摘要
人类肠道微生物组受到源自宿主和环境因素的各种选择力量的影响，对健康和疾病有着重大影响。尽管已经证明微生物谱系与各种健康状况在不同分类学水平上存在关联，但将微生物谱系整合为生态上分化种群的统一适应机制的程度仍不清楚。本文表明，基因组范围的选择性清除是一种普遍机制，能够区分微生物组中的细菌。这种机制导致了类似全球疫情的种群结构，跨越地理和种族多样的人类群体。这些清除事件发生时，一种适应使某个克隆能够在其生态位中胜过其他菌株，随后发生重新多样化，并表现为系统发育树上长分支上的紧密相关基因组簇。通过排除重组事件（这些事件会掩盖基因组的克隆谱系），揭示了这种结构。研究确实表明，基因组范围的清除在至少66个来自25个细菌科的分类单元中，在广泛范围的重组率下发生。分化时间的估计表明，清除簇可以在几十年内在全球范围内传播，这一过程贯穿人类历史。清除簇与不同的宿主条件相关——如年龄、结直肠癌、炎症性肠病和2型糖尿病——这表明它们的生态分化。我们的结果揭示了观察到具有差异关联的稳定遗传菌株的进化机制，并为分析微生物种群间的适应提供了理论基础。
正文
普遍认为与我们身体相关的微生物组对我们的健康状况有着深远影响。此类断言的证据通常来自细菌多样性单位与疾病或其他失调状态的相关性。随后，可以使用定植有假设代表已识别细菌群的隔离物的动物模型来测试这些假设。然而，由于与宿主表型的相关性基于操作定义的微生物多样性单位（从rRNA水平到菌株水平的变体），因此很难确定这些单位及其相关的模型隔离物是否准确代表了潜在的适应过程。
最近提出的一种解决此问题的前进路径是定义在生态和遗传上与其姐妹群体分化的人群，因为它们是不同环境选择的产物。这种被称为"反向生态学"的方法有可能更精确地识别与宿主表型相关的遗传单位，因为它经过选择优化以占据特定的生态位空间。取决于选择相对于重组的强度，种群可能通过基因或等位基因在整个种群中扫荡，或者通过基因组范围的选择性清除（GWSS）来优化，即整个基因组随适应性突变一起搭车。理论考虑表明GWSS普遍存在；然而，它们在自然界中发生的证据仍然有限。值得注意的是，来自人类微生物组的隔离物的系统发育树经常表现为"扫帚"形状；即，在意想不到的长分支上扩展的紧密相关菌株（扫帚头）。这种结构是GWSS的标志，当一个适应性突变允许一种菌株在其特定生态位中胜过所有姐妹菌株，随后胜者多样化为紧密相关菌株簇时出现。这些考虑因素使我们提出GWSS是人类微生物组中一种常见的适应机制。
为了验证GWSS创造分化种群的假设，我们认为有必要限制水平基因转移和现有隔离物基因组中潜在的隔离偏差的影响。这是因为这两种效应都可能导致系统发育树上出现长分支。因此，我们首先通过区分基因组的克隆遗传部分和重组部分来识别紧密相关基因组之间的垂直遗传。接下来，我们采用了一个理论模型，该模型估计基因组簇在长分支上出现是由于GWSS的概率。最后，我们将宏基因组映射到这些簇上，以测试中间基因型是否从隔离物集合中缺失。我们还测试了选择的特征和与人类表型的差异关联，作为肠道中不同生态条件的代理。这些分析表明GWSS簇占据不同的生态位空间。此外，许多人类微生物组分类单元经历了GWSS，这些清除可以在几十年的时间范围内在全球范围内传播，并导致疫情般的种群结构。
基因组范围的清除很普遍
GWSS过程在隔离物的系统发育树上创造了特征性的扫帚状结构；即，一个生态位中的基因组多样性被消除，随后重新多样化。然而，自信地识别此类清除簇需要约束重组和隔离偏差的影响。因为同源重组可以掩盖簇并产生长分支，特别是对于紧密相关的基因组，我们首先试图识别基因组对之间的克隆遗传部分。为此，我们基于之前的方法，将基因组对之间的单核苷酸多态性（SNP）分布划分为泊松分布和负二项分布的混合。
通过确定观察到的SNP分布与这两种模型的混合的最佳拟合，我们估计了以下特征：(1) 垂直遗传与重组的基因组比例；(2) 每个部分的分化；以及(3) 基因组对之间的重组率。我们使用一组在单一祖先基因组基础上演化的模拟基因组全面评估了这种方法，同时在广泛的突变和重组率下纳入选择和重组。我们还定义了可以自信地将重组与点突变区分开来的范围，并将物种水平基因组库（SGBs）界定为与MetaPhlAn4数据库中参考基因组的差异小于6%的基因组组。
我们分析了16,864个人类肠道隔离物基因组，这些基因组根据人类参与者进行了去重复，以避免因对同一人重复采样而导致的克隆隔离物重复计数。这种分类产生了176个SGBs，其中包含超过5个基因组，显示出克隆和重组基因组部分的比例广泛变化。这表明SGBs中的多样性通过垂直和水平遗传以不同的方式结构化。
为了测试GWSS的发生，我们首先分析了构成176个SGBs的隔离物基因组。随后，我们使用宏基因组来确认观察到的结构并解释隔离物集合中可能缺失的多样性。我们开发了计算流程"作为基因组清除簇的种群"（PopCoGenomeS）来搜索176个SGBs，寻找从共同祖先垂直遗传并显示GWSS特征的基因组组。
我们使用基于溯祖的模型（5倍规则）来测试是否存在GWSS的支持，该模型比较了基因组簇与其最接近亲缘体之间的多样性。如果簇之间与簇内部的分化距离比率大于5，则识别出的GWSS实际上是由进化漂变（GWSS生成序列簇的最可能替代机制）形成的概率小于1%。通过这种方式，我们确定了377个潜在GWSS簇，其中许多SGBs包含多个簇。
然后，我们询问这种结构是否可以通过不受隔离偏差影响的整个社区宏基因组分析来确认。为此，我们编译了来自74个数据集的1,477个宏基因组，涵盖不同年龄、疾病状态和生物地理区域。我们首先为每个GWSS簇确定了多数规则共识序列，即在基因组中不受重组影响的位置上的多数核苷酸（共识克隆框架）。然后，我们计算了1,477个宏基因组和所有隔离物样本到该共识克隆框架的距离，以确认遵循5倍规则的GWSS簇。
在这一结合隔离物基因组和宏基因组的数据集中，我们确认了66个SGBs中的124个GWSSs。这些SGBs包括46个共生菌、11个病原体和9个经常在发酵和功能性食品中发现的共生菌（益生菌）。虽然大多数SGBs包含单个GWSS簇，但许多包含多个簇。这表明由平均核苷酸同一性操作定义的物种可能由几个进化定义的多样性单元组成，基于下面提供的证据，这些单元表现出差异生态学。我们特别关注共生菌，其中清除的识别不太可能受到疾病爆发或益生菌广泛使用的影响，并确定了跨越17个细菌科的46个SGBs中的77个GWSSs。GWSSs在拟杆菌科中最普遍，并且也存在于大多数其他主要人类肠道细菌科中，如梭菌科、毛螺菌科和肠球菌科。这表明GWSSs是分化人类微生物组中种群的普遍机制。
GWSS簇的地理范围进一步证明了它们的适应性性质。这里我们发现，大多数GWSS簇（77个中的54个）包含来自多个大陆的隔离物或宏基因组，表明它们已在不同人类群体中传播。在这些54个广泛分布的簇中，42个没有表现出空间偏好（Fisher精确检验，P>0.05，用于簇内和簇外样本的地理分布），这表明它们在多样化的人类群体中对相似的选择压力作出响应。值得注意的是，一个拟杆菌uniformis清除簇对土著人群是独特的，并在两个不同大陆的三个群体中共享：喀麦隆的巴卡人和贝蒂人，以及秘鲁的马特塞人。由于巴卡人和马特塞人是地理位置遥远的狩猎采集社区，从未直接接触过彼此，因此同一清除簇在他们之间的传播最好通过不太孤立的群体介导的传播链来解释。这些GWSS簇中其他人类群体的缺失表明两种可能性。首先，这些菌株在其他现代人类中以非常低的丰度存在，但仅在某些传统生活方式中被选择性富集。或者，传播发生在过去，这些菌株自那以后在大多数人中已经灭绝，可能与工业化和城市化相关的生计转变有关。这些关于GWSS簇全球分布的观察促使我们调查清除可能发生的近似时间尺度。这个问题特别有趣，因为快速的全球传播将进一步支持GWSS簇是选择的产物，而不是种群瓶颈和漂变。
清除簇快速传播
通过两种独立的方法来约束清除簇的年龄，我们发现GWSSs在人类历史过程中反复发生。具体来说，我们首先使用先前确定的共生菌和病原菌的分子钟速率（每基因组每年1-10个突变）来估计清除簇的年龄范围为大约几十年到几千年。这些年龄估计与使用第二种独立的分子钟估计方法获得的估计一致。在这种方法中，我们确定了在同一GWSS簇中检测到的宏基因组中积累的突变数量，这些宏基因组来自至少间隔1年采样的个体或成年后一直分开居住的双胞胎。
除了两个例外，从这些基于宏基因组的进化钟估计的清除簇年龄与使用1-10个SNP每基因组每年的固定分子钟估计的年龄在同一数量级上。尽管这些估计存在明显的不确定性，但我们关注的是将清除年龄估计到正确的数量级。这是因为精确速率的估计受到肠道共生菌可用的宏基因组和基于隔离物的突变率的限制。尽管如此，这些估计表明GWSSs在过去几千年中反复发生，簇显示近1000倍的年龄差异。此外，即使在分类学物种（SGB）内，也存在数量级不同的清除簇年龄。
清除簇的年龄为它们传播到地理上遥远的人类群体所需的最短时间提供了上限。因此，我们使用此信息来估计跨大陆传播所需的最短时间。使用每基因组每年5个SNP的中位分子钟，总共26个多大陆清除簇被估计为不到一个世纪（图2a）。此外，在大多数多大陆清除簇（54个中的47个）中，来自不同大陆的样本的遗传距离与来自同一大陆的样本没有显著不同（ANOSIM检验，P>0.1）。这表明在大多数SGBs中，菌株发生了快速和反复的跨大陆转移。值得注意的是，上面提到的跨大陆拟杆菌uniformis清除（对三个土著且据称孤立的人群是独特的）是拟杆菌uniformis中最古老的GWSS，估计年龄约为100-1000年。这为这一簇可能在工业化之前传播的观点提供了支持。最后，共生菌中清除的平均SNP多样性显著大于病原菌（对数转换数据的双尾学生t检验，n=77和34，自由度=63，P=0.018）。因此，共生菌在人类群体中的传播较慢和/或清除簇比传染病原体疫情更古老。尽管如此，我们的数据表明，即使是共生菌GWSS簇也可以在人类寿命内在全球范围内传播，其分布与多样化人类宿主中共享的选择制度一致。
GWSS跨越多种重组率
理论预测GWSS发生在整个基因组随适应性突变一起搭车时。因此，携带适应的基因组在其生态位中传播的相对速率必须比通过重组共享的适应基因或等位基因的速率高得多。这一推理源于高重组率可以通过打破有益突变与其邻近变体之间的连锁来导致基因特异性清除，允许适应性等位基因独立于其基因组背景传播。然而，与这一明确预期相反，我们发现没有确认GWSSs的SGBs具有与包含GWSSs的SGBs相当的重组率（中位数2.4×10^-4对比1.7×10^-4；Wilcoxon秩和检验，n=52和45，P=0.09）。事实上，在共生菌中，GWSSs在重组率变化约400倍的范围内被检测到。例如，布劳蒂亚马西里耶尼西斯（SGB4826）尽管是重组最快的SGBs之一，仍有清除，而同一属中的多个其他SGBs的重组率低3-20倍却没有观察到清除。我们的数据因此表明，选择通常足够强，即使在高重组制度下也能允许GWSSs。
GWSS簇是生态种群
GWSS理论的一个关键预测是清除簇在生态上是分化的。虽然肠道中精细的生态位差异很难约束，但我们提出人类主要的生命周期或生理变化可能导致细菌种群响应的生态条件变化。作为测试案例，我们搜索了GWSS簇与五种在不同人类群体数据集中得到充分代表的疾病表型之间的关联：结直肠癌（CRC）、克罗恩病（CD）、溃疡性结肠炎（UC）、2型糖尿病（T2D）和高龄（>65岁）。
使用宏基因组对标记基因的比对扩展了5倍规则，这种方法能够更有效地扩展到大型数据集。因此，我们能够将GWSS簇的筛选扩展到6,783个宏基因组的集合，这些宏基因组来自29个涵盖各种地理区域的数据集。使用具有前向、逐步变量选择的广义线性模型，我们确定了总共178个与至少一个感兴趣宿主表型显著相关的共生GWSS簇（Benjamini–Hochberg程序，调整P值（Padj）<0.05），其中104个跨越多个数据集且没有显著的地理偏见（每个GWSS中的卡方检验，P>0.05）。
与GWSS簇在相同SGB中可能表现出与不同宿主表型的独特关联的想法一致，簇在相同SGB中可以表现出与不同宿主表型的差异关联。值得注意的是，正面关联通常比负面关联更显著，这表明疾病特异性选择压力可能比与更广泛非疾病状态相关的压力更强。我们确定了14个SGBs，其GWSS簇与多个宿主条件呈正相关，其中11个属于拟杆菌目。这些SGBs通常包含大量清除簇，每个簇的流行率有限，这表明该目中存在精细和频繁的分化。
一个典型例子是拟杆菌uniformis，它表现出与所有五种宿主表型的正相关（图4b），尽管在SGB水平上显示与这些表型没有甚至负相关。它也是具有大量确认清除的SGBs之一（四个GWSS簇），平均清除簇仅包含5±1.8个样本。这表明在同一分类学物种中存在差异选择，并且与具有选择优势的菌株能够快速占据一个生态位（其广度限制了清除簇的范围）的能力一致。
为了探索潜在的功能，这些功能可能导致此类生态位分化，我们使用所有基于隔离物的清除，并询问哪些基因可能对每个GWSS簇是特异性的或处于正向选择中。与GWSS簇中所有基因的总体分布相比，特别富集于单个GWSS簇的基因被归类为移动遗传元件，并具有参与糖类和糖缀合物（如荚膜多糖）合成或修饰的功能，特别是在拟杆菌目中。由于这些结构长期以来已知通过允许病原体逃避特定免疫反应来促进致病性，共生菌可能使用类似机制来适应与健康或疾病相关的离散宿主表型。事实上，拟杆菌thetaiotaomicron中的特定荚膜多糖促进对适应性免疫系统的逃避，而拟杆菌fragilis中的荚膜多糖可以提供对炎症性疾病的保护。此外，拟杆菌fragilis中调节荚膜生物合成的基因已被推断在单个人类宿主中经历适应性进化。总的来说，我们的结果表明，共生菌中的GWSS簇可以表现出与人类表型的高度特异性关联，并且其种群结构可能受到与免疫系统相互作用的影响。
讨论
我们的发现表明，GWSSs是结构化人类中细菌种群的基本力量。此外，我们怀疑它们比我们的结果显示的更为普遍，因为我们的分析受到密切相关的隔离物基因组集合可用性的限制。由于GWSSs创建了生态分化的种群，将它们映射到宏基因组可能作为各种健康状况的准确且易于定义的标记。
在SGBs中，我们确定了与人类表型如CRC、CD、UC、T2D和高龄（>65岁）差异相关的GWSS簇。GWSS簇生态分化的进一步重要推论是，GWSS簇应该适应与至少一部分其他社区成员共存。因此，GWSS簇的识别可能有助于构建细菌共现网络，并可能影响适当的隔离物选择以用作实验模型或合成肠道社区的组装。
我们分析的一个意外结果是，肠道共生菌的GWSS簇似乎具有全球适应性，并以类似于通常归因于病原体的疫情方式传播。然而，共生菌和病原菌传播所涉及的潜在机制可能不同。对于许多病原体，众所周知，新的适应性克隆可以快速传播并导致遗传上高度同质的全球种群。相比之下，我们的数据表明共生菌可能需要几十年才能达到全球分布，这可能是由于较慢的传播链。这种较慢的传播反映在共生菌GWSS簇的更高多样性中，因为它们在地理上扩散时可能会多样化。
菌株，通常被视为宏基因组中可识别的最低多样性单位，已被证明主要从相关个体获取，但菌株在不相关个体之间的共享已在局部和全球范围内观察到。此外，虽然与相关个体之间的共享水平较低，但它仍然显著高于中性模拟下的预期，这表明它是由更广泛的群体遗传过程驱动的，而不是随机扩散。然而，这一现象背后的生态进化机制仍然不清楚，尽管有建议表明宿主适应起着重要作用。在我们提出的模型中，并非所有不相关个体中SGB内的紧密相关菌株都来自同一克隆扩增。然而，一部分可以是GWSS簇的一部分，它们的获取主要反映了它们对微生物组中特定设置的增强适应性。事实上，一旦获取，菌株已被证明可以持续较长时间，平均超过人类寿命的三分之一。因此，我们建议它们的替换也反映了生态适应种群的周转，这也可能作为人类健康变化的哨兵。
【全文结束】