）。这表明ApoC-NR未被p2-23肽从脂质体上取代，说明ApoC肽不与p2-23肽竞争结合脂质体，因为它们的结合位点不同。需要注意的是，我们在加入M2肽时观察到ApoC-NR的发射显著减少。这归因于ApoC和M2肽之间的竞争结合，因为这两种肽都靶向深层LPDs，这也验证了目前分析AH肽对LPDs结合偏好的实验。我们还发现在将p2-23-NR加入ApoC/脂质体复合物的情况下几乎没有竞争（图S5）。结合插入深度检测结果（参见图2A），ApoC肽可以作为深层LPD结合剂，而p2-23肽则优先识别浅层LPDs。
AH肽-NR探针对合成脂质体的荧光响应
我们接下来评估了ApoC-NR和p2-23-NR探针对合成DOPC脂质体或POPC（棕榈酰-油酰-磷脂酰胆碱）脂质体的荧光增强响应。以下荧光实验使用470 nm的激发波长进行，以便根据之前的文献讨论NR单元的溶剂变色响应以及探针的荧光增强响应。脂质体脂质组成中不饱和酰基链的数量（DOPC中有两个双键，POPC中有一个双键；图S1）极大地影响了LPD的丰度。据报道，当DOPC被POPC取代时，深层和浅层LPDs都会减少。随着DOPC脂质体浓度的增加，探针的发射增强（图3A），其中ApoC-NR对脂质体的荧光响应大于p2-23-NR。ApoC-NR对DOPC脂质体的响应比对POPC脂质体的响应大4.8倍。此外，p2-23-NR对DOPC脂质体的响应也比对POPC脂质体的大2.2倍。这些结果归因于由于酰基链中不饱和度增加而导致的目标LPDs数量增加，从而使探针更有利地结合到DOPC脂质体上。因此，这些探针的荧光增强响应很可能反映膜上目标LPDs的丰度。
图3
（A）添加DOPC或POPC脂质体后探针的荧光增强。F和F0分别表示存在和不存在脂质体时在650 nm（ApoC-NR）或660 nm（p2-23-NR）处的荧光强度。激发波长，470 nm。（B）在不同胆固醇（Chol）含量（0-50%）的DOPC脂质体存在下，ApoC-NR的归一化荧光光谱。[ApoC-NR] = 2.0 µM，[脂质体] = 500 µM。激发波长，470 nm。
我们随后转向探针中NR单元的溶剂变色特性，以评估它们是否能够报告LPDs周围的局部膜极性。通过一系列溶剂中的光谱测量，证实了ApoC-NR和p2-23探针中的NR单元表现出强烈的溶剂变色特性，类似于NR本身（图S6）。在此，我们制备了不同胆固醇（Chol）含量（0-50%）的合成DOPC脂质体或POPC脂质体。在使用我们的探针之前，根据文献报道的方法，使用Laurdan的GP值估计了这些脂质体的膜极性。DOPC脂质体的膜比POPC脂质体更具极性（更少有序），并且随着Chol含量的增加，极性降低（图S7），这与文献报道的结果一致。图3B显示了在存在DOPC/Chol脂质体的情况下，ApoC-NR的归一化发射光谱。ApoC-NR在DOPC脂质体中显示出最大值（λem）为635 nm的强烈发射。发现对于极性较低的POPC脂质体，λem值蓝移到620 nm（图S8）。此外，随着DOPC和POPC脂质体中Chol含量的增加，膜极性降低，观察到逐渐的蓝移（图3B和S8）。因此，结合其结合偏好，其发射很可能反映深层LPDs周围的局部膜极性。同样，p2-23-NR在响应膜极性变化时表现出波长移动的发射（图S9）。p2-23-NR将报告浅层LPDs周围膜极性的差异。
为了进一步深入了解局部膜特性，我们进行了基于比率分析的探针对脂质体响应的检查。由于NR单元的发射带位置描述了局部极性，我们按照先前使用的方法分析了NR发射的短波长和长波长部分（ApoC-NR：590 nm和650 nm，p2-23-NR：590 nm和660 nm）。短波长处更强的发射表明微环境更具极性，而在长波长处我们可以观察到微环境较少极性时更强的发射。因此，这些波长处发射强度的相对比值（ApoC-NR的_F_ 590/F 650和p2-23-NR的_F_ 590/F 660）可用于探测LPDs周围局部膜的极性。实际上，我们发现这些探针对上述脂质体的比率值与通过Laurdan测定法确定的膜极性（GP值）高度相关（图4）。这些结果验证了使用我们的探针进行局部膜极性比率分析的有用性。需要注意的是，AH肽和NR单元之间的适当连接长度在局部膜特性的分析中起着至关重要的作用。我们发现，当检查使用短C1连接子携带NR单元的AH肽探针时，NR单元对膜极性变化的溶剂变色性会减弱甚至缺失（图S10）。这是因为在使用短连接子时，NR单元未能有效分配到膜中。因此，在进一步研究中使用了带有C5连接子的ApoC-NR和p2-23-NR探针（参见图1B）。
图4
通过Laurdan测定法确定的不同膜极性（GP）的脂质体探针荧光发射比值。
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