克雷伯氏菌Michiganensis是一种属于克雷伯氏菌属的细菌，是构成克雷伯氏菌oxytoca复合体的九个物种之一。克雷伯氏菌Michiganensis已被确认为一种新兴的医院内病原体，包括含有碳青霉烯酶编码基因的临床分离株。这种可能的新兴病原体迄今为止已在多个国家的临床环境中被记录。尽管克雷伯氏菌Michiganensis可以在多种自然栖息地中找到，但这些生物的环境储存库尚未得到充分研究。克雷伯氏菌Michiganensis分离株也在废水中被发现，表明沿海地区的城市和医院废水可能是人类感染的潜在原因。
克雷伯氏菌Michiganensis有可能感染人类，特别是那些免疫系统受损或有基础医疗问题的人。众所周知，克雷伯氏菌Michiganensis会引起呼吸道感染、尿路感染（UTIs）和血流感染。这些感染在医院中尤其麻烦，因为患者由于基础医疗状况、外科手术或使用侵入性医疗设备（如导管和呼吸机）可能更容易受到细菌感染。有效的药物可以通过提供可靠的治疗选择来改善患者的预后和安全性。
为了应对多重耐药克雷伯氏菌Michiganensis这一日益严重的威胁，我们的研究采用了减法蛋白质组学方法来识别潜在的治疗靶点。这种方法涉及系统地减去与人类宿主和肠道微生物群共享的蛋白质，以隔离对病原体生存至关重要的蛋白质及其独特的代谢通路，从而最大限度地减少潜在的脱靶效应。我们确定了两个关键的蛋白质靶点：WP_004097788.1（复制性DNA解旋酶）和WP_219541799（双功能磷酸核糖氨基咪唑羧化胺甲酰转移酶/IMP环化水解酶）。这些蛋白质分别对细菌DNA复制和嘌呤生物合成至关重要，进而影响细菌的生长和繁殖。靶向WP_004097788.1可以阻碍DNA复制，阻止细胞分裂，而抑制WP_219541799则会破坏嘌呤生物合成，损害RNA和DNA的合成，最终限制病原体的增殖能力。通过计算对接研究，我们发现了来自甜菜和灵芝属物种的天然产物配体，它们对这些靶点表现出高结合亲和力。这些发现符合我们的研究目标，即为这些蛋白质识别候选抑制剂，为开发针对克雷伯氏菌Michiganensis的新治疗剂奠定了基础。通过专注于这些基本且独特的蛋白质靶点，我们的研究为开发针对这种危险病原体的有效治疗方法提供了有希望的方向。需要进一步的研究来实验验证这些化合物的生物活性。
方法和材料
数据检索
从NCBI下载了克雷伯氏菌Michiganensis THO-011的基因组。
ORF预测
利用Glimmer3预测克雷伯氏菌Michiganensis基因组中的开放阅读框（ORF），指定起始密码子根据GenBank翻译表条目和标准的GenBank翻译表，“atg, gtg, ttg”以逗号分隔列表指定终止密码子。
翻译
使用EMBOSS套件中的“Transeq”工具将预测的基因转化为氨基酸序列。
识别和删除重复蛋白质
使用CD-HIT工具套件去除序列冗余并获得非冗余蛋白质数据集。
非同源蛋白质识别
使用DIAMOND软件将病原体蛋白质序列与人类蛋白质数据库进行比较，使用BlastP算法。
必需基因预测
利用Geptop 2.0服务器确定对病原体生存至关重要的基因。
比较通路分析和独特通路识别
使用KEGG数据库和KEGG自动注释服务器（KAAS）进行病原体和人类之间的比较通路分析。
亚细胞定位预测
使用PSORTb网络服务器预测所得蛋白质的亚细胞定位。
毒力蛋白识别
使用VFDB资源进行蛋白质毒力预测。
蛋白质可药性潜力
利用DrugBank 3.0数据库探索潜在的药物靶点。
针对肠道微生物群蛋白质的筛选
进行了序列相似性分析，以调查病原体蛋白质与肠道微生物群之间的潜在相互作用。
虚拟筛选和ADMET分析
从LOTUS数据库获取包含10,000种化合物的天然产物库，并使用LigPrep工具准备用于虚拟筛选。
分子动力学模拟
使用Desmond运行100 ns的模拟，分析复合物的蛋白质确认和配体稳定性。
结果
蛋白质组减法分析
从NCBI数据库检索到克雷伯氏菌Michiganensis THO-011的基因组。在初始步骤中，预测了开放阅读框（ORFs），显示基因组中共有4024个ORFs。准确的ORF预测对于解读生物体的基因组结构和识别潜在基因和功能元件至关重要。使用“Transeq”工具将预测的基因翻译成氨基酸序列，生成完整的蛋白质数据集用于下游分析。使用CD-HIT工具套件以60%的身份阈值去除冗余序列，从最初的4024个中得到了2957个非冗余蛋白质。然后使用DIAMOND进行BlastP分析，e值截止值为0.00001，识别非同源蛋白质，获得了2427个命中。使用Geptop 2.0服务器进一步分析，从2427个非同源蛋白质中识别出180个必需基因，这些基因很可能对病原体的生存至关重要。
唯一通路识别
对非同源必需蛋白质进行了额外的比较代谢通路研究。选择的蛋白质被用来确定它们所关联的代谢通路。这项研究是为了基于常见和重要细菌通路酶发现治疗靶点。选择了那些独特于克雷伯氏菌Michiganensis且未在人类中发现的代谢通路。因此，选择了46个具有独特代谢通路的蛋白质用于未来分析。
亚细胞定位和毒力
由于蛋白质可能定位于各种细胞区室，亚细胞定位是识别潜在治疗靶点的关键因素。在这项研究中，对46个选定蛋白质进行了进一步分析，以确定它们在细菌细胞内的定位。结果显示，32个蛋白质位于细胞质中，其余与细胞质膜相关。细胞质蛋白质可以用作药物靶点，所以对这32个细胞质蛋白质进行了下游分析，而其他蛋白质则被丢弃。然后对这些蛋白质进行了VFDB分析，发现16个细胞质蛋白质具有毒力。
可药性分析
可药性是评估潜在治疗靶点的另一个重要标准。它指的是小分子化合物有效调节靶标蛋白质功能的可能性。为了评估克雷伯氏菌Michiganensis毒力相关蛋白质的可药性，将其序列与DrugBank数据库中列出的已知药物靶标进行了比较。分析确定了两个克雷伯氏菌Michiganensis蛋白质显示出与FDA批准的小分子药物靶标的强相似性。
结构验证、ADMET和分子对接
使用ERRAT质量因子和Ramachandran图验证了从AlphaFold获得的目标蛋白质的3D结构质量。对于ERRAT得分，一个良好的模型通常表现出大约91%的整体质量因子。WP_004097788.1的ERRAT质量因子为96.33%，而WP_219541799的ERRAT质量因子为98.50%。同样，WP_004097788.1和WP_219541799的Ramachandran图显示，95.6%和95.8%的残基处于有利区域，而没有残基出现在不允许区域。然后将准备好的天然化合物对接到这两种蛋白质上，并选择了结合亲和力更强的化合物进行进一步分析。在分子对接研究中，DrugBank靶标化合物被用作对照配体。在WP_004097788.1的对接分析中，对照化合物的结合亲和力范围为-4.127至-2.736 kcal/mol，而选定的天然产物表现出更强的亲和力，范围为-6.125至-5.789 kcal/mol。类似地，对于WP_219541799，对照化合物的对接得分介于-3.78和-3.02 kcal/mol之间，而选定的天然产物达到了-6.388和-5.692 kcal/mol的更高结合亲和力。仅选择了20个化合物中清洁度最高的ADMET配置文件的两个最佳化合物用于MD模拟。
分子相互作用和模拟分析
基于glide评分，LTS0037797和LTS0037810分别被选中用于WP_004097788.1和WP_219541799的进一步MD模拟研究。
WP_004097788.1
在所有针对WP_004097788.1测试的天然化合物中，LTS0037797表现出最高的结合亲和力。详细分析其分子相互作用揭示，该化合物形成了七个氢键，残基分别是Gln222、Arg192、Gly338、Ile337、Lys254、Leu375和Gln376。此外，它还与Pro223形成疏水相互作用。在整个模拟过程中，apo蛋白的Cα原子保持RMSD值在约6-7 Å范围内，而复合物则表现出更高的RMSD值，在10-12 Å范围内波动。RMSF结果表明，大多数残基在模拟过程中没有表现出显著波动，因为RMSF值在整个模拟过程中都低于2 Å，表明配体并未引起蛋白质的波动，因为复合物的RMSF值低于apo蛋白。Asp124在所有残基中显示出最大相互作用，观察到在87%的快照中存在该相互作用。此外，使用Prime-MMGBSA模块计算了复合物的结合自由能。此总能量由范德华力、库仑力、溶剂化和共价相互作用的共同贡献得出。具体而言，范德华力能量贡献为-31.43 kcal/mol，溶剂化能量为-11.18 kcal/mol，共价能量占9.37 kcal/mol，库仑能量为1.68 kcal/mol。结果，复合物的整体结合自由能确定为-58.38 kcal/mol。
WP_219541799
WP_219541799的对接分析显示，LTS0037810在所有测试配体中具有最高的结合亲和力，成为进一步研究分子相互作用和稳定性的首选候选者。相互作用分析显示，LTS0037810与六个氨基酸残基Ser248、Glu241、Asp378、Asp269、Phe379和Tyr239形成氢键。此外，它与Ala250建立了疏水相互作用，并与Arg391建立了π-阳离子相互作用。C-alpha原子的RMSD分析显示，apo蛋白和复合物在模拟的前半段均在约5到7 Å范围内保持稳定，后半部分略有增加至7-8 Å。RMSF结果显示，apo形式在整个模拟过程中比蛋白质-配体复合物经历了更大的波动。在蛋白质-配体接触分析中，参与氢键形成的残基包括Ala237、Tyr239、Ser248、Ala250、Tyr262、Asp269、Leu377、Asp378、Phe379和Lys380。特别值得注意的是，Asp269和Asp378也参与了离子相互作用。其中，Ala250显示出最一致的相互作用，在96%的模拟帧中出现。该复合物的结合自由能计算为-41.26 kcal/mol，各能量贡献如图所示。
讨论
一些细菌，包括克雷伯氏菌Michiganensis，可能对多种抗生素产生抗性，使得感染难以治疗。这可能导致发病率、死亡率和医疗成本增加。有效的药物对于解决与细菌感染相关的公共卫生问题至关重要。为了应对这种危及生命的情况，迫切需要立即开发针对克雷伯氏菌Michiganensis的药物。
我们在研究中使用了减法蛋白质组学方法来筛选针对克雷伯氏菌Michiganensis的治疗候选物。这种方法用于基于识别病原体内的必需和非同源蛋白质来确定靶点。我们创新的减法蛋白质组学方法精确指定了对生存至关重要的病原体特异性蛋白质，同时尽量减少了与人类宿主的潜在交叉反应，这是精准药物设计中的关键一步。识别治疗靶点是计算机辅助药物设计技术中的重要阶段。生物信息学和计算生物学领域的最新突破导致了许多药物设计和计算机分析方法的发展，减少了分配给药物开发的时间和成本。
从NCBI下载了克雷伯氏菌Michiganensis THO-011的基因组。最初阶段是从克雷伯氏菌Michiganensis基因组中确定了4024个ORFs，随后将其翻译成氨基酸序列。基因组中的ORF预测是基因组学和生物信息学中的一个重要步骤。ORF预测的准确性对下游分析如功能注释和比较基因组学有重大影响。必须降低蛋白质数据库中的较高冗余。当同一数据集中存在一个或多个同源序列时会产生冗余。此类序列会在特定分析中引入不必要的偏差。因此，使用CD-HIT评估了这4042个翻译后的蛋白质，去除所有冗余蛋白质并提供了2957个非冗余蛋白质。这些蛋白质可能是人类同源物，可能会干扰人类代谢并致命。选择非同源蛋白质可以限制潜在的交叉反应以及不良后果。因此，去除同源蛋白质，考虑了2427个蛋白质进行进一步分析。细菌生活需要必需蛋白质的存在，如果这些必需蛋白质受损或改变，它们就无法生存。因此，通过靶向这些蛋白质可以杀死细菌。细菌必需基因研究有助于理解生命的本质，并确定治疗病原体疾病的新药物靶点。Shilpa S.等人在Eubacterium nodatum中发现了807个必需蛋白质，Sakharkar等人在铜绿假单胞菌中发现了306个必需基因，Chan-Eng Chong等人在类鼻疽伯克霍尔德菌中发现了312个必需蛋白质。因此，进行了基因必需性分析以寻找病原体蛋白质组中的此类基因。
通过比较人类和病原体的代谢通路，使用KEGG数据库验证了必需性，结果显示23个通路与46个必需蛋白质独特对应于病原体。这些通路包括：阿米巴病、各种植物次生代谢物的生物合成、β-内酰胺抗性、叶酸的一碳池、安莎霉素的生物合成、鞭毛组装、大肠杆菌生物膜形成、萘降解、甲烷代谢、单内酰胺生物合成、氯代烷烃和氯代烯烃降解、光合生物的碳固定、双组分系统、细菌分泌系统、脂多糖生物合成、Caulobacter细胞周期、肽聚糖生物合成、万古霉素抗性、群体感应、霍乱弧菌生物膜形成、人乳头瘤病毒感染、赖氨酸生物合成、病毒致癌。病原体特异性通路识别的结果与钩端螺旋体、鲍曼不动杆菌和腐生葡萄球菌一致。因为蛋白质亚细胞定位对药物发现、蛋白质功能和基因组注释预测至关重要。确定了46个蛋白质中的32个细胞质蛋白质。由于纯化和分析膜上蛋白质的困难，细胞质蛋白质更适合作为治疗靶点。然后评估这些蛋白质的毒力和可药性因素。只有2个高度毒性和可药性的蛋白质被选中进行进一步的分子对接和动态模拟验证。
两个可药性蛋白质：WP_004097788.1和WP_219541799被认为是潜在的药物靶点。通过靶向WP_004097788.1和WP_219541799，本研究为开发高度选择性抑制剂以对抗多重耐药的克雷伯氏菌Michiganensis提供了路线图。这些蛋白质对细菌复制和嘌呤生物合成至关重要，代表了治疗干预的一个有前途的领域，有可能大幅降低病原体的存活率并在临床环境中限制感染传播。WP_004097788.1在细菌中被认为很重要，因为它是一个来自克雷伯氏菌的复制性DNA解旋酶，是细菌DNA复制的重要酶。没有它，细菌将无法复制其DNA，也无法存活。WP_219571799.1参与嘌呤生物合成途径，具有IMP环化水解酶活性。它还参与嘌呤的回收利用。它是细菌生长的重要酶，是甲氨蝶呤和别嘌呤醇等抗生素的靶点。为了确定其他细菌中是否存在同源蛋白质，我们按照“必需基因预测”部分所述在公共数据库中进行了初步序列相似性搜索。我们在相关细菌物种中鉴定出了同源蛋白质，这表明这些蛋白质在不同细菌菌株中可能具有保守的功能。这种保守性暗示了这些蛋白质在细菌生理学中的潜在基本作用。
本研究不仅强调了WP_004097788.1和WP_219541799在细菌存活中的关键作用，还探讨了它们作为抑制靶点的潜力，为识别或设计能够破坏这些必要功能并有效中和克雷伯氏菌Michiganensis的化合物铺平了道路。已有报告称，解旋酶家族的抑制剂包括吖啶类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类。我们没有识别出任何专门针对WP_004097788.1的已知抑制剂，但对于WP_219571799.1可以使用甲氨蝶呤和别嘌呤醇作为抑制剂。总之，可药性蛋白质“WP_004097788.1和WP_219571799.1”在细菌中具有重要意义，因为它们在必要功能中的潜在作用。据我们所知，截至目前文献中尚未识别出专门针对该蛋白质的抑制剂。
在这项研究中，我们对这些治疗靶标蛋白进行了天然产物的虚拟筛选。分子对接是一种预测小分子与其蛋白质靶标相对取向的方法。这些计算方法提供了关于化合物对其靶标蛋白的结合亲和力和结合活性的信息。在对接过程中，药物银行靶标化合物被用作对照配体。使用glide g-score评估对接结果，并选择了每个蛋白质受体对接的前10个化合物。研究了最高结合亲和力化合物与靶标蛋白的结合模式，以确定其分子相互作用。LTS0037797对WP_004097788.1蛋白表现出最高的结合亲和力，而LTS0037810对WP_219541799蛋白表现出最高的结合亲和力。本研究的计算结果也与全球抗击抗微生物耐药性（AMR）的努力相一致。识别天然产物抑制剂如LTS0037797和LTS0037810不仅增加了潜在药物的储备，还强调了利用天然化合物库应对AMR挑战的重要性。
我们的研究利用分子动力学模拟和MMGBSA分析来研究蛋白质-配体相互作用的动力学、稳定性和结合亲和力。重点放在每种蛋白质具有显著结合亲和力的两个抑制剂上，这些方法优化了我们的对接预测，并协助排名配体候选物以进行未来的优化。分析证实这些化合物在蛋白质结合口袋中保持稳定且有效的抑制剂。因此，所识别的新药物靶点在治疗应用中具有重要意义，特别是在开发新的药物配方以对抗克雷伯氏菌Michiganensis感染方面。未来的体外和体内研究对于验证这些识别出的抑制剂的功效和安全性至关重要。这些研究不仅将增强WP_004097788.1和WP_219541799的治疗潜力，还将加速这些计算结果转化为临床上可行的治疗方案，为克雷伯氏菌Michiganensis带来的危险提供强有力的响应。
结论
认识到开发有效药物靶点的重要性，本研究旨在对人类病原体克雷伯氏菌Michiganensis进行全面的计算分析，使用各种计算工具和方法识别可行的药物靶点。在初始阶段，基于其独特的代谢通路和可药性特征，选择了两个蛋白质作为潜在的药物靶点。第二阶段涉及这些靶标的详细结构分析，这促进了随后的分子对接和模拟研究。这项研究代表了寻找针对克雷伯氏菌Michiganensis感染的新有效治疗方法的重大进展，突显了这些识别出的靶标对开发创新治疗策略的潜力。
(全文结束)
