工程化改造间充质干细胞以延长健康寿命：治疗潜力、挑战与未来解决方案Engineering Mesenchymal Stem Cells to Extend Healthspan: Therapeutic Potential, Challenges, and Future Solutions[v1] | Preprints.org

1. 引言

健康寿命(healthspan)是指一个人无慢性疾病或残疾、保持良好健康的时期，是衰老研究的核心焦点。间充质干细胞/基质细胞(MSCs)是一类具有免疫调节、再生和营养特性的多能基质细胞，使其成为靶向年龄相关病理和延长健康寿命的潜在治疗手段[1]。这些特性在抗衰老研究中引起了广泛关注，有证据表明MSCs能够调节氧化应激、减轻内皮细胞衰老并促进血管生成[2]。

然而，野生型MSCs的治疗效果受到归巢能力差、在恶劣微环境中存活率低以及功能效力降低的限制，特别是当细胞来源于老年供体时[3]。健康寿命与MSC生物学的相关性在于许多年龄相关疾病的组织层面机制相似，包括慢性低度炎症、血管功能不全、蛋白质稳态受损、线粒体功能障碍、干细胞/祖细胞衰竭、细胞外基质硬化以及衰老细胞的累积。

这些变化共同损害了组织修复和损伤反应，通过减少干细胞自我更新和分化能力，同时通过衰老相关分泌表型(SASP)因子促进促炎微环境。因此，MSC为基础的干预措施颇具吸引力，因为它们可能补充耗尽的祖细胞池、减轻炎症衰老(inflammaging)，并在年龄相关条件下增强内源性修复机制。MSCs不仅作为替代细胞发挥作用，而是作为动态的、对微环境响应的信号平台，通过调整其旁分泌分泌组来响应局部炎症和衰老信号，从而调节衰老的多个相互关联的标志[2,4,5]。

然而，MSCs仍然容易受到复制性和应激诱导的衰老影响，这通常会改变其分泌谱并降低增殖能力[6]。已经开发出多种工程策略来解决这些限制，提高MSC存活率、增殖和促再生能力，从而增强临床表现[7,8]。这些方法包括增加再生因子分泌或增强对不利条件抵抗力的基因和表观遗传修饰，以及增强免疫调节活性的预处理方法[9]。例如，用细胞因子或低氧条件预处理MSCs可改善其分泌谱并增加抗炎细胞因子的产生[10]。

工程化MSCs的理论基础是众所周知的与年龄相关的干细胞效力下降，这会损害组织稳态并限制内源性细胞群的愈合能力[11]。这些限制在病理微环境中进一步加剧。例如，缺血组织以低氧和营养剥夺为特征，降低了MSC存活率；糖尿病伤口含有高水平的晚期糖基化终产物、活性氧、蛋白酶和炎症细胞因子，损害了增殖和分化能力；纤维化组织表现出异常的硬度和整合素信号传导受损，促进适应不良的细胞行为[12-15]。

因此，当前策略着重于通过靶向预处理和基因增强优化MSC活力，以对抗体内观察到的衰老相关分泌表型和功能衰竭[16,17]。衰老的MSCs表现出改变的分泌组组成，可能对组织修复和稳态产生负面影响，因此需要策略来对抗与年龄相关的功能下降[5]。这个问题很重要，因为供体年龄与MSC增殖、分化和免疫调节能力呈负相关，如果将衰老的MSCs用于治疗，可能导致有害的"炎症衰老"结果[14,18]。因此，研究改善MSC功能和减轻细胞衰老负面影响的方法至关重要，特别是在针对老年人群的治疗中[19]。

本综述探讨了优化MSC特性以改善年龄相关疾病结果的先进生物工程策略，重点是克服与年龄相关的功能下降和延长健康寿命。解决供体年龄依赖性MSC功能降低的策略包括从诱导多能干细胞衍生MSC样细胞、应用衰老清除剂去除衰老亚群以及通过分选富集年轻细胞组分，所有这些都旨在恢复增殖和免疫调节能力[1,15,20]。此外，正在研究生物材料基预处理、药理干预和定制培养条件来调节MSC行为并增强治疗特性[21,22]。

本综述重点介绍了三种改善MSC迁移的主要策略：通过基因方法增加趋化因子受体表达(如CXCR4)；使用细胞因子或低氧预处理增强迁移信号；以及通过生物材料工程化细胞表面以促进靶向内皮粘附[23-25]。理解这些策略的区别对于选择最合适的策略来解决与年龄相关的MSC归巢效率下降至关重要，包括衰老微环境中CXCR4表达减少和VCAM-1介导的内皮系留受损[4,15,26]。仔细考虑每种方法的耐久性、安全性和与病理条件的兼容性对于最佳实施是必要的。

2. 未经修饰MSCs的局限性和挑战

原代间充质基质细胞的治疗效用通常受到系统给药后植入和存活不良的限制，因为培养扩增的细胞失去了关键的迁移受体(如CXCR4)[27]。天然MSCs依靠内在归巢受体、应激反应通路和旁分泌线索到达靶组织。然而，在移植到衰老、受损或发炎的组织后，这些机制可能不足。因此，尽管安全性良好，MSCs通常表现出有限的滞留、短暂的持续存在和不一致的功能益处[15,17,26]。此外，这些细胞被单核吞噬细胞系统快速清除，通常被滞留在肺血管中，限制了其向远端靶器官的分布[28,29]。

对于关注健康寿命的应用，归巢机制受损尤为重要，因为治疗细胞必须在慢性疾病组织中发挥作用，这些组织以持续炎症、氧化应激和纤维化重塑为特征，可能加剧肺部滞留和吞噬细胞清除[15,30]。供体间异质性和组织来源异质性由于年龄、遗传、健康状况和来源特异性分泌谱的差异，显著增加了MSC效力的可变性，损害了批次一致性和临床可预测性[9,31,32]。为达到治疗细胞数量所需的广泛体外扩增通常会导致归巢受体表达丧失和代谢可塑性降低[33]。

供体年龄、组织来源、扩增方案、氧张力和炎症刺激通过改变增殖能力、归巢受体表达和免疫调节功能，强烈影响MSC效力[31,34,35]。这些变异使MSC产品标准化复杂化，并挑战了为临床前研究开发可靠的效力测试[30-32]。在老年供体中，MSCs在扩增过程中通常经历加速衰老，导致功能性亚群丧失和增殖与免疫调节潜力降低的克隆增加[4,14,32]。连续传代可能进一步选择出快速分裂但效果较差的克隆，削弱了异质性和治疗多功能性。

这些与年龄相关的变化损害了维持促再生分泌组和免疫调节活性的能力，因为复制性衰老使分泌谱向促炎SASP成分转变，阻碍组织修复[4,5,36]。未经修饰的MSCs在系统或局部给药后表现出低效的归巢和植入，这是由于年龄和扩增相关的趋化因子受体(如CXCR4)下调以及VCAM-1介导的内皮相互作用受损。这些因素导致肺部滞留和被单核吞噬细胞清除[15,23,25,26,30,31]。

静脉输注后，MSCs由于其大小和降低的变形能力而被迅速截留在肺毛细血管中，触发急性炎症反应并在数小时内促进吞噬清除，从而限制了重新分布到损伤或炎症部位[24,30,37]。肺部滞留造成的代谢应激进一步损害了衰老MSCs的分泌功能，减少了免疫调节所需的基本生长因子和细胞因子的系统可用性[38]。这种损害加上复制性衰老，削弱了持续的免疫调节相互作用，并在慢性炎症环境中加剧炎症衰老[15,39,40]。

这些挑战通过阻碍标准化制造、监管效力验证以及在老年患者中的安全系统递送，阻碍了临床转化。供体异质性和扩增诱导的衰老增加了疗效不一致的风险，并可能通过受损的生物分布和清除加剧炎症衰老[14,15,17,31]。严格的质控以及标准化的分离和冷冻保存方案对于减少变异性至关重要[41]。传统的二维单层扩增通过加速衰老、下调CXCR4等归巢受体以及使分泌谱向促炎介质转变，加剧了这些问题[31,32,36]。新兴研究表明，预处理策略(包括低氧暴露或特定生长因子给药)能够增强CXCR4表达并改善MSC归巢效率，从而在临床使用前提高其效力[42]。

3. 工程化MSCs：机制和治疗潜力

已设计多种策略来提高MSC性能，包括基因修饰、microRNA处理、预处理和表观遗传重编程，每种方法都提供了一条改善健康寿命相关结果的独特途径(图1)[43]。这些方法旨在增强关键MSC特性，包括归巢能力、在挑战性生理环境中的存活率以及靶向旁分泌信号。基因修饰通常使用病毒载体引入编码生长因子或抗凋亡蛋白的基因，从而增加MSC存活率和再生因子产生[24,31]。非病毒方法(如核转染和电穿孔)也正在被改进，以递送治疗性基因或调节RNA，为临床应用提供更安全的替代方案[44]。

使用生物正交化学或脂质基涂层的表面修饰策略应与每种疾病中的主要生物学挑战相匹配。例如，在缺血性心血管疾病中，这些修饰可以减少肺部滞留；而在炎症环境中，它们可以降低免疫清除。这种方法可能延长系统循环并改善靶组织中的粘附和功能[45-47]。在缺血性肢体疾病和慢性伤口中，受损的SDF-1/CXCR4信号传导限制了细胞招募，而内皮粘附不良延迟了血管生成和组织修复。疾病定制的表面修饰因此可能增强MSC滞留并改善恢复[7,48]。

对于免疫衰老和炎症性疾病，主要挑战是快速免疫清除和炎症，这源于受体参与不足；在这些情况下，表面修饰应支持持久的抗炎作用并改善与免疫细胞的沟通[14,15,39]。对于神经退行性疾病和虚弱综合征，表面工程可设计用于递送神经营养因子、支持线粒体功能并提供抗衰老囊泡。这些例子强调了需要机制驱动的、疾病特异性的MSC平台，而非一刀切的方法[43,49,50]。

4. E-选择素超强化MSCs

基因工程可以通过引入粘附分子(如E-选择素)来增强MSCs，从而提高它们归巢到和持续存在于靶位点的能力。在这种方法中，使用腺相关病毒(AAV)介导的转导在鼠骨髓衍生MSCs中诱导E-选择素的表面表达。E-选择素基因修饰显著增强了MSCs的治疗表型和功能。未经修饰的MSCs不表达E-选择素；然而，经过AAV介导的E-选择素工程化后，MSCs获得了更强的MSC表型，包括关键MSC标志物CD44和CD105的稳健上调，同时保留了其他标准MSC标志物(如CD29、CD73和Sca-1)的表达[94]。重要的是，E-选择素工程化MSCs保持了其基本的干细胞/基质细胞特性，包括集落形成能力、增殖能力和向软骨形成、成骨和脂肪形成的三系分化潜力。因此，E-选择素工程化增强了MSC身份和效力，而不损害其固有多能性[93,94]。图2总结了这一策略，追踪了从传统MSCs通过AAV介导的E-选择素工程化到由此产生的超强化表型及其在缺血组织中增强的治疗功能的转变过程。

在功能上，与对照MSCs相比，E-选择素工程化MSCs表现出卓越的再生和促血管生成活性。在缺血性伤口模型中，用E-选择素工程化MSCs治疗显著加速伤口闭合，促进完全再上皮化，增加胶原沉积，并增强缺血性伤口内的血管密度94。这些细胞在缺血组织中也显示出改善的存活率和持续性，表明E-选择素修饰增强了MSC在恶劣缺血微环境中的活力和治疗耐久性。总的来说，这些发现表明E-选择素工程化将传统MSCs转变为更具效力的再生细胞产品，具有增强的组织修复和血管生成能力。因此，E-选择素阳性的MSCs被恰当地称为"超强化MSCs"[94,95]。

这些细胞与缺血组织中的内皮配体强烈相互作用，这改善了细胞滞留，促进新生血管形成，并增加了Cxcl2等促血管生成基因的表达[45,94,95]。研究表明，E-选择素工程化在体外增加了九个促血管生成基因(包括Cxcl2)的表达，并在肢体缺血模型中减少肌肉萎缩的同时增强新生血管形成[13,45,94]。除了增强组织粘附外，E-选择素还充当信号分子，增加促血管生成基因(包括Cxcl2)的表达，并减少TNF等炎症介质。这些作用促进有益旁分泌因子的释放，改善细胞存活，并增强缺血组织中的新生血管形成[13,45,94]。

这些细胞与缺血组织中的内皮配体强烈相互作用，这改善了细胞滞留，促进新生血管形成，并增加了Cxcl2等促血管生成基因的表达[13,45,95]。研究表明，E-选择素工程化在体外增加了九个促血管生成基因(包括Cxcl2)的表达，并在肢体缺血模型中减少肌肉萎缩的同时增强新生血管形成[96,97]。除了增强组织粘附外，E-选择素还充当信号分子，增加促血管生成基因(包括Cxcl2)的表达，并减少TNF等炎症介质。这些作用促进有益旁分泌因子的释放，改善细胞存活，并增强缺血组织中的新生血管形成[13,45,96]。

通过重塑分子微环境，这种方法解决了标准MSC疗法在严重组织损失方面的关键限制[98]。未来的研究应该确定E-选择素是否改变了MSC分泌组，招募宿主内皮或免疫细胞，主要通过细胞滞留或旁分泌激活发挥作用，以及在转基因表达下降后其益处是否持续。这些研究将有助于确定超强化是否应主要关注粘附、旁分泌激活或两者兼而有之[13,94,96]。

5. 工程化MSC产品的制造、效力和监管考虑

工程化MSCs的临床转化与其生物学原理一样依赖于制造策略。在生产过程中，MSCs可能发生复制性衰老和克隆选择，即使典型表面标志物保持稳定，也会降低多能性并使分泌组转向促炎谱型[32,99]。每个额外的工程步骤都会引入潜在的变异性。因此，标准化培养方法和各批次之间严格的生物等效性测试对于减少表型漂移并保持与预期作用机制一致的治疗效力至关重要[100,101]。

由于工程化MSCs可能仍然归巢效率低下，有效递送可能需要高细胞剂量。这增加了肺栓塞、微血栓和血管阻塞的风险，特别是当输注参数未优化时[30,102-104]。供体和受体的年龄相关变化可能进一步恶化生物分布并降低再生效果[30]。由于只有很小一部分给药细胞通常能够植入，可能需要重复治疗；然而，重复扩增和给药会加速MSC衰老并降低信号能力[105,106]。

低氧预处理和优化的递送策略可能有助于缓解这些限制[106]。尽管如此，供体变异性以及延长的体外扩增仍然是生产用于可靠临床结果的一致、高效力MSC产品的重大障碍[107]。效力测试应超越表面标志物分析，包括反映工程化细胞如何与患病组织相互作用的多参数功能测定[108]。未来的验证应纳入分泌组谱和细胞表面配体密度的实时监测，以将批次变异性保持在安全有效的限度内[5]。

监管机构对基因工程MSCs的期望通常高于对最小操作产品的期望。当使用病毒载体时，测试必须检测复制能力病毒并仔细评估插入突变或致瘤的风险[88,109]。基因组编辑产品需要全面的脱靶分析、整合位点评估和克隆扩增监测，以确保遗传稳定性和安全性[88,110]。

对于表面工程化MSCs，主要监管重点是通过功能测定确认短暂的表面变化(如改善的选择素结合)，这些测定证明了改善的归巢能力。这些产品通常不需要与基因组编辑细胞相同的基因组整合或脱靶分析[88,111,112]。对于MSC衍生EV产品，监管重点是囊泡身份、过滤后的纯度和无菌性，以及证明一致分泌组活性的效力测定[87,113,114]。在所有情况下，产品开发应包括具有明确定义的关键质量属性接受范围的清晰控制策略。

6. 解决工程化间充质干细胞局限性的策略

工程化MSCs精确递送到靶组织和器官仍然是一个主要挑战。添加CCR7等趋化因子受体的基因修饰可以将MSCs引导至淋巴组织，以实现更好的靶向[115]。用IFN-gamma等细胞因子预处理MSCs可以在不需要广泛基因操作的情况下增强其内在免疫抑制活性和在炎症环境中的存活率[116]。使用MSC分泌组(特别是细胞外囊泡)作为无细胞治疗平台可能避免与活细胞移植相关的风险，包括肿瘤形成和细胞存活率差[87]。

确定将人E-选择素递送到靶组织的最佳方法也将很重要，无论是通过基因修饰还是蛋白质工程，以实现在不损害MSC功能或治疗潜力的情况下的有效表面表达。诱导表达系统允许对治疗蛋白生产进行时空控制。这些系统能够精确调整基因表达，减少脱靶效应并限制长期免疫反应[117]。它们还可以微调粘附分子表达，从而改善归巢同时最小化免疫激活[118]。此外，诱导系统可以适应疾病特异性条件的蛋白表达水平，使MSC疗法更加精确。

优化MSC培养条件有助于保持功能和治疗效力。适当的培养基、支架材料和生物反应器配置可以支持免疫调节和分化能力，以及工程化表面分子的表达[109]。控制工程化分子表达的时间和持续时间也可能减少免疫反应同时保持MSC的天然益处。例如，表面蛋白的短暂岩藻糖基化可以改善MSC向炎症组织的靶向和滞留，并可能提高治疗效果[73,76]。

生物材料支架和定向递送系统可以将MSCs定位于靶组织，减少系统分散并改善治疗结果。例如，可注射水凝胶和聚合物纳米粒子复合物可以将工程化MSCs保留在局部治疗部位。通过模拟细胞外基质的某些方面，这些材料支持MSC存活和功能，同时减少遗传风险并可能改善可扩展性和免疫相容性[1,25,119]。它们还可以装载免疫抑制剂来塑造局部微环境并延长MSC滞留和活性[9]。

CRISPR/Cas9等先进基因编辑工具能够进行精确的修饰，提高MSC治疗性能。这些工具允许靶向插入或删除基因以增强免疫调节、存活或组织靶向，同时减少与旧病毒方法相关的限制[115]。此类修饰可以创建稳定的、可遗传的变化，可能提高MSC产品用于临床应用的安全性和有效性[120]。此外，工程化MSCs产生免疫抑制因子或抑制补体和NK细胞活性的分子可能进一步减少免疫排斥[83]。

7. 延长健康寿命的未来解决方案和临床转化

未来用于延长健康寿命的MSC工程化方法可能会结合策略来改善靶向、持续性和对衰老的抵抗力。增加衰老抵抗力的基因修饰，结合支持恢复活力的生物材料，可能在支持年龄相关疾病中的再生和免疫功能的同时防止细胞下降[41,52,90]。

对于以高血糖、氧化应激和血管生成受损为特征的糖尿病伤口，MSCs可能需要被工程化以释放更高水平的血管生成因子(如VEGF或ANG1)。靶向表面修饰或水凝胶包封可以帮助局部保留这些细胞并改善血管化，而短暂或无细胞格式可能有助于维持安全性[13,110,121,122]。另一个有前景的方向是使用生物工程MSC衍生细胞外囊泡(EVs)开发无细胞疗法。

这些囊泡可以被设计用于靶向药物递送或增加在血液中的稳定性，这可能提高治疗效用[123]。MSC衍生EVs可能避免与活细胞移植相关的致瘤性和免疫反应风险[9]。对于虚弱和与年龄相关的状况，具有抗炎活性的EV富集产品可能特别有价值。MSC-EVs也很有吸引力，因为它们可以大规模生产并比亲本细胞产品更精确地表征，有助于确保临床一致性[124]。为了进一步提高精确度，研究人员还使用CRISPR-Cas9创建具有稳定活性和减少供体间变异性的永生化细胞系[87,125]。

尽管这些方法很有前景，但临床健康寿命延长仍然具有挑战性。长期监测对于确保安全性至关重要，特别是关于致瘤风险[9,126]。基于迄今为止MSC为基础的疗法的代表性临床试验和转化经验(表1)，仍然需要大型随机试验来定义有效剂量并确认可重复性。在广泛临床使用前，还需要用于质量控制的标准化方法来测量细胞外囊泡的分泌组和生物物理特征[31,127]。最后，考虑到年龄相关受体生物学和干细胞产品批次间变异性的监管指南对于降低老年患者治疗失败风险至关重要[35,39]。

8. 安全性、研究设计和临床终点考虑

彻底的临床前测试和标准化制造对于保持细胞治疗产品的一致性和降低风险是必要的。新的基因修饰工具，包括先进的病毒载体和RNA沉默方法，正在改善MSC工程化，并可能支持开发广泛可用的现成MSC疗法[138]。未经修饰MSCs的安全性已在1200多项针对多种条件的临床试验中进行了评估[30,139,140]。

为了安全使用工程化MSCs，需要一致的制造和严格的临床前验证，以便将增强特性转化为健康寿命导向的疗法。研究设计应考虑许多MSC产品在体内持续时间有限，而年龄相关疾病通常是慢性的。因此，试验应包括生物衰老和组织恢复的替代生物标志物，而不是仅依赖基于死亡率的终点。六分钟步行测试等功能性测量可能在选定环境中很有用[141]。

研究还应评估多药治疗和可能影响老年合并症患者MSC效力的可能药物-细胞相互作用[142]。最后，基因-环境相互作用的数据驱动分析可能有助于识别新的治疗靶点并在衰老过程中维持免疫调节。在健康寿命导向的试验中，主要结果应既有临床意义又具有疾病特异性。

这些终点应包括身体功能和生物衰老的客观测量，如减少衰老相关分泌表型或逆转与年龄相关的免疫重塑，以评估老年人的治疗效果[14,15]。研究还应监测衰老细胞清除和系统后果，因为MSC疗法与预先存在的分泌表型之间的相互作用仍然是治疗反应的重要决定因素[19,51]。

9. 结论

当前研究和临床研究表明，工程化MSCs可能对免疫疾病、骨和软骨损伤以及神经系统疾病等状况有益[126,143]。然而，未经修饰的MSCs通常表现出不良的组织靶向、有限的持续存在、供体间变异性以及在衰老或炎症环境中的功能下降。工程化方法可以通过改善存活率、归巢、旁分泌信号传导、衰老抵抗力和制造一致性来解决这些限制。

在使MSC为基础的疗法安全、有效和可重复方面仍然存在重要挑战。这些挑战需要强大的质量控制、标准化制造和风险缓解策略来改善临床结果[144-146]。需要额外的临床前和临床研究来理解长期影响并优化工程化MSCs的递送，特别是针对炎症和与年龄相关的代谢疾病[39]。

E-选择素超强化MSCs说明了如何通过修饰细胞粘附来增强组织修复，而HCELL糖工程则通过向CD44添加E-选择素配体提供了一种非基因策略。这两种方法都强调了MSC疗法中细胞迁移的重要性，并可以为设计更有效的再生治疗提供信息。该领域的进展将需要整合工程学、衰老生物学、效力测试、可规模化制造和精心设计的临床试验。

诸如诱导自杀系统等安全特性可能通过允许临床医生在给药后控制细胞生长和持续性来改善基因工程MSCs的安全性[145]。尽管取得了这些进展，但仍需要改进的非病毒基因递送方法，包括脂质纳米粒子和聚合物聚复合物。这些方法避免了基因组整合，可能比病毒载体更安全，但必须在难以转染的MSCs中保持高效[44,147]。

工程化MSCs和MSC衍生EVs可能支持组织修复和健康寿命延长，但它们的成功将取决于明确定义的作用机制、可靠的制造、严格的安全评估和具有临床意义的终点。炎症响应性或强力霉素诱导启动子可能只在需要时允许细胞释放免疫调节因子，减少脱靶效应、免疫反应和毒性[148,149]。随着改进的质粒设计和细胞准备方法，这些进展可以使工程化MSC疗法更加精确和临床有效[150,151]。

缩略语

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