工程噬菌体来源的溶素有效杀死分枝杆菌病原体

亮点

分枝杆菌感染因其多重耐药性导致的长期治疗方案而仍然是全球健康挑战，这主要是由于药物难以渗透到具有高度不透性细胞包膜的胞内病原体。
分枝杆菌溶素是工程化的嵌合蛋白，模拟噬菌体溶菌系统来突破这一屏障，提供了一种生物学策略来增强治疗效果，同时限制耐药性的演化。
VersaTile技术实现了分枝杆菌溶素的模块化、高通量工程设计，产生了具有强大活性的候选物，能够选择性靶向分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)，包括牛分枝杆菌卡介苗(Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)和鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)，最小抑菌浓度值较低。
临床前体内研究证明了其在大鼠伤口和肺部感染模型中的功效，在与一线抗分枝杆菌药物联用时活性增强，支持分枝杆菌溶素平台的转化潜力。

技术准备度

分枝杆菌溶素平台代表了一个将噬菌体生物学转化为治疗性酶设计的生物技术框架。目前，该技术处于技术准备水平4级：通过体外筛选、胞内活性证明、血清稳定性以及伤口和肺部感染模型的初步体内功效已建立概念验证。该平台具有模块化和可扩展性，允许系统生成和筛选数千种变体，并已产生对多种分枝杆菌病原体（包括牛分枝杆菌卡介苗、鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌）具有可测量活性的先导候选物。

尽管取得了这些进展，该技术仍处于临床前探索阶段。尚未解决的问题包括在慢性感染和免疫健全感染模型中证明功效、开发适用于吸入或全身递送的制剂，以及评估免疫原性、药代动力学和药效学。化学、制造和控制方面的考虑也很关键：虽然分枝杆菌溶素可以在大肠杆菌中表达，但产量、纯化和内毒素去除的优化或替代宿主的表达将决定可制造性和成本效益。

从政策角度看，基于酶的抗菌剂代表了一种新型治疗类别。因此，早期与监管机构的接触对于建立安全性、有效性和质量标准将很重要。当这些问题得到解决时，分枝杆菌溶素平台可能为抗分枝杆菌治疗药物组合提供有价值的补充，特别是作为现有多药治疗方案的辅助手段，减少治疗时间并限制结核病和非结核分枝杆菌中耐药性的出现。

摘要

抗分枝杆菌病原体中的抗菌素耐药性仍然是一个关键挑战，这是由于药物难以穿透其复杂的细胞壁，需要长期的多药治疗方案。分枝杆菌噬菌体编码了一种可以破坏这一屏障的溶菌机制。在这项研究中，我们描述了一种模块化的分枝杆菌溶素平台，它结合了噬菌体酶溶素A和溶素B，以及外膜通透化肽和蛋白质转导域，使用VersaTile随机技术。通过对耻垢分枝杆菌和牛分枝杆菌卡介苗(BCG)筛选嵌合蛋白库，随后评估选定的分枝杆菌溶素命中物，我们发现了具有强大活性的候选物，对牛分枝杆菌BCG的最小抑菌浓度值低至1.28 μg/ml，对病原性非结核分枝杆菌鸟分枝杆菌的浓度高达75 μg/ml。三种最有效的分枝杆菌溶素显示出胞内功效、血清稳定性、非细胞毒性、体内概念验证功效，以及与利福平治疗的协同作用。这一生物技术框架展示了将噬菌体酶转化为下一代抗分枝杆菌疗法的前景。

关键词

抗菌素耐药性、分枝杆菌病原体、VersaTile技术、溶素A、溶素B、分枝杆菌溶素

引言

分枝杆菌感染继续成为人类死亡的主要原因之一，其中最著名的当属结核病(TB)，主要在发展中国家流行。结核病是由结核分枝杆菌引起的传染性呼吸道感染，主要影响肺部，但也可能影响身体其他部位。2023年，全球估计有1080万人被诊断出患有结核病，其中125万人死于该感染[1]，这突显了它对全球各地公共卫生基础设施构成的持续挑战。世界卫生组织已制定目标，要在2035年前消除结核病大流行。然而，由于多重耐药(MDR)和广泛耐药病原体的出现，加上有效治疗选择的短缺，进展落后于既定目标[2,3]。最近，环境中的非结核分枝杆菌(NTM)(见术语表)已成为令人担忧的病原体，引起类似结核病的肺部疾病。尽管与较低死亡率相关，但这些感染可能发展为慢性疾病，对患者生活质量产生负面影响[4]。NTM表现出高水平的固有抗菌素耐药性(AMR)；像脓肿分枝杆菌这样的快速生长菌种通常对一线结核病药物具有耐药性[5]。

标准的药物敏感结核病治疗涉及为期6个月的异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇方案。对于MDR-TB，则使用6个月的BPaLM方案—贝达喹啉、pretomanid、利奈唑胺和莫西沙星[6]。相比之下，NTM感染的治疗因遗传变异而个体化，可能持续长达24个月。常用的抗生素包括利福平、乙胺丁醇和大环内酯类，而阿米卡星、链霉素和氯法齐明则保留用于耐药或严重病例[7]。由于抗生素耐药性的上升和相关副作用，当前治疗的有效性已显著下降，迫切需要新型有效的抗分枝杆菌疗法[8]。因此，研究工作越来越集中于评估新化合物和治疗方案，以及增强现有疗法以对抗耐药菌株[9,10]。

分枝杆菌有限的抗生素敏感性源于其复杂的细胞包膜，由细胞膜组成，周围是一层密集、几乎不透的分枝菌酸(MA)双层和肽聚糖(PG)，以及最外层的多糖和蛋白质[11]。MA以游离和结合形式存在—前者包括作为致病关键的海藻糖甘油酯[12]，而后者与阿拉伯半乳聚糖酯化，形成与PG的不溶性细胞壁骨架[13-15]。两种形式都对细胞包膜的不透性有贡献，并且对生存至关重要，成为抗结核药物开发的主要靶点[16-18]。

分枝杆菌噬菌体及其破坏分枝杆菌细胞包膜不同层的酶—溶素A(LysA，一种PG水解酶)和溶素B(LysB，一种分枝菌酰阿拉伯半乳聚糖酯酶)—作为对抗耐药分枝杆菌的潜在治疗药物已引起关注[19]。一些噬菌体，包括野生型和工程化的噬菌体，已显示出对抗结核病和NTM感染的前景[20]。然而，噬菌体治疗面临挑战，如宿主特异性、需要高噬菌体剂量、体内快速清除以及难以接触胞内病原体，如结核分枝杆菌[20]。迄今为止对LysA和LysB酶的研究总结见在线补充信息表S1(包括噬菌体来源、结构域架构和酶的表达系统)，在线补充信息表S2(体外MIC/MBC；最小杀菌浓度值)，以及在线补充信息表S3(可用的体外和体内LysB酶功效数据)。全面调查显示，虽然几种LysA和LysB变体(如来自分枝杆菌噬菌体D29、Ms6、BTCU-1和TM4的)已被表征，但它们的独立功效通常有限。原生LysA酶在外部应用时通常无法穿透富含MA的外膜到达其PG底物，尽管来自Ms6和BTCU-1的LysA已被证明可诱导靶向分枝杆菌物种的生长抑制和形态改变[21,22]。另一方面，虽然LysB酶可以水解分枝菌酰阿拉伯半乳聚糖连接，并表现出更强的抗分枝杆菌活性，但它们通常需要高酶浓度或添加破坏剂或表面活性剂才能达到治疗相关的杀菌活性[23,24]。在我们实验室，LysB变体在没有表面活性剂的情况下仅在与外膜通透化剂(如多粘菌素和鱼精蛋白)配对时才表现出抗分枝杆菌活性[25]。

原生内溶素作为潜在抗菌治疗应用的局限性通常在于难以穿透和接触胞内病原体，而分枝杆菌噬菌体酶在NTM物种间表现出不同的活性[26,27]。为了克服这些障碍，蛋白质工程方法已寻求将催化结构域与辅助模块(如外膜通透化剂(OMPs)或蛋白质转导域(PTDs，也称为细胞穿透肽))结合[28,29]。OMPs是具有阳离子、疏水或两亲性质的肽，通过破坏细菌外膜的稳定性，此前已与其他溶素变体融合，开发出针对革兰氏阳性[30]和革兰氏阴性细菌[31]的有效抗菌剂。PTDs是短链[5-30个氨基酸(aa)]，可以穿过真核细胞膜，将不同分子转运到细胞中[32]。一些PTDs具有膜活性特性，并表现出内在的抗菌活性[33]，由于其阳离子和两亲性质[34]，类似于抗菌肽。

VersaTile平台由Gerstmans等人[35]基于IIs型限制酶DNA组装开发，为针对革兰氏阳性和革兰氏阴性病原体的多样化模块蛋白的灵活设计和快速构建组合库提供了强大平台。这些包括内溶素与OMPs[26,35]、PTDs[36]或噬菌体受体结合域的融合[37]。

本研究首次应用VersaTile技术来设计、构建和组装针对分枝杆菌病原体的组合酶库，该库包含溶素A和溶素B、OMPs和PTDs。工程化库最初针对耻垢分枝杆菌进行筛选，随后针对牛分枝杆菌卡介苗(BCG)。对嵌合蛋白"分枝杆菌溶素"的活性克隆对抗BCG和两种NTM临床分离株脓肿分枝杆菌和鸟分枝杆菌的抗分枝杆菌活性进行了确认。表现出最高生长抑制的分枝杆菌溶素候选物进一步评估了胞内杀灭能力、细胞毒性、人血清中的稳定性和储存稳定性。最后，体内功效在感染鸟分枝杆菌的大鼠皮肤和肺部模型中进行了评估。

结果

库筛选和选择具有抗分枝杆菌活性的分枝杆菌溶素克隆

使用VersaTile DNA组装技术构建了编码潜在抗分枝杆菌蛋白的组合库，该技术包括两个主要步骤：首先是设计和构建进入载体中的瓷砖库，然后是组合装配到表达载体中。每个瓷砖对应嵌合蛋白的构建块，包括指导其在最终组装中位置的唯一位置标签的编码序列。选择了11种溶素B变体(代表不同的编码序列(见在线补充信息表S4)和结构特征，如我们先前报告所述[38]，并设计为通过PCR的瓷砖。此外，选择了7种溶素A和2种PTD序列(对耻垢分枝杆菌表现出有效活性)(见在线补充信息表S4和S5)，并基于先前研究[35]构建为瓷砖，而其余瓷砖，包括41种OMPs和6种连接子，此前已构建(见在线补充信息表S6和S7)。总共构建了11个不同配置的组合库，包括两个具有所有瓷砖(41种OMPs、11种溶素B、6种连接子、7种溶素A和2种PTDs)的库，但溶素A和溶素B的位置互换。在其余库中，删除了1-3个瓷砖和/或互换了溶素A/溶素B的位置(图1A)。连接子瓷砖放置在溶素A和溶素B瓷砖之间。库1和2具有针对靶向分枝杆菌细胞壁屏障的最大理论变体数量(37,884)，基于可用瓷砖的所有可能组合。

为评估抗分枝杆菌活性，从每个库中随机选择了384个大肠杆菌BL21(DE3)-RIL CodonPlus菌落(即四个96孔板)进行表达和筛选，以评估其对非致病性耻垢分枝杆菌细胞(作为致病性结核分枝杆菌的替代模型)的生长抑制效应。基于浊度测量(48小时后OD600nm < 0.1)显示生长抑制的变体被视为命中物。选择严格的筛选标准是为了仅选择最有效的变体，因为部分生长抑制在治疗上不相关。库1(OMP-溶素B-连接子-溶素A-PTD)获得了最高的命中率(55.73%，n = 214)的活性克隆，而在库2中互换溶素B和溶素A位置导致命中率较低(35.42%，n = 136)。令人惊讶的是，删除一个或多个瓷砖(配置3-11)导致抗分枝杆菌活性丧失，没有检索到OD600nm < 0.1的命中物(图1B)。

使用刃天青微孔板测定法(REMA)对表达的库针对牛分枝杆菌BCG菌株进行筛选，这是一种用于评估细菌(如结核分枝杆菌)中细胞活力和抗菌素敏感性的成熟方法[39]，基于无生长细菌与PrestoBlue孵育后无颜色变化。显示99%细菌生长抑制的变体被视为命中物。与先前针对耻垢分枝杆菌的筛选结果一致，库1表现出最高的命中率(19.27%，n = 74)，而库2的命中率较低(12.76%，n = 49)，配置3-11显示抗分枝杆菌活性丧失，无记录的命中物。命中物根据其生长抑制效应的程度进行排名，即那些对耻垢分枝杆菌给出OD600nm < 0.1且对牛分枝杆菌BCG给出99%生长抑制的被选择。基于此选择标准，选择了33个分枝杆菌溶素克隆进行蛋白质表达筛选和进一步实验(见在线补充信息图S1)。

筛选了对耻垢分枝杆菌具有阳性生长抑制效应的350种分枝杆菌溶素变体，也针对实验室可用的革兰氏阳性(溶壁微球菌、红球菌和诺卡氏菌)和革兰氏阴性(大肠杆菌和门多萨假单胞菌)细菌菌株。筛选结果显示仅对红球菌和诺卡氏菌(属于放线菌纲中的分枝杆菌目)具有生长抑制活性(见在线补充信息图S2A,B)，而对其他革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌无生长抑制[40]。

活性分枝杆菌溶素的组成和预测结构特征

对33种分枝杆菌溶素变体进行测序，以确定对抗分枝杆菌活性有贡献的关键模块(见在线补充信息表S8)。测序结果显示N端存在多样化的OMPs，均共享α-螺旋结构，其中一些具有两亲性质。在使用的11种溶素B酶中，LysB-D29、-Omega、-Bxz2、-L5、-Saal和-Obama12在活性分枝杆菌溶素中被发现，而在7种溶素A瓷砖中，仅LysA-BTCU-1和-TM4被发现。柔性连接子是最具代表性的连接子，PTD TAT45-57在大多数测序的活性分枝杆菌溶素中保守存在(图1C)。

使用AlphaFold在线服务器预测了上述分枝杆菌溶素变体的结构。结构相似性通过DALI Z-分数进行比较和评估。我们的分析确定了两个不同的结构簇，表明每个簇内具有高度同源性(图2A)：簇1包含23种结构，均共享LysA-BTCU-1，而簇2包含10种结构，均具有LysA-TM4。这种聚类表明特定的溶素A变体(BTCU-1或TM4)在决定分枝杆菌溶素变体的整体结构中起着重要作用。对活性分枝杆菌溶素的预测模型的高置信度(平均pLDDT为84.6，范围72.4-90.2)进一步加强了这些分组的有效性。图2B显示了多结构域分枝杆菌溶素变体代表的同源模型，它们独特地结合了各种功能，包括OMP、溶素B、柔性连接子、溶素A和PTD。预测模型的大多数二级结构元素是α螺旋。有趣的是，簇1结构表现出明确定义的二级结构，与簇2中的结构相反，暗示这些变体中可能存在固有柔性或不太稳定的构象。尽管有分枝杆菌溶素名称，簇1和簇2的代表结构表现出显著的结构差异。这些代表的结构比对主要覆盖溶素B区域，跨越约530个残基，TM分数为0.42，RMSD为7.54 Å。TM分数低于0.5通常表示两种蛋白质不共享相同的折叠，对齐区域的高RMSD值进一步证实了显著的结构差异。

分枝杆菌溶素的生产和纯化及稳定性

在六种不同表达培养基中培养大肠杆菌菌株以生产33种活性分枝杆菌溶素蛋白，仅在TB培养基中显示出可溶形式的最高表达水平(与其他培养基中形成的包涵体形成对比)，因此被选为实验室规模表达(见在线补充信息图S3-S8)。蛋白质通过固定化金属离子亲和层析从澄清的细胞裂解物中纯化，并通过尺寸排阻色谱脱盐(蛋白质的SDS-PAGE分析见在线补充信息图S9)。分枝杆菌溶素分子量范围在91至100 kDa之间。在100 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、pH 8条件下，在4°C下储存6个月后，分枝杆菌溶素对耻垢分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG的抗分枝杆菌活性无明显聚集或损失。

分枝杆菌溶素变体对不同分枝杆菌的选择性活性

33种纯化分枝杆菌溶素蛋白对抗耻垢分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG菌株的抗分枝杆菌活性得到验证。通过肉汤微量稀释法测定的变体最小抑菌浓度(MIC)，对耻垢分枝杆菌的范围为3至440 μg/ml(表1)。由于更快的响应率和与传统肉汤微量稀释法相比的更高精度(例如，不受缓慢、微弱生长或细胞聚集影响)，并与其菌落形成单位(CFU)良好相关[39]，因此使用REMA测定法确定对BCG菌株的MIC。分枝杆菌溶素MCL-11、MCL-12、MCL-17、MCL-20和MCL-22对牛分枝杆菌BCG最有效，MIC99值分别为5、1.25、1.28、6和6 μg/ml(表1)。基于这些结果，使用REMA测定法进一步评估了五种分枝杆菌溶素对抗两种临床NTM分离株—鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌的抗分枝杆菌活性。MCL-12、MCL-17和MCL-20对鸟分枝杆菌表现出生长抑制效应，浓度分别为75、65和50 μg/ml，而仅MCL-17在65 μg/ml浓度下抑制了脓肿分枝杆菌的细胞生长(图3)。通过肉汤微量稀释法测定的MCL-12、MCL-17和MCL-20对鸟分枝杆菌的MIC发现为75 μg/ml(表1)，而对脓肿分枝杆菌无法确定MIC。

为可视化分枝杆菌溶素处理的效果，用100 μg/ml分枝杆菌溶素MCL-12处理的代表性脓肿分枝杆菌和鸟分枝杆菌菌株在37°C下孵育24小时后通过透射电子显微镜观察。与悬浮在储存缓冲液中的未处理细胞相比(显示杆状细胞，细胞壁完整，膜定义明确)，微照片显示两种菌株的形态变化(图4A,B)。处理的细胞外观变形，细胞表面形态不规则，缺乏膨胀压力，表明细胞完整性受损。此外，可以观察到从细胞泄漏的细胞碎片、细胞壁破裂和裂解细胞的残余(图4C,D)。

活性分枝杆菌溶素先导中的各个模块活性

对五种纯化的先导分枝杆菌溶素中的四种(MCL-12、-17、-20和-22)进行了基于特定模块的活性测定。使用浊度测定法对溶壁微球菌冻干粉作为底物的LysA的溶菌酶活性显示，分枝杆菌溶素的特定活性范围为515-2230 U/mg，MCL-22显示出明显高于其他溶菌酶的活性(见在线补充信息图S10A)。对对硝基苯丁酸酯的LysB酯酶活性给出相当相似的特定活性，范围在450至540 U/mg之间，MCL-17最高，其次是MCL-22(见在线补充信息图S10B)。相比之下，作为LysA和LysB的阳性对照的酶，即鸡卵清溶菌酶和LysB-D29，在类似测定条件下具有11,217.8和412.14 U/mg的特定活性。

使用互补荧光探针测定法[基于染料N-苯基-1-萘胺(NPN)和碘化丙啶(PI)的摄取，分别测量外膜和内膜屏障的剂量依赖性破坏]显示MCL-12是最有效的分枝杆菌溶素，其次是MCL-17(见在线补充信息图S11和S12)。在外膜破坏的亚治疗浓度分枝杆菌溶素MCL-12(0.5 × MIC，8 μg/ml)下，NPN摄取为70.9%(相对于外膜破坏的多粘菌素B阳性对照)，在2 × MIC(16 μg/ml)下增加至超过100%。通过PI摄取验证的内膜破坏在MCL-12的0.5 × MIC下显示出1.6倍的相对荧光(RF)，在4 × MIC下升至5.08倍RF。MCL-17需要更高浓度才能实现显著的膜通透化，在2 × MIC的分枝杆菌溶素下，NPN摄取接近多粘菌素B的81%，在4 × MIC下为2.89倍RF。MCL-20在测试的分枝杆菌溶素中显示出最低的膜通透化活性。

分枝杆菌溶素在人血清中的稳定性

从三种先导分枝杆菌溶素中，MCL-11、MCL-12和MCL-17被选为血清稳定性测试。测试显示在37°C下血清中孵育长达3小时后，对牛分枝杆菌BCG的部分保留活性(图5A)。通常，在先前测量的MIC值(根据REMA)下血清孵育后分枝杆菌溶素的分枝杆菌生长抑制有所下降(表1)。MCL-11和MCL-12在血清中孵育2小时后保留约50%的抗分枝杆菌活性，在3小时后仅保留约30%(图5A)。分枝杆菌溶素MCL-17遵循类似趋势，在血清中孵育2小时和3小时后分别保留约40%和25%的活性，而1小时血清孵育显示出约70%的稳定生长抑制，与分枝杆菌溶素浓度(2-32.5 μg/ml)无关(图5A)。后者可能反映了饱和现象，例如由于分枝杆菌溶素与血清蛋白结合，而不是真正的剂量-反应关系缺乏或生长抑制的简单平台期。利福平在0.1 μg/ml浓度下作为对照，在血清中孵育3小时后导致细菌负荷减少52%(未显示)。

靶向人巨噬细胞中的胞内分枝杆菌

通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物(MTT)比色测定法评估MCL-11、MCL-12和MCL-17对人原代巨噬细胞的细胞毒性效应显示，没有一种分枝杆菌溶素导致细胞活力显著下降。细胞活力保持在≥70%的既定标准限值以上，这被认为是可接受的非毒性效应41。

进一步测试分枝杆菌溶素针对感染牛分枝杆菌BCG的人巨噬细胞中胞内分枝杆菌的能力，感染复数为10，显示所有三种候选物都能消除胞内牛分枝杆菌BCG细胞(图5B)。测试的最低分枝杆菌溶素浓度(0.3-0.9 μg/ml)显示出44%的细菌生长减少。胞内细菌消除的最高水平分别为MCL-11(30 μg/ml)的70%、MCL-12(3.4 μg/ml)的60%和MCL-17的66%。在更高浓度下随后下降或平台期可能反映了供体间的生物学变异性以及6天测定时间框架或底物可及性的限制。相比之下，一线结核病抗生素异烟肼作为对照，在100 μg/ml浓度下表现出88%的胞内杀灭率。总体而言，此分析表明所有评估的分枝杆菌溶素都具有靶向胞内分枝杆菌的能力。

分枝杆菌溶素在伤口感染模型中的体内抗分枝杆菌活性

基于对鸟分枝杆菌的体外活性，分枝杆菌溶素MCL-12、MCL-17和MCL-20被选择用于使用标准小鼠伤口感染模型的体内抗分枝杆菌活性实验，与一线抗结核药物利福平平行。动物感染鸟分枝杆菌(最终密度约为10^8 CFU/ml)，然后单独或联合使用利福平或分枝杆菌溶素变体进行治疗，如图7A1所示。利福平的局部应用在第一次给药后显著减少了细菌计数约1.2个对数单位。虽然分枝杆菌溶素MCL-12和MCL-17显示出与利福平相当的抗菌活性(P < 0.05)，但MCL-20表现出最高的效力，是单独使用的个体试剂中(P < 0.05)，第一次给药后细菌计数减少约1.97个对数单位(图7A2)。当与利福平联合使用时，MCL-12和MCL-17的抗分枝杆菌活性得到改善，与单独使用的分枝杆菌溶素MCL-20相当(图7A2,A3)。当与利福平联合使用时，MCL-20的抗菌活性显著提高了0.3个对数单位(P < 0.05)，优于MCL-12和MCL-17/利福平组合(图7A3)。第5、7和9天的后续剂量继续显著(P < 0.05)增强所有治疗组的抗菌活性，MCL-20保持最有效的分子。在最后一次治疗剂量后(第9天)达到最大抗菌活性，细菌计数对数减少分别为分枝杆菌溶素MCL-12、MCL-17和MCL-20的3.6、3.8和4.4(图7A4-A6)。同样，利福平联合治疗进一步提高了MCL-12和MCL-17分枝杆菌溶素的总体抗菌活性，达到4.6和4.7个对数单位的减少，与MCL-20单独使用相当。值得注意的是，利福平/嵌合分枝杆菌溶素MCL-20组合显示出最佳活性，细菌计数减少5.53个对数单位。

分枝杆菌溶素在肺部感染模型中的体内抗分枝杆菌活性

随后在肺部模型中调查了MCL-12、MCL-17和MCL-20对鸟分枝杆菌的潜在抗分枝杆菌活性。为确保病原体和治疗直接递送到肺部，大鼠用鸟分枝杆菌挑战，随后通过气管内给药。同样，MCL-20表现出最高的抗菌活性，在实验结束时细菌计数显著减少1.2 ± 0.15个对数单位(图7B2)。此外，当与利福平联合使用时，额外观察到0.5个对数单位的减少，表明可能存在协同效应(图7B2)。另一方面，MCL-12、MCL-17和利福平未能显著减少细菌计数(P < 0.05)。然而，利福平与MCL-12或MCL-17的联合使用显示出与MCL-20单独使用相当的活性(P < 0.05；图7)。这些发现强调MCL-20是一种能够对抗鸟分枝杆菌肺部感染的强效酶，而MCL-12和MCL-17可能需要利福平才能达到类似效果。通过测量体重(g)和天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶活性对每种治疗(单一或联合)对整体动物健康的影响的进一步评估显示这些参数无显著变化(见在线补充信息图S13和S14)。

讨论

抗菌素耐药性的急剧上升及其对医疗保健的预期后果重新激发了人们对噬菌体及其溶菌相关酶作为潜在治疗工具的兴趣。早期关于内溶素的研究证明了它们对抗革兰氏阳性细菌的有效性，这得益于其PG层的可及性。随后，内溶素的工程化扩展了它们的范围，包括革兰氏阴性细菌。特别是，使用VersaTile平台将内溶素与OMP(Artilysin)或噬菌体受体结合蛋白(Innolysin)的融合已被证明是杀死革兰氏阴性多重耐药鲍曼不动杆菌[26,35]和头孢菌素耐药大肠杆菌的有效策略[37]。在此，我们应用VersaTile技术构建了一个更强大的模块化平台，用于破坏分枝杆菌高度复杂的细胞壁。分枝杆菌溶素平台系统地整合了受噬菌体生物学启发的催化和辅助模块，生成优化用于治疗的功能性抗分枝杆菌构建体。

本研究中设计的11个嵌合库包含不同模块，具有一个或两个分枝杆菌噬菌体酶，LysA和LysB，通过不同大小和性质的连接子融合在一起，并以不同方向与OMP和/或PTD结合(图1)。LysA酶是高度多样化的模块化蛋白，通常由N端催化结构域、C端PG结合结构域以及通常额外的中央催化结构域组成[19]。在LysA蛋白中已鉴定出六种不同的酶活性，包括溶菌酶、酰胺酶和肽酶活性。LysB酶靶向并破坏分枝杆菌细胞壁的MA层，属于α/β-水解酶家族，与角质酶、脂肪酶和酯酶具有共同特征。30种LysB同源模型的序列和结构比较显示域组织以及包含催化组氨酸残基的环结构的显著多样性[38]。

使用目标物种OD600低于0.1的严格标准筛选库的分枝杆菌生长抑制。初始筛选涉及384个随机选择的克隆的澄清细胞裂解物(由于研究时实际筛选约束而受限于该数量)，代表库1和2中所有模块化组件的约1%(图1)。使用耻垢分枝杆菌(作为结核分枝杆菌的替代模型[42])，筛选确定了350个活性命中物，全部来自库1和2(图1)。库1(OMP-溶素B-连接子-溶素A-PTD)产生的最有效活性变体(n = 214)多于库2(n = 136)，库2中溶素A和溶素B的位置互换。这与先前发现一致[43]，表明重新排序模块组件可能削弱抗菌活性。与先前描述的单独LysA或LysB酶的生长抑制效应的报告相比，本研究中具有较少模块和仅一种酶的库，如OMP-LysA或OMP-LysB，未达到我们实验中应用的筛选阈值(图1)。这些结果似乎表明两种酶和PTD的存在对构建体的效力起着重要作用。先前将单独酶LysA或LysB与OMP和PTD融合的尝试未能实现完全的杀菌效果[27]。尽管PTDs主要以穿过真核细胞膜而闻名，但一些PTDs(如TAT45-57、穿膜素或富含精氨酸的序列)可以与具有富含脂质细胞壁的分枝杆菌膜相互作用并穿透[33]。PTDs可能促进与分枝杆菌表面的结合，促进进入细菌细胞质，并破坏膜完整性，导致杀菌效果[33,44]。

另一个有趣的观察是活性命中物对革兰氏阳性细菌红球菌和诺卡氏菌的生长抑制活性，两者都是已知具有富含MA细胞壁的分枝杆菌目的成员。对其他革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌缺乏活性，尽管OMPs来源多样，表明观察到的选择性主要归因于LysA和LysB酶。随后对BCG的细胞裂解物筛选将活性命中物数量减少到123个，其中92个变体对耻垢分枝杆菌和BCG均表现出高生长抑制(见图S1)。

对92种分枝杆菌溶素变体在大肠杆菌中的表达尝试仅产生33种可溶形式的蛋白质，其余不溶，需要进一步筛选条件进行生产。纯化后，主要来自库1的可溶性分枝杆菌溶素变体的抗分枝杆菌活性得到验证，从而确定了五种最有效的候选物：MCL-11、-12、-17、-20和-22，对10^6 CFU/ml的牛分枝杆菌BCG的MIC值范围为1.28 μg/ml(相当于30.5 nM)的MCL-17至6 μg/ml(193 nM)的MCL-20和MCL-22。这些MIC值与一线药物如利福平(0.05-0.1 μg/ml或61-122 nM)和异烟肼(0.02-0.2 μg/ml或146-1469 nM)对抗牛分枝杆菌的MIC值相当[45]。

有趣的是，分枝杆菌噬菌体BTCU-1的单独LysA和LysB酶的外源应用据报道既无协同也无相加的抗菌效应，强调了将多个功能模块融合成单一蛋白质构建体的优势[22]。LysA和LysB酶确实在分枝杆菌噬菌体溶菌盒中单独编码，这可能反映了对溶菌的独立时空调控的进化需求。噬菌体适应性取决于延迟溶菌直到病毒体组装完成，而组成型活性融合复合物可能冒提前宿主细胞溶菌的风险，中止感染周期。通过协调LysA表达与内膜上的溶菌孔作用，随后LysB表达，使噬菌体能够独立调节时间和溶菌活性，依次破坏复杂的分枝杆菌包膜[19]。然而，在治疗背景下，这些生物约束可以通过人工将域拴在一起，产生快速、协同的杀菌效果来规避。

活性分枝杆菌溶素中的一个显著特征是LysA-BTCU-1酶的普遍存在，这是一种内溶素，具有肽酶和糖苷水解酶结构域，来自台湾土壤样本中分离的分枝杆菌噬菌体。它还显示出对耻垢分枝杆菌的最小杀菌浓度超过80 μg/ml，并且还减少了感染RAW 264.7巨噬细胞的胞内分枝杆菌数量[22]。在分枝杆菌溶素中识别出相对更多样化的LysB序列，其中许多尚未得到充分表征。表S1-S3显示LysB-D29在结构、体外和体内对分枝杆菌的功效方面仍然是研究最充分的[23,24,46]。很少有研究致力于评估LysB Ms6[23]和LysB-Bxz2[47,48]的抗分枝杆菌活性，而来自不同噬菌体的其他LysA和LysB酶的功能表征有限。LysB-Omega在五种先导分枝杆菌溶素中表现出过度代表性，而LysB-Bxz2存在于MCL-17中，LysB-Saal存在于MCL-22中。LysB-Omega在我们早期研究中显示对长链脂肪酸(月桂酸和棕榈酸)的对硝基苯酯具有最高的特定活性，其次是D29和Saal[25]。LysB-D29在先导候选物中意外缺失可能与融合其他模块时其活性位点的可及性受限有关。

在非酶模块中，TAT45-57结构域最为常见，在28种分枝杆菌溶素构建体中发现，尽管两种具有PTD3的构建体在先导分枝杆菌溶素中被选择(MCL-12和-17)(表1)。关于OMPs，在分枝杆菌溶素中发现了多种序列，其中只有在非洲蛙皮肤中发现的Magainin(存在于MCL-20中)此前报道具有抗分枝杆菌活性，尽管MIC值相对较高[49,50]。E7K_19K_IsCT(一种源自蝎子毒液的肽IsCT的修饰版本)存在于三种先导分枝杆菌溶素中[51]。在连接子中，L1连接子位于30种构建体中，而其余具有L2连接子，表明柔性连接子(6-14 aa)的重要性，已知其促进域运动[28]。我们的分枝杆菌溶素变体结构分析揭示了与LysA-BTCU-1(簇1)和LysA-TM4(簇2)相关的那些之间的显著结构差异，突出了不同LysA变体对独特整体蛋白质折叠和分枝杆菌溶素中结构多样性的贡献。

本研究中确定的先导分枝杆菌溶素的各种特性总结于在线补充信息表S9中。基于特定模块的活性表征显示，尽管LysA-BTCU-1是唯一识别的LysA，但最高的PG水解酶活性在MCL-22中检测到(见在线补充信息图S10A)，表明由与其他模块融合产生的蛋白质折叠和相互作用的作用。另一方面，携带LysB-Bxz2的MCL-17显示出最高的酯酶活性(见在线补充信息图S10B)，而携带E7K_19K_IsCT和PTD3的MCL-12表现出最高的外膜和内膜通透化活性(见在线补充信息图S11和S12)。

对于体外和体内功效及稳定性测试，五种先导分枝杆菌溶素在无内毒素大肠杆菌中生产。这些蛋白质对NTM临床分离株鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌表现出生长抑制活性，但与BCG相比MIC值较高。对缓慢生长(牛分枝杆菌BCG)和快速生长(脓肿分枝杆菌)病原体的抑制存在显著差异，这可能与不同菌株中心磷脂和磷脂酰肌醇甘露糖苷表达的变异有关[52]。最近的初步数据显示LysB-Ms6(与荧光蛋白融合)与缓慢生长结核分枝杆菌细胞的结合数量(平均78.8%)高于快速生长耻垢分枝杆菌种群的40%[53]。结合亲和力的差异可能是由于物种间的细胞壁结构差异，例如耻垢分枝杆菌包膜中存在糖脂肽和结核分枝杆菌上的疏水脂质如分枝菌酸二霉菌酸酯[54,55]。这些观察表明，应直接针对此类菌株筛选表现出对快速生长分枝杆菌更高效力的分枝杆菌溶素。

除了功效外，稳定性与安全性是多结构域分枝杆菌溶素作为有效治疗剂发挥功能的关键特性，特别是对抗胞内病原体。蛋白质功能的丧失可能由于储存或应用过程中各种降解机制而发生，通常通过包含稳定赋形剂或蛋白质修饰来克服。与白蛋白结合域的融合已被证明是延长蛋白质药物(包括内溶素)在血清中半衰期的有用策略[56]。MCL-11、MCL-12和MCL-17的血清稳定性测试显示，分枝杆菌溶素在人血清中孵育几小时后保留了对抗分枝杆菌的显著活性(图5)，支持其在严重分枝杆菌感染中静脉给药的潜力。这些蛋白质在冷藏储存至少6个月期间在溶液中也表现出显著稳定性，无任何聚集或抗分枝杆菌活性损失。需要对分枝杆菌溶素在各种环境参数下的稳定性进行进一步表征，以设计合适的治疗配方。

溶素已知选择性靶向细菌细胞壁，同时不损害人类细胞。与关于分枝杆菌溶素与人类细胞相容性的早期报告一致[29,36]，我们使用人原代巨噬细胞的分枝杆菌溶素测试显示出最小的细胞毒性。对非人类酶治疗更重大的挑战是免疫原性，例如分枝杆菌溶素可能引发适应性免疫反应，融合连接点的创建可能产生原生酶中不存在的新表位。关于噬菌体内溶素的先前研究表明，虽然产生抗溶素IgG抗体，但它们很少中和催化活性，因为活性位点通常隐藏在抗体无法接近的深裂缝中[57-59]。然而，这一点需要针对本研究中的分枝杆菌溶素进行调查，如有必要，可能需要考虑去免疫化策略，如PEG化或包封[60]。

由于足够的胞内浓度对抗分枝杆菌有效至关重要[61]，能够积累在非人巨噬细胞中的化合物更有可能对结核分枝杆菌表现出高功效。早期研究报道LysB-D29对多重耐药结核分枝杆菌具有强效杀菌作用，以及其靶向小鼠巨噬细胞内病原体的能力[24]。一般来说，将溶素与PTDs融合已被证明是靶向病原体的有效策略，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、牛乳腺炎病原体无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌[62]，以及大肠杆菌K1[36]。本研究中开发的嵌合分子也保持了胞内细菌消除的能力(图6)，可能归因于PTD结构域的存在。

受到体外结果的鼓舞，我们继续使用小鼠皮肤和肺部感染模型在体内评估三种分枝杆菌溶素的功效。选择鸟分枝杆菌作为测试病原体，因为它通常与肺部、淋巴和胃肠道感染相关，但像其他NTM一样，也可引起皮肤疾病[63]。我们采用顺序、多部位体内方法提供分枝杆菌溶素抗菌活性的初步概念验证，为后续临床试验做准备。首先使用伤口感染模型，其中药物和细菌直接接触，随后在更复杂的肺部模型中进行研究，分枝杆菌溶素必须克服多个屏障才能到达目标细菌。LysB-D29此前已在溃疡分枝杆菌(布鲁里溃疡的病因)感染的小鼠足垫模型中显示减少细菌负荷[46]，以及在急性脓肿分枝杆菌(Mab103)感染的肺部模型中[64]。

我们的发现清楚地证明了分枝杆菌溶素对抗鸟分枝杆菌的强效单独抗菌活性，以及与利福平联合使用时的协同效应。在候选物中，MCL-20(Magainin–LysB-Omega–L1–LysA-BTCU-1–TAT45-57)在治疗皮肤和肺部鸟分枝杆菌感染方面表现出最有效，分别给出4.4和2.15个对数单位的病原体减少。MCL-20观察到的卓越体内功效与体外表型和分枝杆菌溶素的特定模块活性相反，表明测量的体外效力未能捕捉到复杂宿主-病原体-免疫环境中的功效[65]。这种不一致在工程内溶素研究中越来越被认可[60,66]。最近的评论强调，多结构域内溶素功效关键取决于模块间通信和膜可及性，而不是峰值催化率[67]。内溶素-肽融合"Artilysins"的开创性研究表明，与无法到达PG底物的高活性酶相比，适度酶活性结合最佳膜可及性优于高活性酶[26,30]。MCL-12(其次是MCL-17)与体内模型中的较低体内效力相比的卓越膜破坏活性可能归因于快速血清清除和有限的胞内持久性[35]。另一方面，MCL-20的顺序动力学(OM/IM比值=48.1)和适度酯酶活性可能表明针对巨噬细胞介导的胞内递送而非立即膜破裂的优化。MCL-20与MCL-12和MCL-17组合相比观察到的与利福平的卓越协同作用进一步支持了通过免疫调节参与而非直接酶活性实现持续胞内存在从而放大抗菌活性的机制[26]。

尽管肺部模型的研究时间相对较短，使其不能代表慢性感染如结核病，但它提供了重要的初步证据，支持分枝杆菌溶素的可行性，并为未来在更长的慢性肺部感染模型中的工作以及随后的临床试验奠定基础。鼻咽定植模型可能是另一个潜在的体内模型(如先前对其他细菌病原系统报道的[68-70])，用于研究分枝杆菌溶素对抗能够定植上呼吸道的非结核分枝杆菌的功效。鉴于当前一线疗法的胞内功效可变[71]，需要进一步研究分枝杆菌溶素与既定结核病治疗之间的潜在协同作用，例如对抗利福平耐药结核分枝杆菌，旨在减少分枝杆菌感染的治疗时间并解决抗生素耐药性问题。

结论

我们报告了开发具有高特异性的工程分枝杆菌溶素，针对分枝杆菌目和对抗临床相关分枝杆菌物种的强效活性。通过将外膜通透化肽与噬菌体衍生的酶LysA和LysB融合，这些工程蛋白有效地靶向分枝杆菌细胞包膜的多个层，导致细菌快速裂解。包含PTD进一步实现临床相关浓度下的胞内杀灭，从而解决传统抗分枝杆菌药物的主要限制。先导变体表现出血清稳定性、对人巨噬细胞的低细胞毒性，以及在皮肤和肺部感染模型中的治疗功效，无论是单药治疗还是与一线抗生素联合使用。

除了这些实验发现外，这项研究概述了开发新型抗分枝杆菌治疗药物的实用路线，其作用方式与小分子抗生素不同。分枝杆菌溶素不是抑制单一胞内靶点，而是直接拆解保护分枝杆菌免受治疗的物理屏障。在临床环境中，它们可以作为现有抗生素的辅助用药，以增强难以根除的细菌种群(包括巨噬细胞内的胞内杆菌和位于血流灌注不良病变中的细菌)的杀灭。这种策略有潜力缩短治疗时间，减少累积药物暴露，并限制耐药性的出现，这些都是结核病和非结核分枝杆菌疾病中的关键挑战。

更广泛地说，分枝杆菌溶素平台提供了一个将复杂噬菌体溶菌机制转化为药物样生物制剂的通用蓝图。基于VersaTile的设计能够快速、组合组装和优化酶和肽模块，允许针对不同分枝杆菌物种、耐药谱和递送途径进行系统定制。这种模块化还支持扩展到其他难以治疗的细菌病原体。这些特征共同体现了向可编程、基于蛋白质的抗菌剂的转变，可以针对出现的抗菌素耐药性进行理性工程和迭代。

分枝杆菌溶素的模块化架构还能够系统探索结构-活性关系，并理性优化LysA、LysB和辅助模块，以及为不同临床应用开发递送适应性配方。

尽管需要进一步工作来解决慢性感染模型、免疫原性、药理学和可制造性(见待解决问题)，本研究为基于酶的抗分枝杆菌疗法建立了明确的技术基础。对动物和环境中AMR的"One Health"框架内相互关联的人类、动物和环境储存库具有重要意义的分枝杆菌溶素对抗牛分枝杆菌和鸟分枝杆菌等动物源性和环境分枝杆菌的证明，进一步突出了这种方法的相关性。

待解决问题